氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈抗白色假絲酵母菌生物被膜協(xié)同作用研究

劉懿萱，葉春林（武警上海市總隊醫(yī)院醫(yī)務處，上海 201103）

氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈抗白色假絲酵母菌生物被膜協(xié)同作用研究

劉懿萱，葉春林＊（武警上海市總隊醫(yī)院醫(yī)務處，上海 201103）

目的 探討氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈抗白色假絲酵母菌生物被膜的協(xié)同作用。方法 利用白色假絲酵母菌標準菌株SC5314，采用生物被膜形成實驗，分為空白對照組、氨基丁酸單用組、卡泊芬凈單用組、氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈組，對比各組生物被膜形成情況。采用XTT還原法測定氨基丁酸、卡泊芬凈單用以及氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈對成熟生物被膜細胞代謝活性的抑制作用。采用YNB培養(yǎng)基菌絲形成實驗，考察氨基丁酸與卡泊芬凈合用是否具有協(xié)同抑制菌絲形成的作用。結果 卡泊芬凈0.1μg·mL－1聯(lián)合氨基丁酸0.1μmol·L－1對白色假絲酵母菌SC5314生物被膜的形成具有顯著的抑制作用。此外，XTT還原法測定氨基丁酸6.25μmol·L－1聯(lián)合卡泊芬凈0.1μg·mL－1時降低被膜細胞代謝活性的效率能夠達到約15%。采用YNB培養(yǎng)基形成菌絲，氨基丁酸6.25μmol·L－1聯(lián)合卡泊芬凈0.1μg·mL－1對白色假絲酵母菌SC5314菌絲形成能力有顯著的抑制作用。結論 氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈表現(xiàn)出顯著的體外協(xié)同抗白色假絲酵母菌標準菌株SC5314生物被膜作用。

白色假絲酵母菌；氨基丁酸；卡泊芬凈；協(xié)同抗生物被膜作用

白色假絲酵母菌（Candida albicans）又稱白色念珠菌，是臨床最常見的條件致病性真菌，近年調(diào)查結果顯示，念珠菌感染在真菌感染中約占73%，而白色假絲酵母菌在其中約占48%［1－2］。白色假絲酵母菌對環(huán)境有很強的適應能力，能夠在應用于人體的生物材料如心臟支架、人工心臟瓣膜、靜脈插管、尿管插管、分流器、人工關節(jié)等惰性物質(zhì)或其他生物表面形成生物被膜（biofilm）［34］。白色假絲酵母菌生物被膜形成生長的一個重要后果是對一些臨床常用抗真菌藥物產(chǎn)生高度耐藥性［5］。

目前，臨床針對生物被膜感染的候選藥物十分有限，常見的抗真菌藥物包括多烯類（如兩性霉素B）、氮唑類（如氟康唑）、棘球白素類（如卡泊芬凈）等。有文獻報道，棘球白素類藥物卡泊芬凈在體外具有抗念珠菌生物被膜活性，其機制可能是通過抑制β－（1，3）－葡聚糖合成酶影響?zhàn)じ交蛴绊懠毎饣|(zhì)合成發(fā)揮抗真菌生物被膜作用［6－7］。然而臨床上真菌耐藥現(xiàn)象越來越普遍，耐藥性已成為臨床抗真菌治療失敗的主要原因［8－9］，而抗真菌藥物聯(lián)合應用可以有效防止耐藥性的出現(xiàn)。氨基丁酸（aminobutyric acid，GABA）是一種天然氨基酸，其具有較廣泛的生物學功能，如降血壓作用、鎮(zhèn)痛作用等［10］，暫未發(fā)現(xiàn)其抗真菌作用。同時有文獻報道［11］，當卡泊芬凈質(zhì)量濃度低于0.25μg·mL－1時，生物膜態(tài)白色假絲酵母菌的增殖活性不能受到完全抑制；當卡泊芬凈質(zhì)量濃度高于0.25μg·mL－1時，全部生物膜態(tài)白色假絲酵母菌的增殖活性幾乎受到完全抑制。本實驗期望通過卡泊芬凈聯(lián)合氨基丁酸用藥使卡泊芬凈在低質(zhì)量濃度時也能發(fā)揮治療效果，并通過降低用藥質(zhì)量濃度而減小藥物的毒性。

本課題組前期研究首次發(fā)現(xiàn)，卡泊芬凈與氨基丁酸合用后對白色假絲酵母菌標準菌株SC5314表現(xiàn)出明顯的協(xié)同關系，然而卡泊芬凈與氨基丁酸聯(lián)合應用對白色假絲酵母菌生物被膜形成的影響目前尚無報道，因此，本研究重點考察了氨基丁酸對卡泊芬凈體外抗白色假絲酵母菌生物被膜形成的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器 THZ－82A臺式恒溫振蕩器（上海躍進醫(yī)療器械廠）；SW－CT－IF型單人雙面超凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）；96孔細胞培養(yǎng)板（丹麥Nunclon公司產(chǎn)品）；12孔細胞培養(yǎng)板（Corning Inc.，Corning，NY）；Infinite M200多功能酶標儀（TECAN，Austria）。

1.2 受試菌株 白色假絲酵母菌SC5314由本院保存，實驗用菌株SC5314于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）劃板活化［12］，于30℃培養(yǎng)24～48h后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 培養(yǎng)基 YNB培養(yǎng)液：YNB無氨基酵母氮源（Sigma公司）6.7g、葡萄糖20g，加去離子水定容至1 000mL，0.45μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，于4℃保存?zhèn)溆?；SDA固體培養(yǎng)基：蛋白胨10g，葡萄糖40g，瓊脂18g，加去離子水900mL溶解，加入2mg·mL－1氯霉素水溶液50mL調(diào)整pH至7.0，定容至1 000mL，高壓滅菌（121℃，15min），于4℃保存?zhèn)溆茫籝EPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加去離子水900mL溶解，定容至1 000mL，高壓滅菌（121℃，15min），于4℃保存?zhèn)溆?；PBS緩沖液（pH 7.2）：氯化鈉8.0g，氯化鉀0.4g，磷酸氫二鈉0.133g，磷酸二氫鉀0.06g，碳酸氫鈉0.35g，加去離子水定容至1 000mL，高壓滅菌（121℃，15min），4℃保存?zhèn)溆?；XTT／menadione溶液：XTT用滅菌的PBS緩沖液配成0.5mg·mL－1的飽和溶液，用0.22μm濾器除菌，menadione用100%丙酮配成10mmol·L－1溶液，XTT、menadione于－80℃保存。實驗時向XTT溶液中加入10mmol·L－1menadione使終濃度至1μmol·L－1。

1.4 試藥 氨基丁酸（GABA）和卡泊芬凈（CAS）均訂購于Sigma公司。氨基丁酸用DMSO（Sigma公司）溶解成0.2mmol·L－1的藥物母液，－20℃儲存?zhèn)溆??？ú捶覂粲肈MSO溶解成2mg·mL－1藥物母液，－20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 生物被膜形成實驗 實驗前，用接種環(huán)從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白色假絲酵母菌單克隆，接種至1mL YEPD培養(yǎng)液中，于30℃、以200r·min－1振蕩培養(yǎng)，使其活化16h，離心，棄上清，用PBS緩沖液洗1次，稀釋相應倍數(shù)后在顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)，以YNB培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至1×106cells·mL－1。靜置1h后，用PBS緩沖液洗2次，加入包含不同濃度氨基丁酸、卡泊芬凈、氨基丁酸合用卡泊芬凈的新鮮YNB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h，并設置空白組。等分1mL溶液至12－well板（Corning Inc.，Corning，NY），37℃孵育過夜，使細胞黏附并包被于孔的表面。

2.2 XTT還原法測定氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈對成熟生物被膜細胞代謝活性的抑制作用［13］實驗前，用接種環(huán)從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白色假絲酵母菌單克隆，接種至1mL YEPD培養(yǎng)液中，于30℃、以200r·min－1振蕩培養(yǎng)，使其活化16h，離心，棄上清，用PBS緩沖液洗1次，稀釋相應倍數(shù)后在顯微鏡下用血細胞計數(shù)板計數(shù)，以YNB培養(yǎng)液（包含不同濃度氨基丁酸、卡泊芬凈、卡泊芬凈合用氨基丁酸組，并設置空白組）調(diào)整菌液濃度至1×106cells·mL－1，等分100μL溶液至96－well板，然后將200μL XTT－menadione（1μmol·L－1）溶液等分于12－well板中，37℃黑暗中培養(yǎng)24h形成成熟被膜。代謝活性使用microtitre plate reader（Multiskan MK3）于492nm測定。實驗重復3次。

2.3 倒置顯微鏡觀察菌絲形成能力［14］實驗前，用接種環(huán)從4℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白色假絲酵母菌單克隆，接種至1mL YEPD培養(yǎng)液中，于30℃、以200r·min－1振蕩培養(yǎng)，使其活化16h，使真菌處于指數(shù)生長期的后期。將菌液取出放入1.5mL EP管中，以5 000r·min－1離心2min，棄上清。PBS溶液洗3次并吹打混勻（勿渦旋），最后離心棄上清。然后用YNB溶液（包含不同濃度氨基丁酸、卡泊芬凈、氨基丁酸合用卡泊芬凈組，并設置空白組）重懸稀釋，調(diào)整濃度為5×105～1×106cells·mL－1，取1mL該菌液接種至12孔板，放置于37℃培養(yǎng)3h后觀察菌絲。

3 實驗結果

3.1 生物被膜形成實驗結果 白色假絲酵母菌SC5314作為研究白色假絲酵母菌耐藥機制、形態(tài)轉(zhuǎn)變以及生物被膜形成的標準菌株。體外實驗以生物被膜形成實驗驗證氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈抗白色假絲酵母菌標準菌株SC5314生物被膜的協(xié)同作用。分為空白組、0.1μg·mL－1卡泊芬凈單用組、0.1μg·mL－1卡泊芬凈與0.01μmol·L－1氨基丁酸合用組、0.1μg·mL－1卡泊芬凈與0.1μmol·L－1氨基丁酸合用組、0.1μg·mL－1卡泊芬凈與1μmol·L－1氨基丁酸合用組、0.1μg·mL－1卡泊芬凈與10μmol·L－1氨基丁酸合用組。實驗結果表明，37℃培養(yǎng)24h，0.1μg·mL－1卡泊芬凈單用對白色假絲酵母菌生物被膜形成沒有明顯的抑制作用；0.1μg·mL－1卡泊芬凈與0.01μmol·L－1氨基丁酸合用后對白色假絲酵母菌生物被膜形成沒有明顯的抑制作用；但是0.1μg·mL－1卡泊芬凈與0.1，1和10μmol·L－1氨基丁酸合用后對白色假絲酵母菌生物被膜形成有明顯的抑制作用。表明0.1μg·mL－1卡泊芬凈聯(lián)合氨基丁酸對白色假絲酵母菌生物被膜形成的抑制作用以0.1μmol·L－1為界限，氨基丁酸濃度≥0.1μmol·L－1時具有明顯的抑制作用。

3.2 氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈對成熟生物被膜細胞代謝活性的抑制作用 本實驗以白色假絲酵母菌SC5314為實驗菌株，將包含不同濃度氨基丁酸、卡泊芬凈、氨基丁酸合用卡泊芬凈的YNB培養(yǎng)基加入到已經(jīng)形成的成熟（24h）白色假絲酵母菌生物被膜中，于37℃靜置培養(yǎng)24h，采用XTT還原法測定生物被膜細胞的代謝活性。結果表明（表1）：單用氨基丁酸1.25μmol·L－1，單用氨基丁酸6.25μmol·L－1和單用卡泊芬凈0.1μg·mL－1時對被膜細胞代謝率的抑制效果相近，約為85%，表明單用氨基丁酸和單用低質(zhì)量濃度卡泊芬凈（0.1μg·mL－1）不能顯著降低被膜細胞的代謝活性；而氨基丁酸1.25μmol·L－1聯(lián)合卡泊芬凈0.1μg·mL－1時對被膜細胞代謝率的抑制效果較單用顯著，約為65%；此外氨基丁酸6.25μmol·L－1聯(lián)合卡泊芬凈0.1μg·mL－1時降低被膜細胞代謝活性的效率能夠達到約15%。表明氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈能夠顯著降低被膜細胞的代謝活性。

表1 氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈對成熟生物被膜細胞代謝活性的抑制作用Tab.1 The inhibition effect for metabolic activity of GABA with caspofungin against Candida albicans

3.3 氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈對白色假絲酵母菌SC5314菌絲形成能力的影響 典型的白色假絲酵母菌生物被膜內(nèi)有大量菌絲樣細胞生長［5］，我們進一步考察氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈對白色假絲酵母菌SC5314菌絲形成能力的影響。用包含不同濃度氨基丁酸、卡泊芬凈、氨基丁酸合用卡泊芬凈的YNB溶液培養(yǎng)3h后，通過倒置顯微鏡觀察SC5314的菌絲形成能力。如圖1所示：在空白組中可以看到，正常生物被膜含有大量假菌絲、真菌絲和酵母態(tài)細胞，構成典型的三維空間結構；單用氨基丁酸6.25μmol·L－1和單用卡泊芬凈0.1μg·mL－1時對白色假絲酵母菌SC5314菌絲形成能力沒有抑制作用；但是氨基丁酸6.25μmol·L－1聯(lián)合卡泊芬凈0.1μg·mL－1處理，可以觀察到黏附細胞從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變幾乎被徹底抑制，僅能形成由芽生孢子組成的少量生物被膜。表明卡泊芬凈0.1μg·mL－1聯(lián)合氨基丁酸6.25μmol·L－1對白色假絲酵母菌SC5314菌絲形成能力有顯著的抑制作用。

圖1 倒置顯微鏡觀察卡泊芬凈聯(lián)合氨基丁酸對白色假絲酵母菌菌絲形成能力的影響注：使用×40目鏡倍數(shù)拍攝圖像，比例尺＝100μm。Fig.1 Phenotypic response to YNB medium at 37℃after 3 hours of GABA with caspofungin against Candida albicansNote：scale＝100μm，40×eyepiece multiples.

4 討論

白色假絲酵母菌生物被膜的形成對真菌感染的治療形成嚴重威脅，導致一些臨床常用抗真菌藥物產(chǎn)生高度耐藥性?？ú捶覂粼隗w外具有很好的抗白色假絲酵母菌生物被膜活性［15］。用體外生物被膜模型評估卡泊芬凈、阿尼芬凈和米卡芬凈的抗生物被膜能力時發(fā)現(xiàn)，卡泊芬凈（2μg·mL－1）與米卡芬凈（5μg·mL－1）可以很好地減少硅樹脂醫(yī)學材料商的真菌生物被膜生長［16］。GABA是一種天然氨基酸，雖然暫時未發(fā)現(xiàn)其抗真菌作用，但是其具有不良反應小、來源廣、價格低廉等優(yōu)勢，使研究開發(fā)其抗真菌藥物尤其是聯(lián)合抗真菌藥物具備良好前景。文獻報道［11］，當卡泊芬凈質(zhì)量濃度低于0.25μg·mL－1時，生物膜態(tài)白色假絲酵母菌的增殖活性不能受到完全抑制；當卡泊芬凈質(zhì)量濃度高于0.25μg·mL－1時，全部生物膜態(tài)白色假絲酵母菌的增殖活性幾乎受到完全抑制。而我們的研究也發(fā)現(xiàn)，卡泊芬凈0.1μg·mL－1對生物被膜態(tài)白色假絲酵母菌無抑制作用。因此，實驗選取卡泊芬凈0.1μg·mL－1作用于白色假絲酵母菌做后續(xù)研究。當卡泊芬凈0.1μg·mL－1聯(lián)合氨基丁酸0.1μmol·mL－1時，對白色假絲酵母菌SC5314生物被膜的形成具有顯著的抑制作用。此外，采用XTT還原法表明氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈能夠顯著降低成熟生物被膜細胞的代謝活性：氨基丁酸6.25μmol·mL－1聯(lián)合卡泊芬凈0.1μg·mL－1時降低被膜細胞代謝活性的效率能夠達到約15%。進一步考察氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈對白色假絲酵母菌SC5314菌絲形成能力的影響，我們發(fā)現(xiàn)氨基丁酸6.25μmol·mL－1聯(lián)合卡泊芬凈0.1μg·mL－1對白色假絲酵母菌SC5314菌絲形成能力有顯著的抑制作用。以上結果提示，氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈表現(xiàn)出顯著的體外協(xié)同抗白色假絲酵母菌標準菌株SC5314生物被膜作用；而氨基丁酸協(xié)同卡泊芬凈在體外抗白色假絲酵母菌生物被膜活性，其機制可能是通過抑制酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變從而抑制菌絲的形成。

本實驗首次發(fā)現(xiàn)，氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈具有顯著的體外協(xié)同抗白色假絲酵母菌標準菌株SC5314生物被膜作用，為臨床用藥提供了新的治療方案，可通過聯(lián)合用藥使抗真菌藥物卡泊芬凈在低質(zhì)量濃度（0.1μg·mL－1）時也能發(fā)揮治療效果，并通過降低用藥質(zhì)量濃度從而降低藥物的毒性。但是有關氨基丁酸協(xié)同卡泊芬凈體外抗白色假絲酵母菌生物被膜的作用機制有待于進一步研究。

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2013年度食品藥品監(jiān)管統(tǒng)計年報發(fā)布

本刊訊：2014年12月23日，國家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了“2013年度食品藥品監(jiān)管統(tǒng)計年報”。有關藥品監(jiān)管的情況如下：

1 藥品注冊情況 2013年全年批準新藥臨床148件，新藥證書4件，批準文號66件，新藥證書及批準文號45件。（其中：按照《藥品注冊管理辦法》中規(guī)定，中藥、天然藥物注冊分類中的1至5類批準生產(chǎn)0個品種，批準臨床0個品種；化學藥品注冊分類中的1.1至1.5類批準生產(chǎn)2個品種，批準臨床82個品種；生物制品注冊分類中的1類批準生產(chǎn)1個品種，批準臨床4個品種。）

2013年全年批準按新藥申請程序申報的臨床申請120件，新藥證書0件，生產(chǎn)6件，新藥證書及生產(chǎn)32件。

2013年全年批準仿制藥臨床申請92件，生產(chǎn)申請176件。

2013年全年批準進口藥品臨床申請251件，批準上市申請17件。

2013年全年總局共批準藥品補充申請2 055件，備案530件。全國各省局共批準藥品補充申請5 385件，備案20 153件。

2013年全年總局批準直接接觸藥品的包裝材料和容器生產(chǎn)申請571件，再注冊申請506件，進口補充申請19件；省局批準國產(chǎn)補充申請140件。

2 藥品生產(chǎn)企業(yè)情況 截至2013年底，全國共有原料藥和制劑生產(chǎn)企業(yè)4 875家。

3 藥品經(jīng)營企業(yè)情況 截至2013年底，全國持有《藥品經(jīng)營許可證》的企業(yè)共有451 129家，其中法人批發(fā)企業(yè)12 849家，非法人批發(fā)企業(yè)2 051家，零售連鎖企業(yè)3 570家，零售連鎖企業(yè)門店158 244家，零售單體藥店274 415家。

4 廣告審批和查處情況 2013年全國共批準藥品廣告30 662件，其中異地備案21 092件。向工商行政管理部門移送違法藥品廣告160 917件；撤銷藥品廣告批準文號共58件。

5 中藥品種保護情況 截至2013年底，共有中藥品種保護證書504個，其中初次申報品種131個，同品種20個，延長保護期353個。

6 查處違法藥品案件情況 2013年全年共收到藥品投訴45 908件，其中立案處理7 325件，結案6 180件。2013年全年共查處藥品案件147 322件，100萬元以上的案件72件；涉及物品總值98 279.9萬元，罰款金額41 247萬元，沒收金額8 817萬元，取締無證經(jīng)營2 495戶，搗毀制假窩點數(shù)608個，停業(yè)整頓2 009戶，吊銷許可證193件，移交司法機關2 337件，刑事處罰508人，進行監(jiān)督檢查2 525 202人次。

7 行政復議、行政訴訟情況 2013年全國共受理對各級食品藥品監(jiān)督管理部門行政復議案件452件，法院受理對各級食品藥品監(jiān)督管理部門行政訴訟案件93件。

Enhanced effect of the combination of aminobutyric acid with caspofungin against biofilm formation of Candida albicans

LIU Yixuan，YE Chunlin＊（Shanghai General Hospital of Armed Police，Shanghai 201103，China）

Objective To investigate the enhanced effect of aminobutyric acid（GABA）combined with caspofungin on biofilm formation of Candida albicans.Methods Standard stains of Candida albicans SC5314were used in this study.The group of caspofungin with GABA comparing with the group of GABA or caspofungin alone were evaluated by observing the prevention of biofilm formation.Candida albicans SC5314were cultured in YNB medium to induce the formation of hyphae and the metabolic activity was determined by XTT reduction assay.Results The group of caspofungin（0.1μg·mL－1）showed no inhibition against biofilm formation of Candida albicans，but caspofungin（0.1μg·mL－1）with GABA（0.1μmol·L－1）showed apparent inhibition a－gainst biofilm formation of Candida albicans.The metabolic activity of caspofungin 0.1μg·mL－1with GABA 6.25μmol·L－1reduced to about 15%.Conclusion The combination of caspogungin with GABA possessed an enhanced effect against the biofilm formation of Candiada albicans SC5314 in vitro.

Candida albicans；aminobutyric acid（GABA）；caspofungin；enhanced effect against biofilm formation

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.015

R965

A

1004－2407（2015）01－0054－05

2014－06－16）

劉懿萱，女，主管藥師＊

葉春林，男，副主任醫(yī)師