恰瑪古皂苷的提取及清除自由基活性的研究

楊保求 唐琪 蒲云峰*

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾市843300）

恰瑪古皂苷的提取及清除自由基活性的研究

楊保求 唐琪 蒲云峰*

（塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾市843300）

本文分別以水、甲醇和乙醇為溶劑從新疆恰瑪古中浸提皂苷，并對其清除DPPH、·OH、·O2-自由基的活性進(jìn)行了研究。試驗結(jié)果表明：在試驗濃度范圍內(nèi)，恰瑪古皂苷濃度與清除自由基能力呈量效關(guān)系，但均低于Vc清除自由基的能力，差異顯著（≤0.01）。

恰瑪古；皂苷；清除自由基

恰瑪古為新疆維吾爾族對蕪菁甘藍(lán)的一種俗稱，學(xué)名Brassica campestris L．(Brassica campestris L.)，是十字花科蕓薹屬蕓薹種的蕪菁亞種，主要分布在天山西南、塔里木西北，有較長的栽培歷史，是維吾爾族人非常喜食的一種蔬菜[1]。近年來，一些研究報道恰瑪古含有揮發(fā)油、糖苷類、皂苷、鞣質(zhì)、酚類、有機酸、生物堿、黃酮、槲皮素等多種成分[2,3]，恰瑪古汁或水提液具有抗突變、抗氧化作用、降低染色體畸變率、抑制肝癌細(xì)胞生長、修復(fù)輻射損傷等功效。

皂苷是自然界中具有生物活性的成分之一，據(jù)統(tǒng)計，有一半以上天然植物中含有皂苷[4]。近年來，關(guān)于皂苷的研究報道很多，發(fā)現(xiàn)了許多具有重要生物活性功能的皂苷組分。雖然，有學(xué)者對其活性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)具有一定的抗氧化、抗衰老、抗輻射等功能[7-9]，但是關(guān)于恰瑪古皂苷生物活性方面的研究，還未見報道。此外，皂苷提取多以乙醇或甲醇為溶劑[5,6]，然后真空濃縮，再用水溶解，最后正丁醇萃取，這說明應(yīng)該可以以水為溶劑提取皂苷。

目前，抗氧化能力的測定方法有很多，也沒有公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法[10]。有學(xué)者對10種抗氧化方法進(jìn)行了文獻(xiàn)分析，從SCI文章中出現(xiàn)頻率最高的方法依次為：DPPH、·OH、、ABTS、FRAP、ORAC、總酚估計法、TBARS法、硫酸氰鐵法、鰲合金屬離子[8]。

本研究以水、甲醇、乙醇為溶劑，提取恰瑪古皂苷，以期了解三種溶劑對皂苷提取的影響，同時選擇DPPH、三種方法研究其清除自由基的能力，為進(jìn)一步研究開發(fā)利用恰瑪古提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

恰瑪古，2013年11月購于阿克蘇農(nóng)貿(mào)市場。

甲醇、乙腈為色譜純試劑。

齊墩果酸、乙醚、甲醇、硫酸、香草醛、正丁醇、DPPH、鄰苯三酚、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、水楊酸、硫酸鐵、磷酸二氫鉀、抗壞血酸等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

GZX-9240鼓風(fēng)干燥烘箱，上海博訊實業(yè)有限公司；

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器廠；

RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；

SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司；

TU-1900紫外可見光分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 恰瑪古皂苷的提取

新鮮恰瑪古切成1～2mm薄片，在70℃的條件下鼓風(fēng)干燥，然后研磨成粉，過80目篩，冷藏備用；取一定量恰瑪古粉，置于圓底燒瓶中，按1∶5（g/mL）的比例加入乙醚，浸泡過夜，減壓過濾，然后干燥去除殘留乙醚，獲得脫脂恰瑪古粉。稱取一定量脫脂恰瑪古粉，按1∶10（g/mL）的比例加入溶劑，浸泡過夜后，在溫度為55℃、超聲功率120W的條件下，超聲25min，減壓過濾，真空濃縮，蒸餾水稀釋，然后用等體積水飽和正丁醇萃取兩次，將兩次萃取液混合并濃縮、烘干，得到樣品，低溫貯藏備用。

1.3.2 皂苷含量測定方法

稱取一定量1.3.1的樣品，甲醇溶解定容，再準(zhǔn)確吸取皂苷溶液0.50mL于25mL試管中，加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL和77%硫酸5mL，在70℃恒溫水浴15min，然后冷水浴10min，以空白試劑為參比，在波長545nm下測定其吸光度及皂苷濃度。

1.3.3 恰瑪古皂苷對DPPH自由基的清除作用

在試管中加4mL 1mmol/mL DPPH和1mL樣品溶液，混勻后在暗室靜置30min，然后在517nm下測定吸光度A517，每個處理均做3次平行試驗。對DPPH自由基清除率見式（1）。

1.3.4 恰瑪古皂苷對·OH的清除作用

在試管中加入2.0mL 6.0mmol/L水楊酸-乙醇溶液和2.0mL 2.0mmol/L FeSO4溶液，然后加入1.0mL樣品溶液，再加入2mL 1.0mmol/LH2O2啟動反應(yīng)，37℃水浴下保溫30min，在510nm測吸光值A(chǔ)510，每個處理均做3次平行試驗。對·OH的清除率計算方法同式（1）。

取4.5mL pH 8.2 Tris-HCL緩沖液和1mL樣液加入25mL試管中，在25℃下水浴保溫20min，然后加入0.3mL 25℃預(yù)熱過的5mmol/L的鄰苯三酚，搖勻，立即在325nm波長下測定吸光度值A(chǔ)325，每隔30s讀一次數(shù)，測定4min內(nèi)的吸光值變化，每個處理均做3次平行試驗，計算吸光度A325變化的速率。對·O2-的清除率計算方法見式（2）。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

移取0.19、0.15、0.11、0.07、0.04、0.02及0.01mg/mL的齊墩果酸甲醇溶液0.50mL于25mL玻璃試管中，各加入8%香草醛乙醇溶液0.5mL和77%硫酸5mL，在70℃恒溫水浴15min，以空白試劑為參比，在波長545nm下用紫外可見分光光度計進(jìn)行測定，在所測試濃度范圍（0.01～0.19mg/mL）內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程：

圖1 皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of saponins

2.2 不同溶劑提取恰瑪古皂苷的含量

以水、甲醇、乙醇為溶劑，分別準(zhǔn)確稱取5.000g恰瑪古粉9份，按照1.3.1的方法提取恰瑪古皂苷，參照1.3.2的方法測定含量，結(jié)果見圖2。

圖2 不同溶劑提取恰瑪古皂苷的含量（n=3）Fig.2 The saponins contents extracted by different solvents（n=3）

對不同溶劑提取獲得的結(jié)果進(jìn)行方差分析，甲醇和乙醇提取的恰瑪古皂苷含量之間不存在顯著差異（≥0.05），而甲醇和乙醇提取的皂苷含量均顯著高于水提取的皂苷含量（≤0.01）。這一結(jié)果說明水確實可以作為溶劑提取皂苷，同時也可以解釋大多數(shù)學(xué)者都以甲醇和乙醇為溶劑提取皂苷的原因。

2.3 清除DPPH自由基的效果

由圖3可以看出，以Vc對DPPH自由基的清除率為對照，其高于恰瑪古皂苷，且差異顯著（≤0.01）。在試驗濃度范圍內(nèi)，不同溶劑提取的恰瑪古皂苷濃度與DPPH的清除率的呈線性相關(guān)，其清除DPPH自由基的IC50乙=2.72mg/mL＜IC50甲=2.76mg/mL＜IC50水=3.41mg/mL。這說明恰瑪古皂苷具有清除DPPH自由基的能力，甲醇和乙醇提取的皂苷比水提取皂苷的DPPH清除自由基能力強，差異顯著（≤0.05）。

圖3 恰瑪古皂苷對DPPH的清除效果的影響Fig.3 Scavenging effect of Qiamagu saponins on DPPH radical

2.4 清除·OH自由基的效果

圖4 恰瑪古皂苷對·OH的清除效果的影響Fig.4 Scavenging effect of Qiamagu saponins on ·OH radical

由圖4可以看出，不同濃度VC顯著高于恰瑪古皂苷對·OH的清除能力（≤0.01）。在試驗濃度范圍內(nèi)，不同溶劑提取的恰瑪古皂苷濃度與·OH的清除率的呈線性相關(guān)，其清除·OH自由基的IC50乙=2.53mg/mL＜IC50甲=2.54mg/mL＜IC50水=3.13mg/mL。這說明恰瑪古皂苷具有清除·OH自由基的能力，甲醇和乙醇提取的皂苷比水提取皂苷的清除·OH自由基能力強（≤0.05）。

2.5 清除自由基的效果

圖5 恰瑪古皂苷對·O2-的清除效果的影響Fig.5 Scavenging effect of Qiamagu saponins on·O2-radical

3 結(jié)論

通過試驗，發(fā)現(xiàn)水、乙醇和甲醇均能提取恰瑪古皂苷，但是甲醇和乙醇提取的恰瑪古皂苷含量顯著高于水提取的皂苷含量（≤0.01）。這說明乙醇和甲醇提取恰瑪古皂苷的效果比水要好，這可能也是大多數(shù)研究選擇甲醇和乙醇提取皂苷的原因。

在清除自由基的試驗中，對照Vc高于恰瑪古皂苷的清除能力（≤0.01）；在高濃度時，恰瑪古皂苷對DPPH的清除率與Vc相當(dāng)；在試驗濃度范圍內(nèi)，不同溶劑提取的恰瑪古皂苷濃度與的清除率的均呈線性相關(guān)，其IC50在2.53～3.82mg/mL之間，說明恰瑪古皂苷具有抗氧能力。此外，甲醇、乙醇和水提取的皂苷清除自由基能力之間的存在差異，可能因溶劑極性不同，提取到的皂苷組分存在差異，而這些存在差異的皂苷組分可能具有較強的抗氧化能力。在今后的研究工作中，應(yīng)對恰瑪古皂苷組分及功能進(jìn)一步研究。

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Study on Free Radical Scavenging Activity of Saponins from Brassica campestris

YANG Bao-qiu TANG QiPU Yun-feng*
(College of Life Sicence,Tarim University,Alar 843300,China)

Saponins from Brassica campestris L.were extracted with water,methanol and ethanol,respectively，and their free radical scavenging activity was also studied in this paper.The experiment's results showed that saponins could be extracted form Brassica campestris L.using different solvent.However,the extracting yield of ethanol and methanol were higher than water(≤0.01).In the present study,there were dose-effect relationships between free radical scavenging activity and the concentration of saponins of Brassica campestris L.,and its scavenging activity was weaker than that of Vc(P≤0.01).

Brassica campestris L;saponins;antioxidant activity

R29

A

1008-1038(2015)10-0018-04

2015-08-13

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點實驗室開放課題（BRYB1101）；塔里木大學(xué)校長基金碩士項目（TDZKSS201311）

楊保求（1979—），男，副教授，研究方向為食品科學(xué)與天然產(chǎn)物

*通訊作者：蒲云峰（1981—），男，副教授，研究方向為食品科學(xué)與天然產(chǎn)物