土大黃不同提取物對銀屑病小鼠模型的作用

熱比姑麗·伊斯拉木，曼爾丹·尼牙孜，尤力都孜·買買提，斯拉甫·艾白＊（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049）

土大黃不同提取物對銀屑病小鼠模型的作用

熱比姑麗·伊斯拉木1，2，3，曼爾丹·尼牙孜2，3，尤力都孜·買買提2，3，斯拉甫·艾白1，2，3＊（1.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，烏魯木齊 830054；2.新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049；3.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049）

目的 分別探討土大黃醇提物、水提物對銀屑病小鼠模型的作用。方法 采用小鼠鼠尾鱗片表皮模型、鹽酸普萘洛爾致小鼠耳部皮膚銀屑病樣模型，觀測土大黃醇提物（2，4和8g·kg－1）、水提物（2，4和8g·kg－1）灌胃給藥后，小鼠一般狀況、體質(zhì)量、脾臟及胸腺指數(shù)，血清IL－10、IL－17、IL－23水平，尾部及耳部皮膚組織病理學(xué)變化。結(jié)果 土大黃醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）在實(shí)驗(yàn)期間小鼠一般狀況、體質(zhì)量變化無明顯異常（P＞0.05）；土大黃醇提物（2和8g·kg－1）、水提物（4和8g·kg－1）能降低小鼠胸腺指數(shù)（P＜0.05）；土大黃醇提物、水提物各劑量組對小鼠血清IL－10、IL－17、IL－23無明顯影響（P＞0.05）；同時(shí)，土大黃醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）能促進(jìn)小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成，能改善對鹽酸普萘洛爾致小鼠耳部皮膚銀屑病樣組織病理學(xué)變化。結(jié)論 土大黃醇提物、水提物均具有治療實(shí)驗(yàn)性銀屑病的作用。

土大黃；提取物；實(shí)驗(yàn)性銀屑病

新疆維吾爾自治區(qū)民間蓼科酸模屬的多種植物稱為土大黃，習(xí)慣稱為酸模；維吾爾藥物名分別為阿提庫拉克（Atkulak）、歐麻孜（Hummaz）、土日謝（Turux）、塔給庫斯（Tagkusi）；主治濕熱性或血液質(zhì)性疾病，如：熱性肝虛、胃虛納差、惡心嘔吐、嗜食異物，濕性各種咽腫、耳后腫脹、淋巴結(jié)結(jié)核、牛皮癬、頭癬等［1－3］。本文分別探討土大黃醇提物、水提物對實(shí)驗(yàn)性銀屑病小鼠模型的作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TGL－5－A低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；Anthos 2010酶標(biāo)儀、Anthos IWO洗板機(jī)（鄭州安圖實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DM2500生物顯微鏡（德國萊卡公司）；RM2235切片機(jī)（德國萊卡公司）；KD－BM生物組織自動(dòng)包埋機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；KD－TS3D生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；KZPG－1A攤片烤片機(jī)（天津天利航空機(jī)電有限公司）。

1.2 試藥 土大黃，由新疆華安中藥飲片有限責(zé)任公司（GSP認(rèn)證）提供，批號121101；由新疆大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院努爾巴依·阿布都沙力克教授鑒定為酸模，也就是民間命名為土大黃。土大黃醇提物（岀膏率為17.47%），土大黃水提物（岀膏率為27.39%），由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院制劑室（GMP認(rèn)證）按常規(guī)提取方法制備。甲氨蝶呤片（MTX），由上海信誼藥廠有限公司提供，國藥準(zhǔn)字H31020644，批號：20130403。鹽酸普萘洛爾片（心得安）常州康普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H32021276，批號：1203004。小鼠白介素－10（IL－10），國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2009第3400951號；小鼠白介素－17（IL－17），國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2012第3401164號；小鼠白介素－23（IL－23）試劑盒，國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2012第3401163；批號201310，由烏魯木齊西域醫(yī)鳴商貿(mào)有限公司提供。

1.3 動(dòng)物 健康昆明小鼠，200只，雌雄各半，SPF級，體質(zhì)量18～22g，由新疆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證：SCXK－LAC2013－7－24。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（新）2011－0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（新）2011－0006。

2 方法

2.1 對小鼠鼠尾鱗片表皮模型的作用 因小鼠尾部表皮天然缺少顆粒層細(xì)胞，類似銀屑病表皮角化不全病理改變，因而可作為銀屑病角化異常的傳統(tǒng)天然模型［45］。取90只小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2d，合格后，小鼠雌雄分別按體質(zhì)量隨機(jī)分為8組，即溶媒對照組、陽性對照藥甲氨蝶呤組（1.5mg·kg－1）、土大黃醇提物組（2，4和8g·kg－1）、土大黃水提物組（2，4和8g·kg－1），每組10只，雌雄各半。以0.02mL·g－1，1次·d－1，灌胃給予相應(yīng)藥物連續(xù)20d。給藥第21d脫頸法處死小鼠，取鼠尾距離根部3cm皮膚標(biāo)本，用150mL·L－1甲醛固定、脫水、石蠟包埋并HE染色后在光鏡下觀察。

2.2 對鹽酸普萘洛爾致小鼠耳部皮膚銀屑病樣模型的作用 取110只小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)2d，合格后，小鼠雌雄分別按體質(zhì)量隨機(jī)分為9組，即溶媒對照組、模型組、陽性對照藥甲氨蝶呤組（1.5mg·kg－1）、土大黃醇提物組（2，4和8g·kg－1）、土大黃水提物組（2，4和8g·kg－1），每組10只，雌雄各半。除溶媒對照組外，其余各組用50g·L－1心得安乳劑［6］（取鹽酸普萘洛爾5g用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶解，加入月桂氮卓酮作為透皮吸收促進(jìn)劑，加入聚乙烯毗咯烷酮5g為成膜材料，再加體積分?jǐn)?shù)50%乙醇至100mL，即得），均勻涂抹于小鼠雙耳背部皮膚，每耳涂抹0.1mL，早晚各1次，連續(xù)涂抹20d，以小鼠耳部角質(zhì)形成細(xì)胞過度增生從而出現(xiàn)角化過度、角化不全等癥狀為造模成功（詳見參考文獻(xiàn)［6］，此模型在我們實(shí)驗(yàn)室小鼠造模已成功、成熟）。造模第21d開始，除模型組小鼠涂抹造模劑外，其余各給藥組小鼠上午涂抹造模劑，下午灌胃給予相應(yīng)藥物，以0.02 mL·g－1，1日1次，連續(xù)20d。給藥第21d，末次給藥2h后，摘眼球法取血，隨后取脾臟、胸腺及雙側(cè)耳廓。先稱脾臟、胸腺，后與右側(cè)耳廓一起迅速放入低溫冰箱（－80℃），待測相關(guān)指標(biāo)。左側(cè)耳廓皮膚標(biāo)本，用150mL·L－1甲醛固定、脫水、石蠟包埋、HE染色，在光鏡下觀察。分離血清，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測小鼠血清IL－17、IL－23、IL－10水平，操作步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 統(tǒng)計(jì)處理方法 用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般情況 與溶媒對照組比較，甲氨蝶呤組、土大黃醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間，行為活動(dòng)、皮毛、糞便、飲食等未見異常。

3.2 體質(zhì)量 與溶媒對照組比較，甲氨蝶呤組、土大黃醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1和表2。

表1 造模期間小鼠體質(zhì)量變化情況Tab.1 Body weight changes of mice during the modeling±s，n＝10）

表1 造模期間小鼠體質(zhì)量變化情況Tab.1 Body weight changes of mice during the modeling±s，n＝10）

組別 劑量／g·kg－1造模第1天體質(zhì)量／g造模第7天體質(zhì)量／g造模第14天體質(zhì)量／g造模第21天體質(zhì)量／g溶媒對照組 － 23.55±1.59 28.19±1.33 34.43±1.84 38.57±2.34模型組 － 23.70±2.67 27.30±1.53 32.18±1.62 36.23±2.93甲氨蝶呤組 0.001 5 24.02±1.87 27.63±1.95 32.65±1.87 36.85±2.34醇提物組低劑量 2 22.19±1.75 26.27±2.13 31.32±3.48 35.33±5.19中劑量 4 23.09±1.62 27.51±1.56 32.77±3.37 36.51±3.73高劑量 8 21.83±1.66 25.22±2.39 29.79±4.81 34.07±5.68水提物組低劑量 2 22.47±1.24 25.70±1.52 29.93±3.35 34.48±5.07中劑量 4 21.81±1.41 25.74±2.38 29.89±3.25 33.73±4.20高劑量 8 22.74±2.58 26.63±1.93 31.69±1.82 36.43±2.50

表2 邊造模、邊給藥期間小鼠體質(zhì)量變化情況Tab.2 Body weight changes of mice during the modeling and ig administration （±s，n＝10）

表2 邊造模、邊給藥期間小鼠體質(zhì)量變化情況Tab.2 Body weight changes of mice during the modeling and ig administration （±s，n＝10）

注：與溶媒對照組比較P＞0.05

組別 劑量／g·kg－1給藥第1天體質(zhì)量／g給藥第7天體質(zhì)量／g給藥第14天體質(zhì)量／g給藥第21天體質(zhì)量／g溶媒對照組 － 38.57±2.34 41.41±3.42 44.05±3.09 43.71±3.88模型組 － 36.23±2.93 38.25±4.19 40.18±4.94 39.89±5.52甲氨蝶呤組 0.001 5 36.85±2.34 38.33±3.60 40.09±3.82 40.00±4.70醇提物組低劑量 2 35.33±5.19 35.39±6.25 36.78±5.46 35.82±5.87中劑量 4 36.51±3.73 36.05±3.29 36.37±3.78 36.51±4.46高劑量 8 34.07±5.68 32.99±7.09 33.97±7.16 33.80±7.19水提物組低劑量 2 34.48±5.07 35.55±6.46 36.95±7.11 36.88±7.58中劑量 4 33.73±4.20 33.82±4.50 35.09±5.11 34.82±5.64高劑量 8 36.43±2.50 36.04±3.80 36.53±3.73 36.03±4.21

3.3 胸腺、脾臟指數(shù) 與溶媒對照組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)升高（P＜0.05）；模型組脾臟指數(shù)略升高（P＞0.05）。與模型組比較，甲氨蝶呤組、土大黃醇提物組（2和8g·kg－1）、水提物組（4和8g·kg－1）能降低小鼠胸腺指數(shù)（P＜0.05）；對小鼠脾臟指數(shù)的影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)Tab.3 Thymus and spleen index of mice ±s，n＝10）

表3 小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)Tab.3 Thymus and spleen index of mice ±s，n＝10）

注：與溶媒對照組比較＊P＜0.05；與模型組比較▲P＜0.05

組別 劑量／g·kg－1胸腺指數(shù)／mg·g－1脾臟指數(shù)／mg·g－1溶媒對照組 － 2.185±0.64 4.45±0.75模型組 － 2.881±0.76＊ 4.76±0.69甲氨蝶呤組 0.001 5 2.037±0.43▲ 4.27±1.27醇提物組低劑量 2 2.100±0.74▲ 4.02±2.12中劑量 4 2.335±0.80 4.23±0.68高劑量 8 2.084±0.56▲ 4.13±0.62水提物組低劑量 2 2.13±1.29 4.02±0.82中劑量 4 2.06±0.72▲ 4.10±0.80高劑量 8 2.11±0.22▲3.60±0.83

3.4 小鼠血清IL－17、IL－23、IL－10水平 與溶媒對照組比較，模型組小鼠血清IL－10略降低，IL－17、IL－23略升高（P＞0.05）。與模型組比較，甲氨蝶呤組、醇提物、水提物（2，4和8g·kg－1）對IL－10、IL－17、IL－23無明顯影響（P＞0.05）。見表4。

3.5 小鼠皮膚組織病理學(xué)變化

3.5.1 尾部皮膚組織病理學(xué)變化 溶媒對照組，無顆粒細(xì)胞層。即小鼠尾部皮膚組織天然缺乏顆粒細(xì)胞層［4－5］。與溶媒對照組比較，陽性對照藥甲氨蝶呤組，個(gè)別區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)1～2層顆粒細(xì)胞層，但細(xì)胞內(nèi)顆粒不明顯。土大黃醇提、水提物組（2，4和8g·kg－1），部分區(qū)域內(nèi)均出現(xiàn)1層顆粒細(xì)胞層，且細(xì)胞內(nèi)顆粒較明顯；但各劑量間無明顯差異。見圖1。

表4 小鼠血清IL－10、IL－17、IL－23水平Tab.4 Serum IL－10，IL－17and IL－23level in mice±s，n＝10）

表4 小鼠血清IL－10、IL－17、IL－23水平Tab.4 Serum IL－10，IL－17and IL－23level in mice±s，n＝10）

注：與溶媒對照組比較P＞0.05；與模型組比較P＞0.05

組別 劑量／g·kg－1IL－10／pg·mL－1IL－17／pg·mL－1IL－23／ng·L－1溶媒對照組 － 61.66±6.64 5.18±0.45 5.06±0.61模型組 － 56.41±3.16 5.47±0.71 5.28±0.33甲氨蝶呤組0.001 5 59.24±4.65 5.17±0.36 4.88±0.36醇提物組低劑量 2 58.84±4.22 5.54±0.19 5.48±0.25中劑量 4 58.47±3.69 5.09±0.44 4.90±0.46高劑量 8 56.95±6.25 5.07±0.40 5.03±0.53水提物組低劑量 2 50.64±4.53 5.49±0.71 5.19±1.33中劑量 4 57.58±4.78 5.62±0.39 4.43±0.33高劑量8 49.71±5.70 5.34±0.65 4.17±0.31

3.5.2 耳朵皮膚組織病理學(xué)變化 溶媒對照組，角質(zhì)層為不全角化，上皮變薄。有顆粒細(xì)胞層，但顆粒不明顯。真皮內(nèi)無炎細(xì)胞浸潤。皮脂腺、毛囊結(jié)構(gòu)清晰。與溶媒對照組比較，模型組角質(zhì)層增厚，角質(zhì)層內(nèi)有角栓和微小膿腫形成。有顆粒細(xì)胞層，且顆粒明顯。棘層增厚。真皮內(nèi)血管擴(kuò)張充血，大量炎細(xì)胞浸潤［7－9］。

與模型組比較，甲氨蝶呤組，角質(zhì)層變薄、均勻，角質(zhì)層內(nèi)角栓和微小膿腫明顯減少。有1～2層顆粒細(xì)胞層，且顆粒明顯。棘層變薄3～4層。真皮內(nèi)炎癥明顯減輕。土大黃醇提物、水提物組（2，4和8g·kg－1）能使角質(zhì)層漸變薄，角質(zhì)層內(nèi)微小膿腫逐漸減少；有1～2層顆粒細(xì)胞層，且細(xì)胞內(nèi)顆粒明顯；棘細(xì)胞層變??；真皮層內(nèi)炎細(xì)胞逐漸減少；但各劑量間無明顯差異。見圖2。

圖1 鼠尾鱗片表皮模型小鼠尾部皮膚的組織病理變化HE×40；A.溶媒對照組；B.甲氨蝶呤組；C.醇提物組；D.水提物組Fig.1 Histopathological changes of the mouse tail skinHE×40；A.solvent control group；B.MTX group；C.alcohol extract group；D.aqueous extract group

圖2 銀屑病樣模型小鼠耳朵皮膚的組織病理變化HE×40；A.溶媒對照組；B.模型組；C.甲氨蝶呤組；D.醇提物組；E.水提物組Fig.2 Histopathological changes of the skin of mouse earsHE×40；A.solvent control group；B.model group；C.MTX group；D.alcohol extract group；E.aqueous extract group

3 討論

銀屑病［10］在世界各地不同人群中的患病率有明顯差異，歐美報(bào)告的患病率約1%～3%，1984年我國銀屑病的患病率為0.123%，2010年流行病學(xué)調(diào)查顯示患病率為0.47%，男女分布相近，提示我國銀屑病的患病率有升高趨勢。銀屑病是一種多基因遺傳背景下的免疫性疾病，研究表明［11］，銀屑病皮損中浸潤的T細(xì)胞是銀屑病發(fā)病中主要的效應(yīng)細(xì)胞，T細(xì)胞是維持銀屑病疾病活動(dòng)性的中心環(huán)節(jié)，與皮損的發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)存在密切相關(guān)。銀屑病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵是T細(xì)胞過度活化與增生，由活化的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子刺激角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。

近年來，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞失衡與銀屑病的關(guān)系日益被重視［12－13］。Th17細(xì)胞是一種輔助性T細(xì)胞，具有獨(dú)立的分化途徑。IL－17是Th17細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，主要生物學(xué)功能是促進(jìn)炎性反應(yīng)，可受到真皮樹突狀細(xì)胞分泌的IL－23調(diào)節(jié)。Treg細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T細(xì)胞）是一組具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群。

IL－10是Treg細(xì)胞分泌的一類重要的抑制性細(xì)胞因子，具有強(qiáng)大的抗炎作用，能有效抑制抗原提呈細(xì)胞等，在銀屑病中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，Th17和Treg細(xì)胞可能在功能上相互拮抗，Th17細(xì)胞誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生，而Treg細(xì)胞能夠控制免疫應(yīng)答的強(qiáng)度、減輕機(jī)體對組織的損傷，二者相互拮抗，共同維持免疫狀態(tài)的相對穩(wěn)定。

土大黃的植物來源較多，中國大部分省區(qū)均有分布，藥用資源豐富，在民間廣泛使用。近幾年，我們對新疆維吾爾自治區(qū)民間用藥調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土大黃用于治療銀屑病等各種皮膚病，并取得了一定的臨床效果。本文分別探討土大黃醇提物、水提物對實(shí)驗(yàn)性銀屑病小鼠模型的作用，從而探索民間用藥的科學(xué)含義。結(jié)果表明，土大黃醇提物、水提物對小鼠無明顯毒副作用；此模型中，Th17和Treg細(xì)胞失衡可能不明顯；但組織病理學(xué)結(jié)果顯示，土大黃醇提物、水提物均可促進(jìn)小鼠尾部鱗片表皮顆粒層形成，改善對鹽酸普萘洛爾致小鼠耳部皮膚銀屑病樣組織病理學(xué)變化。因此，我們認(rèn)為，新疆維吾爾自治區(qū)民間土大黃用于治療銀屑病有一定的意義，有待于深入研究。

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Effect of different extracts of RumexacetosaL.on the mouse psoriasis model

Rabigul ISLAM1，2，3，Mardan NIYAZ2，3，Yultuz MAMAT2，3，Sirapil ABAY1，2，3＊（Department of Pharmacology，Basic Medical College of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，China；2.Laboratory of Traditional Uyghur Medicine Prescription of Xinjiang，Urumqi 830049，China；3.Institute of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 830049，China）

Objective To observe the alcoholic and aqueous extracts of Rumex acetosa L.on the mouse model of psoriasis.Methods Healthy Kunming mice were used in this study.The mouse model of psoriasis was established by applying 5%propranol hydrochloride emulsion to the mouse ear.The tail and ear skin histology were examined by using HE staining，and the serum levels of IL－10，IL－17and IL－23were measured with ELISA.Results In the experiment，2，4，8g·kg－1alcoholic and aqueous extracts did not show obvious abnormalities in general conditions and body weights（P＞0.05）.2，8g·kg－1alcoholic extracts and 4，8g·kg－1aqueous extract decreased thymus index（P＜0.05）.2，4，8g·kg－1alcoholic and aqueous extracts did not show significant changes of the serum levels of IL－10，IL－17，and IL－23（P＞0.05）.and also 2，4，8g·kg－1alcoholic and aqueous extracts promoted the formation of epidermis granular layer in the mouse tail skin and improved the histological changes of the ear skin.Conclusion Alcoholic and aqueous extracts of Rumex acetosa L.have therapeutic effects on the experimental mouse model of psoriasis.

Rumex acetosa L.；extracts；experimental psoriasis

10.3969／j.issn.1004－2407.2015.01.013

R965

A

1004－2407（2015）01－0047－05

2014－07－02）

新疆維吾爾自治區(qū)公益性科研院所項(xiàng)目（編號：KY201302）

熱比姑麗·伊斯拉木，女，副研究員，博士研究生＊

斯拉甫·艾白，男，教授，博士生導(dǎo)師