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    補(bǔ)腎利濕法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清hs-CRP和Dickkopf-1的影響

    2015-01-10 06:55:06姜德友袁潁超劉春紅韓潔茹
    江蘇中醫(yī)藥 2015年7期
    關(guān)鍵詞:痛風(fēng)性滑膜痛風(fēng)

    姜德友 袁潁超 劉春紅 謝 穎 韓潔茹 張 淼 馮 濤 陳 飛

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱150040)

    補(bǔ)腎利濕法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清hs-CRP和Dickkopf-1的影響

    姜德友 袁潁超 劉春紅 謝 穎 韓潔茹 張 淼 馮 濤 陳 飛

    (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江哈爾濱150040)

    目的:觀察補(bǔ)腎利濕法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)和Dickkopf-1(DKK-1)表達(dá)水平的影響,探討補(bǔ)腎利濕法防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的機(jī)理。方法:將84只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組及補(bǔ)腎利濕低、中、高劑量組,每組12只。空白組與模型組灌胃生理鹽水,中藥對(duì)照組和西藥對(duì)照組分別灌胃痛風(fēng)舒片溶液和秋水仙堿溶液,補(bǔ)腎利濕低、中、高劑量組分別灌胃18.7、37.4、74.8mL/kg補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方,每日1次,連續(xù)7d。隨后除空白組外,其余各組大鼠采用尿酸鈉和氧嗪酸鉀誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。造模4h后眼眶取血,分離血清,應(yīng)用ELISA法,檢測各組大鼠血清中hs-CRP和DKK-1的含量。結(jié)果:模型組大鼠血清hs-CRP和DKK-1均明顯高于空白組(P<0.01)。各給藥組大鼠血清hs-CRP含量均明顯低于模型組(P<0.01),其中以西藥對(duì)照組和補(bǔ)腎利濕中劑量組效果最為明顯。各給藥組大鼠血清DKK-1含量與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論:補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方可降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清hs-CRP水平,對(duì)防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有一定作用;對(duì)降低DKK-1效果不明顯,可能與急性期血清中DKK-1表達(dá)特點(diǎn)有關(guān),需要作進(jìn)一步研究。

    急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎 補(bǔ)腎利濕 中藥復(fù)方 hs-CRP DKK-1 病理學(xué) SD大鼠

    痛風(fēng)(gouty arthritis,GA)是嘌呤代謝紊亂及/或尿酸排泄減少所引起的一種代謝性疾病。臨床表現(xiàn)為高尿酸血癥和尿酸鹽結(jié)晶沉積所致的特征性急、慢性關(guān)節(jié)炎,病程日久可引起泌尿系結(jié)石或痛風(fēng)性腎病,導(dǎo)致腎功能不全,嚴(yán)重影響患者健康狀況和生存質(zhì)量[1]。急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis)是痛風(fēng)比較典型的表現(xiàn)形式。目前臨床仍以西藥為主來控制急性發(fā)作期的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎,如促尿酸排泄劑、抑制尿酸生成劑、秋水仙堿、激素等。此類藥物雖作用迅速,但副作用多、中毒率高,易引發(fā)腎功能損害、皮膚過敏甚至毒性上皮壞死等,因此眾多中醫(yī)學(xué)者開始重視研究開發(fā)防治痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎安全有效的中藥制劑。本研究采用尿酸鈉聯(lián)合氧嗪酸鉀誘導(dǎo)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型,分別用秋水仙堿、痛風(fēng)舒片和補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方進(jìn)行預(yù)處理,觀察各組大鼠血清超敏 C反應(yīng)蛋白 (hs-CRP)和Dickkopf-1(DKK-1)表達(dá)水平,探討補(bǔ)腎利濕法防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性SD大鼠84只,體重(200±20)g,黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物許可證號(hào):[SCXK(黑)2008004]。實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》[2]。

    1.2 藥物與試劑 補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方由熟地黃20g、山藥15g、山茱萸20g、澤瀉15g、懷牛膝15g、萆薢20g、土茯苓30g組成[3],方中藥材從黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房一次性選購。秋水仙堿購自西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào)140807;痛風(fēng)舒片(主要成分:大黃、車前子、澤瀉、川牛膝、防己)購自湖北綠金子藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號(hào)140301;微量尿酸鈉結(jié)晶(批號(hào)CAS1198-77-2)、氧嗪酸鉀(批號(hào)CAS2207-75-2)均購自美國Sigma公司。hs-CRP試劑盒購于北京誠森生物技術(shù)有限公司,批號(hào)201501。

    1.3 儀器 多用途高速臺(tái)式離心機(jī) (貝克曼X-22R),電子分析天平(梅特勒公司AL204),酶標(biāo)儀(Gene Company synergy H7),恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒,型號(hào):DHG-9140A)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動(dòng)物分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為7組,每組12只,分別為空白組、模型組、中藥對(duì)照組、西藥對(duì)照組和補(bǔ)腎利濕低、中、高劑量組。

    2.2 藥物溶液制備 (1)尿酸鈉溶液的制備:將1g微晶尿酸鈉結(jié)晶加9mL無菌生理鹽水,加熱攪拌,定容成10mL尿酸鈉溶液。(2)氧嗪酸鉀溶液的制備:將3g氧嗪酸鉀晶體溶解于97mL生理鹽水中,加熱攪拌,配置成3%氧酸鉀溶液。(3)痛風(fēng)舒片溶液的制備:將痛風(fēng)舒片研成細(xì)末,配置成0.029g/mL的痛風(fēng)舒片溶液,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?)秋水仙堿混懸液的制備:將秋水仙堿片研成細(xì)末,配置成0.028mg/mL的秋水仙堿混懸液,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?)補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方溶液的制備:將熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、懷牛膝、萆薢、土茯苓入砂鍋中加4倍體積的水浸泡30min,煎2次,30min/次,去渣,兩煎混合,G4濾器過濾,于60℃水浴中加熱,分別將原藥液1.87mL、3.74mL、7.48mL濃縮成1mL,密封隔水煮沸消毒,置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 給藥方法 以每100g大鼠體質(zhì)量灌胃1mL為標(biāo)準(zhǔn),空白組和模型組分別灌胃等量生理鹽水,中藥對(duì)照組和西藥對(duì)照組分別灌胃痛風(fēng)舒片溶液和秋水仙堿溶液,補(bǔ)腎利濕低、中、高劑量組分別給予補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方18.7、37.4、74.8mL/kg灌胃,各組均每日灌胃1次,連續(xù)7d,末次給藥后造模。

    2.4 造模方法 用3%氧嗪酸鉀溶液 (15mL/kg)進(jìn)行腹腔內(nèi)注射,15min后將大鼠仰臥固定,碘伏消毒右后肢小腿膝關(guān)節(jié),用BD針在大鼠右后肢膝關(guān)節(jié)右后側(cè)從30°~40°方向插入至肌腱內(nèi)側(cè),有落空感后,注入10%尿酸鈉溶液0.2mL,制備急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。空白組右后肢膝關(guān)節(jié)注射等體積生理鹽水。

    2.5 血清樣本采集 造模4h后眼眶取血,室溫下放置30min,3500r/min離心15min,分離血清,-4℃冰箱凍存待測。

    2.6 hs-CRP、DKK-1含量測定 取血清上清液,采用酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)測定血清中hs-CRP、DKK-1的濃度,具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

    2.7 關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)檢查 用銳利刀片取受試關(guān)節(jié)滑膜組織,95%乙醇固定,梯度乙醇脫水,常規(guī)石蠟包埋切片,HE染色,光鏡觀察關(guān)節(jié)滑膜組織病變。

    2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。組間比較采用One-Way ANOVA分析,多組樣本均數(shù)間比較選擇單因素方差分析,采用LSD-t檢驗(yàn),所有計(jì)量資料用(±s)表示。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較 結(jié)果見表1。與空白組比較,模型組大鼠hs-CRP、DKK-1水平明顯增高(P<0.01)。與模型組比較,各用藥組hs-CRP水平均明顯降低(P<0.01),提示各組藥物均對(duì)降低hs-CRP水平有作用。其中,西藥對(duì)照組和補(bǔ)腎利濕中劑量組效果更明顯,此2組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。血清DKK-1水平方面,與模型組比較,補(bǔ)腎利濕中劑量組和西藥對(duì)照組均有較大程度的降低趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

    表1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較(±s)

    表1 各組大鼠血清hs-CRP、DKK-1含量比較(±s)

    注:與空白組比較,**P<0.01;與模型組比較,##P<0.01;與西藥對(duì)照組比較,△P<0.05;與中藥對(duì)照組比較,▲P<0.05。

    組別 動(dòng)物數(shù)(只) 劑量hs-CRP(μg/L)DKK-1(μg/L)空白組120.39±0.02 0.93±0.04模型組 12 0.89±0.06**1.06±0.11**中藥對(duì)照組 12 2.9×10-1g/kg 0.69±0.07**##1.05±0.06**西藥對(duì)照組 12 2.8×10-4g/kg 0.49±0.05**##▲0.98±0.09補(bǔ)腎利濕低劑量組 12 18.7mL/kg 0.63±0.06**##△1.06±0.14**△補(bǔ)腎利濕中劑量組 12 37.4mL/kg 0.48±0.04**##▲0.97±0.07補(bǔ)腎利濕高劑量組 12 74.8mL/kg 0.63±0.05**##△1.02±0.07

    3.2 病理組織學(xué)觀察 空白組大鼠關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,排列整齊。模型組滑膜細(xì)胞排列不整,表面滲出,有不同程度的壞死,滑膜組織內(nèi)見有尿酸鹽結(jié)晶體,結(jié)合血尿酸測定,提示造模成功。中藥對(duì)照組滑膜組織仍見水腫、壞死、大量中性粒細(xì)胞浸潤,炎性滲出減輕。西藥對(duì)照組滑膜組織仍有水腫炎細(xì)胞浸潤,滲出不明顯。補(bǔ)腎利濕低劑量組滑膜組織仍有明顯水腫,炎細(xì)胞浸潤;中劑量組滑膜組織輕度水腫,滲出減輕,少量炎細(xì)胞浸潤;高劑量組滑膜組織仍見有退變、水腫、大量中性粒細(xì)胞浸潤。見圖1。

    圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜病理組織學(xué)圖片(HE染色,×400)

    4 討論

    急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎歸屬于中醫(yī)學(xué)痹證范疇。醫(yī)圣張仲景所著《金匱要略》中提及“歷節(jié)”,與本病癥狀相似,后世醫(yī)家多沿用此病名,并根據(jù)其痛勢劇烈的特點(diǎn)稱之為“白虎風(fēng)”、“歷節(jié)風(fēng)”。近代醫(yī)家認(rèn)為本病病因多由于人體遭受風(fēng)寒、濕熱之邪侵襲,致氣血、經(jīng)絡(luò)受病邪閉阻而引起關(guān)節(jié)紅腫熱痛、畸形等癥。我們根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn),詳審本病病機(jī),認(rèn)為痛風(fēng)應(yīng)從腎論治[4]。腎主水,且為一身陰陽之根本,人身水液代謝雖有多種臟器參與,歸根結(jié)底全賴腎陽蒸騰氣化作用。若先天不足或后天調(diào)養(yǎng)不當(dāng)引起腎臟虧虛,以致腎不溫化,濕濁內(nèi)泛,久蘊(yùn)不去,釀生濁毒,加之外受風(fēng)寒濕熱之邪,內(nèi)有七情勞倦之災(zāi),或關(guān)節(jié)外傷,天虛人虛,兩害交加,濕濁隨氣機(jī)運(yùn)行無處不到,流注關(guān)節(jié)、肌肉則為痹為痛?!端貑枴ぬ庩柮髡摗吩啤皞跐裾撸孪仁苤?,指出了急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床癥狀以下肢關(guān)節(jié)受累為主的原因。綜上所述,急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬本虛標(biāo)實(shí),以腎臟虧虛為本,氣滯、血瘀、濕聚、痰凝、熱蘊(yùn)雜合為標(biāo),治以補(bǔ)腎利濕法。補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方由資生腎氣丸化裁而來,方中熟地黃氣味厚重以滋陰補(bǔ)腎、填精益髓,山茱萸酸、微溫以補(bǔ)益肝腎、收斂固澀,兩藥配合,肝腎并補(bǔ),取“肝腎同源”之意,加入山藥補(bǔ)脾益氣,三藥合用,意在三陰并補(bǔ),復(fù)其在內(nèi)之真陰。純用補(bǔ)益之劑,味厚而有壅滯之弊,難免事倍功半,根據(jù)本病補(bǔ)腎之治法,加入澤瀉利濕以泄腎濁,調(diào)和熟地滋膩之性,另據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)研究指出,澤瀉有明顯的利尿和抗炎作用[5]。萆薢利濕去濁,祛風(fēng)除痹;土茯苓清熱解毒,除濕通絡(luò);牛膝活血通經(jīng),舒筋利痹,引血下行,利尿通淋。上三味藥對(duì)于氣、血、濕濁多有通利作用,以針對(duì)本病在標(biāo)之氣滯、血瘀、濕濁為患。諸藥配伍,標(biāo)本兼治。

    作為中藥對(duì)照組的痛風(fēng)舒片,主要藥物為大黃、車前子、澤瀉、川牛膝、防己,功用清熱、利濕、解毒,治標(biāo)為主,雖祛邪但由于不能扶正,忽略了腎臟虧虛之本,所以療效有限。臨床中常用的治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的西藥是秋水仙堿,其消炎止痛作用顯著,但是副作用較大,尤其是胃腸道反應(yīng)。

    急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作機(jī)制十分復(fù)雜,現(xiàn)代研究認(rèn)為:高尿酸血癥狀態(tài)易形成尿酸鹽結(jié)晶,作為異物觸發(fā)機(jī)體固有免疫反應(yīng),導(dǎo)致關(guān)節(jié)及周圍組織的急性炎癥反應(yīng)。hs-CRP是一種炎癥因子,是反映機(jī)體炎癥過程的靈敏指標(biāo)[6]?,F(xiàn)代研究表明,血清中hs-CRP含量在風(fēng)濕性疾病時(shí)會(huì)升高,升高的原因在于炎癥反應(yīng)和組織損傷,且hs-CRP水平與其損傷程度成正比[7]。劉國生等[8]的研究表明,血清中hs-CRP水平對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作與轉(zhuǎn)歸具有一定的相關(guān)性,可作為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎診療的一項(xiàng)新指標(biāo)。另外,Wnt pathway在骨與關(guān)節(jié)形成和破壞中通過幾個(gè)抑制性的分泌型分子起到關(guān)鍵的調(diào)控作用,DKK-1是其中最重要的抑制劑[9]。趙衛(wèi)等[10]的研究結(jié)果表明,血清中的尿酸和沉積于骨組織中的尿酸鹽共同作用導(dǎo)致骨破壞,DKK-1是參與原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎骨破壞的重要因子之一。由于研究較少,DKK-1在急性期痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎期的表達(dá)特點(diǎn)尚有爭論。

    本實(shí)驗(yàn)通過測定各組大鼠血清中hs-CRP和DKK-1的含量,證實(shí)補(bǔ)腎利濕法中藥復(fù)方能降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血hs-CRP的表達(dá),從而緩解紅、腫、熱、痛等炎癥癥狀;對(duì)Wnt途徑抑制劑DKK-1的表達(dá)具有一定抑制作用,有減少軟骨及骨質(zhì)破壞的可能性。這可能是補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎眾多機(jī)制中的一種。但是,由于有關(guān)DKK-1在急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型中的具體表達(dá)過程尚不是十分明確,補(bǔ)腎利濕中藥復(fù)方對(duì)其作用不太明確的原因仍需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

    [1] 張眾.中西藥聯(lián)用治療濕熱蘊(yùn)結(jié)型原發(fā)性急性痛風(fēng)36例臨床研究.江蘇中醫(yī)藥,2011,43(6):30

    [2] 中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部.《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的通知 [EB/OL].[2006-09-30]http://www.most. gov.cn/fggw/zfwj/zfwj2006/200609/t20060930_54389.htm

    [3] 王俊霞,韓潔茹,周雪明.姜德友從腎論治痛風(fēng)經(jīng)驗(yàn).上海中醫(yī)藥雜志,2010,44(2):16

    [4] 姜德友,安偉濤,謝穎,等.補(bǔ)腎利濕法治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效觀察.新中醫(yī),2012,44(10):35

    [5] 沈映君.中藥藥理學(xué).北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:433

    [6] 胡艷立,朱偉斌.血清超敏C反應(yīng)蛋白對(duì)痛風(fēng)的診斷價(jià)值.海南醫(yī)學(xué),2012,23(3):95

    [7] He P,Xie XH,Ding YP,et al.Correlation between high sensitive C-reactive protein,lipoprotein(a),blood uric acid and severity of coronary artery disease.Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2010,90(28):1989

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    [9] Miller JR.The Wnts.Genome Biol,2002,3(1):3001

    [10] 趙衛(wèi),高輝,朱佳鑫,等.血清Dickkopf-1與原發(fā)性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎骨破壞的相關(guān)性.北京大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版),2012,44(2):254

    R289.7

    A

    1672-397X(2015)07-0077-03

    姜德友(1960—),男,醫(yī)學(xué)博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,從事經(jīng)方治療疑難雜癥與龍江醫(yī)派研究。

    陳飛,醫(yī)學(xué)博士。chenfei0622@126. com

    2015-04-30

    編輯:吳 寧

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81173170)

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