運動對小鼠心肌miRNA-1及熱休克蛋白的影響

馬志勇，趙永才

（唐山師范學院 體育系，河北 唐山 063000）

運動對小鼠心肌miRNA-1及熱休克蛋白的影響

馬志勇，趙永才

（唐山師范學院 體育系，河北 唐山 063000）

探究長期游泳訓練對心臟的影響。小鼠進行8周的游泳訓練，訓練結束后進行心臟超聲結構的檢查，并且應用RT-PCR和免疫印跡法對miRNA-1和熱休克蛋白60、70進行檢測。結果發(fā)現訓練后小鼠心臟結構出現肥大變化，而且miRNA-1明顯表達下降，而熱休克蛋白60變化不顯著，但熱休克蛋白70明顯提高，說明心臟肥大適應同時分子的變化有保護心臟的效應。

運動；游泳；熱休克蛋白70；微小RNA；心臟

運動心臟的形成機制是目前體育學科研究熱點，認為心臟隨著外界環(huán)境的變化能產生適應性改變，有些變化屬于生理性，如運動性肥大，可以在刺激消失后逐漸恢復，有些屬于不可逆病理性變化，如心梗等病癥發(fā)生。心臟的適應變化不僅與血流負荷等宏觀因素有關系，而且與心肌內的分子調節(jié)有密切關系，因此研究心臟適應變化分子機制是當前研究重點。近年來發(fā)現microRNA（miRNA，miR）具有多種心臟特異表達類型，可調節(jié)動物心臟生長和發(fā)育，影響疾病及環(huán)境適應相關基因表達，對心臟重塑適應中的信號通路具有調節(jié)作用。miRNA是一類長約20 nt非編碼RNA，轉錄后水平調節(jié)各類基因表達，具有保守性、基因簇集排列和組織特異表達一些特點[1]，是最大的基因家族之一，大約占整個基因組的1%[2]。miRNA通過與目標蛋白mRNA的 3'非翻譯區(qū)互補配對，對mRNA進行抑制，降低蛋白表達[3]，近年對miRNA的研究已成為熱點。前人發(fā)現miRNA-1在心肌內能以熱休克蛋白60（Hsp60）和Hsp70為直接目標，抑制其表達，對心肌凋亡和重塑適應產生影響[4]，本文考察游泳訓練對miRNA-1、Hsp60和Hsp70的影響，觀察心臟結構的適應，考察心臟運動適應和探索運動心臟形成的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組訓練

7周雄性C57BL/6小鼠16只，由河北聯(lián)合大學動物實驗中心提供。自由飲食、飲水，分籠飼養(yǎng)。隨機分為2組，每組8只，為安靜對照組（control group，C組）、8周耐力訓練組（training group，T組），運動前各組間小鼠體重無顯著性差異。T組進行無負重游泳訓練，先適應性游泳訓練3天。開始8周訓練，每周訓練5天，前5周，每天晚間運動1次，后3周每天運動兩次，間隔6 h；第一周每次運動30 min，從第二周起每周增加10 min直至90 min，最后兩周均維持在90 min。

1.2 組織取樣及稱重

T組在最后一次訓練結束24 h后兩組同時取材，先稱體重（BW），小鼠迅速引頸處死，取完整心臟并進行修剪，將心臟沿冠狀面切開，濾紙吸干心臟表面的液體后稱重心臟（HW），迅速放入液氮速凍，于-80℃低溫冰箱保存待用。

訓練最后一周，全部小鼠腹腔注射飽和三溴乙醇麻醉后，仰臥位固定于操作臺上，小動物超聲儀（Vevo770型）采集小鼠心臟的二維、M型超聲心動圖像，測量并評價心臟結構和功能的適應情況。本研究測定指標：舒張期心室隔膜厚度（IVSTD）、收縮期心室隔膜厚度（IVSTS）、舒張期心室后壁厚度（PWTD）、收縮期心室后壁厚度（PWTS）、左心室舒張末期內徑（LVEDD）。

1.4 Real-time PCR技術檢測miRNA-1

1.4.1 擴增引物

采用Real-time PCR技術測定心肌miRNA-1，miR NA引物由北京博奧生物有限公司合成，管家基因以U 6作為內參，引物序列（5'→3'方向），miRNA sense引物：GTGCAGGGTCCGAGGT；miRNA-1 anti-sense引物：ACGCCTGGAATGTAAAGAAGTATG；U6-F：CTCGCTTCGGCAGCACA；U6-R：AACGCTTCACGA ATTTGCGT。

1.4.2 總RNA提取及逆轉錄

嚴格按照RNA提取試劑盒要求提取總RNA，取100 ng RNA利用miRNA逆轉錄引物進行cDNA的合成。20μL反應體系中包括Nuclease-Free Water 11.3 μL，miRNA-Stem-Loop反轉錄引物1 μL，5×First-Strand Buffer 4 μL，0.1 M DTT 2 μL，dNTP混合液0.5 μL（TaKaRa公司），M-MLV逆轉錄酶1 μL（Invitrogen公司），RNA酶抑制劑0.2 μL（Promega公司），反應條件：16 ℃，10 min；37 ℃，30 min；65 ℃，5 min。

1.4.3 Real-time PCR反應

反應體系包括以下試劑：Power SYBR Green PCR Master Mix 10μL（內含DNA聚合酶、Buffer、dNTP、SYBR Green），miRNA cDNA 1μL，miRNA通用上游引物（10μM）0.5 μL，miRNA特異性下游引物（10μM）0.5 μL，Nuclease-Free Water 8 μL，總反應體積20μL，進行40個反應循環(huán)，反應條件：95 ℃變性，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min。采用ΔΔCT法計算樣品miRNA-1相對含量。

此文由我刊特約撰稿人肖進新博士編譯。原文作者Divya B.Tripathy, Anuradha Mishra, James Clark, Thomas Farmer來源于Comptes Rendus Chimie中的Synthesis, chemistry, physicochemical properties and industrial applications of amino acid surfactants: A review一文，謹向原文作者致以崇高的敬意。

1.5 Western blotting檢測蛋白

冷凍肌組織提取蛋白，樣品與裂解液混合，冰上培養(yǎng)20 min，12,000 g離心20分鐘提取蛋白。蛋白樣品上樣，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為8%，120 V電泳50 min。電泳結束后目的蛋白轉印至PVDF膜（Millipore），然后將PVDF膜浸入5%脫脂奶粉中封閉2 h。4℃孵育一抗過夜，Hsp60、Hsp70抗體1∶1 000稀釋（博士德生物有限公司），GAPDH抗體1∶10 000稀釋（康成生物），洗膜后過氧化物酶標記二抗37 ℃環(huán)境孵育1 h。ECL試劑（碧云天生物公司）作用于PVDF膜上，然后于暗室中顯影和定影，凝膠成像系統(tǒng)半定量分析確定蛋白表達相對含量。

1.6 統(tǒng)計學方法

數據輸入SPSS16.0統(tǒng)計軟件，采用獨立樣本T檢驗統(tǒng)計方法分析數據，數據以平均數±標準差表示，P<0.05及P<0.01表示有顯著性和非常顯著性差異。

2 結果

2.1 運動訓練影響下小鼠超聲心動檢測結果

兩個組別體重無顯著差異（P>0.05），T組訓練后只體重有下降的趨勢；T組心臟整體重量（HW）和心臟/體重比值（HW/BW）兩個指標要顯著性高于C組（P<0.05）；發(fā)現舒張期心室后壁厚度（PWTD）、左心室舒張末期內徑（LVEDD）、舒張期心室隔膜厚度（IVSTD）、收縮期心室隔膜厚度（IVSTS）四個指標，T組訓練后也明顯大于C組（P<0.01），但是收縮期心室后壁厚度（PWTS）無顯著差異，總結果表明8周訓練使小鼠心肌呈現肥大適應，參考表1。

表1 訓練后小鼠超聲心動儀測試結果一覽表（n=8）

2.2 運動訓練影響下miRNA-1及蛋白表達結果

耐力訓練對心肌miRNA-1表達影響顯著；與C組比較，miRNA-1經過8周訓練后顯著性下降（p<0.05）；HSP60、HSP70表達變化不同，相比C組，HSP60無明顯提高（p>0.05），但HSP70表達卻明顯高于C組，且具有非常顯著性差異（p<0.01），參考表2及圖1。

表2 運動影響下心肌miRNA-1表達情況（n=8）

圖1 運動訓練后心肌HSP60、70表達對比

3 討論

3.1 運動訓練后小鼠心臟結構變化

本研究首先觀察游泳負荷對心臟結構的影響，心臟結構對運動最經典適應就是肥大，關于運動訓練制作心臟生理肥大模型研究較多，國外常用游泳訓練誘導動物心臟肥大。大鼠常見肥大方案如下：一種是連續(xù)運動訓練10周，5次/周，運動60 min/次；另一種方案是前8周和第1種方案相同，但第9周開始每天2次60 min運動，間隔6 h，第10周每天3次60 min運動，間隔4 h。兩種運動方案均能誘導大鼠心肌肥大，但第二種方案負荷較大，對心肌肥大的效果更加顯著[5]。小鼠游泳訓練也能誘導心肌肥大，常用如下模型：小鼠每天兩次運動，間歇4 h，第一天每次運動10 min，隨后每天增加10 min，直至90 min，然后在次基礎上再訓練28天，共計37天運動訓練，不同研究在此模型上不斷改進，最短甚至21天就能成功制造小鼠左心室肥大適應[6]。

本文首先考察長期耐力訓練影響下心臟結構的變化，參考前人研究模型[7]，延長小鼠訓練時間，共進行8周訓練，而且后面幾周增加訓練負荷。在取材前進行超聲心動圖檢測，發(fā)現長期耐力運動對小鼠心臟結構影響顯著。T組小鼠心臟整體重量和心臟/體重比值兩個指標明顯高于C組，除了收縮期心室后壁厚度無顯著增加外，舒張期心室后壁厚度、左心室舒張末期內徑、舒張期心室隔膜厚度、收縮期心室隔膜厚度四個指標均明顯大于C組。數據表明本研究中小鼠心臟呈現肥大適應，說明小鼠對本研究游泳訓練較敏感，而且觀察數據可發(fā)現心室內徑擴大，有離心性肥大傾向。

3.2 運動影響下miRNA-1和熱休克蛋白表達

miRNA在心臟發(fā)育和功能變化中起到重要調節(jié)作用，涉及的信號通路參與了心肌肥厚的發(fā)生，如Ras-MAPK、NFAT、PI3K-AKT通路。研究較多的是miRNA-1，發(fā)現miRNA-1在小鼠和人體的心肌肥大中起抑制作用[8]。MiRNA-1抑制心肌肥大機制較為復雜，認為miRNA-1通過抑制Ca2+/鈣調蛋白（Calm）-神經鈣蛋白（Cn）-NFAT路徑抑制增殖，阻止了MEF2、GATA4這些轉錄因子對蛋白基因的誘導作用[9]。另外心肌細胞中，miRNA-1還能通過抑制熱休克蛋白60（Hsp60）和Hsp70蛋白的表達促進心肌細胞的凋亡[4]，對細胞凋亡的發(fā)生有一定輔助作用。熱休克蛋白（HSP）是機體在各種刺激作用下激活后產生的一組在結構上高度保守的多肽。肌肉在運動與缺氧的情況下熱休克蛋白的表達會有所增加，熱休克蛋白賦予細胞保護作用，從而使細胞免遭高熱、缺氧、缺血再灌注、自由基等損傷[10]。本研究中miRNA-1首先顯著性下降，說明長期游泳耐力訓練能降低miRNA-1的表達，這種變化和心臟結構肥大變化相對應，miRNA-1表達下降有效釋放對下游相關蛋白的控制，肥大發(fā)生信號可進一步增強，可能是小鼠心臟肥大的一個機制。另外本研究考察了miRNA-1靶目標HSP60和HSP70的變化情況，盡管研究證實miRNA-1直接抑制HSP60和HSP70的蛋白翻譯，但HSP60表達并沒有發(fā)生預期明顯上升的變化，而HSP70的變化和miRNA-1變化相反，其表達顯著提升。總體上熱休克蛋白表達上升，這說明本次訓練負荷能對機體產生良好影響，心臟生理肥大發(fā)生同時熱休克蛋白增加，可能對凋亡產生抑制，以后可以繼續(xù)探究這種模型下具體凋亡的發(fā)生變化。

4 結論

8周游泳耐力訓練可以誘導雄性C57BL/6小鼠心肌肥大，其中miRNA-1的下降和HSP70的升高可對心臟產生積極影響，分子變化可能是心臟肥大的機制之一，同時能夠對抗凋亡等不利因素，從而產生運動訓練后的心臟保護效應。

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（責任編輯、校對：孫海祥）

Effects of Exercise on the Expressions of miRNA-1 and Heat Shock Proteins in Mice

MA Zhi-yong, ZHAO Yong-cai

(Department of Physical Education, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, China)

To discuss the effects of swimming training on the hearts of mice. Mice undertook a swimming protocol for 8 weeks, and cardiac structure were tested. miRNA-1, HSP60 and HSP 70 were detected by RT-PCR and Western blotting respectively. Results indicated cardiac hypertrophy had been induced, miRNA-1 decreased and HSP70 increased significantly, but HSP60 did not change. Cardiac adaptation and the changes of molecules can produce beneficial effects.

exercise; swimming; HSP70; miRNA; heart

G804.7

A

1009-9115(2015)02-0096-03

10.3969/j.issn.1009-9115.2015.02.028

河北省高等學?？茖W技術研究項目（Z2014121），唐山師范學院科學研究基金項目（2013D03）

2014-08-22

馬志勇（1977-），男，河北唐山人，碩士，副教授，研究方向為運動健身與康復。