UPLC-MS 法測定羊耳菊中6 種成分的含量

侯靖宇，陸 苑，3，潘 潔，蘭燕宇，李 春，3，陳思穎，3，王永林，3*

1 貴陽醫(yī)學(xué)院 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實驗室;2 貴陽醫(yī)學(xué)院 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心;3 貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴陽 550004

羊耳菊又名白牛膽、山白芷，為菊科旋覆花屬植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的新鮮或干燥全草，以根或全草入藥，具有疏風(fēng)散熱、解毒消腫之功效，收載于《中華本草·苗藥卷》、2003 版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［1，2］，為貴州苗族常用藥材，民間常用于治療感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、風(fēng)濕疼痛、癰瘡疔毒等［3］。近年來對羊耳菊的化學(xué)成分研究報道較多，其主要成分有酚類、倍半萜類、有機(jī)酸類、黃酮類和揮發(fā)油類等［4］，但目前關(guān)于羊耳菊的質(zhì)量研究卻較少?！顿F州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中尚未收載羊耳菊的含量測定項目，經(jīng)文獻(xiàn)查閱，也僅有羊耳菊單一成分及總黃酮測定［5，6］，不能全面反映其內(nèi)在質(zhì)量。本課題組前期研究及相關(guān)文獻(xiàn)報道表明［4］，羊耳菊中東莨菪苷、1，3-O-二咖啡?；鼘幩?、木犀草苷、3，4-O-二咖啡?；鼘幩?、3，5-O-二咖啡?；鼘幩岷?，5-O-二咖啡?；鼘幩岬?，具有抗炎、抗菌、抗氧化及抗病毒等藥理作用［7-13］。UPLC-MS/MS 專屬性強(qiáng)，靈敏度高，快速準(zhǔn)確，越來越多地應(yīng)用于中藥材質(zhì)量控制等各方面的研究中［14，15］，因此研究者應(yīng)用UPLCMS/MS，以葛根素為內(nèi)標(biāo)，建立羊耳菊中6 個成分的含量測定方法，為有效控制羊耳菊的內(nèi)在質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ACQUITY 系統(tǒng)超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括二元梯度泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、三重四級桿質(zhì)量分析器和Masslynx4.1 質(zhì)譜工作站(美國Waters 公司)。

1.2 材料

東莨菪苷對照品(批號13061442，純度≥98%)由上海同田生物技術(shù)有限公司提供;1，3-O-二咖啡?；鼘幩帷?，4-O-二咖啡酰基奎寧酸、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?、4，5-二-O-咖啡酰基奎寧酸對照品(均由中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心提供，批號分別為1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215，純度≥98%);葛根素和木犀草苷對照品(均由中國食品藥品檢定研究院提供，批號分別為111-090623、111720-200602，純度≥98%);甲醇(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)、乙腈(德國Merck 公司)、甲酸(美國TEDIA 有限公司)為色譜純;其他試劑均為分析純，水為超純水。羊耳菊藥材:共6 批樣品，來源于貴州高坡、龍里及羅甸等地，由貴陽醫(yī)學(xué)院龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液

分別精密稱取東莨菪苷等6 種對照品，各置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度處，搖勻。得東莨菪苷(0.504 mg/mL)、1，3-O-二咖啡?；鼘幩?1.037 mg/mL)、木犀草苷(0.856 mg/mL)、3，4-O-二咖啡?；鼘幩?1.007 mg/mL)、3，5-O-二咖啡?；鼘幩?0.502 mg/mL)、4，5-O-二咖啡酰基奎寧酸(1.073 mg/mL)的儲備液。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液

精密稱取葛根素(1.148 mg)，用甲醇定容至10 mL。獲得葛根素(0.1148 mg/mL)的儲備液。取內(nèi)標(biāo)儲備液適量至10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成20 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液，置冰箱(-20 ℃)保存，備用。

2.1.3 供試品溶液

取羊耳菊細(xì)粉約1.0000 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入25%乙醇25 mL，稱定重量(精確至0.01 g)，加熱回流提取2 h，放冷，再稱定重量，用提取液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密吸取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿，揮干溶劑;殘余物轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)柱，保護(hù)柱:Waters Van Guard BEH C18(2.1 mm×5 mm，1.7 μm);柱溫:45 ℃;流速:0.35 mL/min;進(jìn)樣體積為1 μL;流動相:0.1% 甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫，洗脫程序如下:0～1.0 min，5%～15%(A);1.0～3.8 min，15%～18%(A);3.8～4.0 min，18%～90%(A);4.0～5.0 min，90%～5%(A)。

2.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源(ESI)，毛細(xì)管電離電壓3 kV，離子源溫度120 ℃;去溶劑氣N2，流速650 L/h，去溶劑氣溫度350 ℃，離子源溫度120 ℃;碰撞氣Ar，流速0.16 mL/min。掃描方式為多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)，監(jiān)測離子見表1。

表1 質(zhì)譜條件Table 1 MRM conditions for the 6 compounds

2.4 專屬性試驗

精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液適量并加入內(nèi)標(biāo)(葛根素)溶液，15000 rpm，離心5 min 取上清液1 μL 進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。由圖可見，被測定成分間分離良好，未有雜質(zhì)干擾，比較供試品溶液和對照品的母離子、子離子質(zhì)譜圖，兩者一致，表明本法專屬性良好。

圖1 混合對照品溶液(A)和供試品溶液(B)的UPLC-MRM-MS 圖譜Fig.1 MRM total ion chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.5 線性試驗

精密吸取“2.4”項下制備的混合對照品溶液適量，依次稀釋，制得6 個濃度的系列濃度線性工作液，分別進(jìn)樣測定。以對照品濃度(c)為橫坐標(biāo)X，色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(A/Ai)為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程見表3。

表2 6 種成分的線性關(guān)系Table 2 Linear relationships of 6 investigated compounds

2.6 重復(fù)性試驗

取同批次羊耳菊藥材，按“2.1”項下方法平行制備6 份供試品溶液，處理后分別進(jìn)樣測定，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算得1～6 平均含量分別為0.211、2.083、0.036、2.573、0.087 和0.233 mg/g，RSD 分別為5.27%、4.24%、3.16%、1.51%、1.53%和2.96%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 精密度試驗

取與重復(fù)性一致的同一批號的供試品溶液，連續(xù)測定3 d，每天進(jìn)樣6 次，依據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算含量，結(jié)果1～6 的日內(nèi)及日間精密度(n=6)RSD 分別為1.02%～3.31%和1.35%～3.11%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，分別處理后于0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣分析，1～6 含量的RSD 分別為1.94%、1.54%、3.49%、1.87%、2.83%，5.79%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取6 份已知含量的羊耳菊樣品適量，平均分為3 組，分別精密加入0.5、1.0、2.0 mL 混合對照品溶液(1～6 濃度分別為0.042、0.130、0.063、0.210、0.126、0.134 mg/mL)，制成低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按上述條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果表3。

表3 回收率實驗結(jié)果(%，n=3)Table 3 Results of recovery(%，n=3)

2.10 樣品測定

按“2.1.3”項下方法制備6 批樣品的供試品溶液，處理后分別進(jìn)樣測定，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法計算樣品中各成分的含量，結(jié)果見表4。

表4 6 批樣品中6 個成分的含量(mg/g，n=3)Table 4 Content determination results of 6 compounds from six batches of I.cappa sample(mg/g，n=3)

3 討論與結(jié)論

UPLC 使用1.7 μm 顆粒度的色譜柱填料，能顯著提高分離的效率，UPLC-MS/MS 法在不影響分離效果的情況下大大提高了樣品中各成分的分析速度。本研究首次建立了羊耳菊藥材的多指標(biāo)成分含量測定方法，且采用UPLC-MS/MS 法，在6 min 內(nèi)即可同時準(zhǔn)確測定羊耳菊中6 個成分的含量，為羊耳菊的質(zhì)量控制提供了一種快速靈敏、穩(wěn)定可靠的新方法。

實驗中考察了以甲醇、無水乙醇、25% 乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和水為提取溶劑，分別用索氏提取、回流提取和超聲處理，以及不同時間對羊耳菊進(jìn)行提取，對測定結(jié)果綜合分析后，最后采用25%乙醇加熱回流提取2 h，6 種成分的提取效率較好。

通過貴州不同產(chǎn)地的6 批羊耳菊藥材含量測定結(jié)果可以看出，羊耳菊中6 種成分的含量存在明顯差異，其中貴州龍里產(chǎn)的藥材含量較高，說明生態(tài)環(huán)境、采收時間和儲存條件等可能對含量產(chǎn)生影響。上述結(jié)果提示，為保證羊耳菊相關(guān)制劑批次間質(zhì)量的一致性，應(yīng)加強(qiáng)羊耳菊的質(zhì)量控制，必要時固定藥材的來源。

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