一步法制備羧基聚苯乙烯共聚熒光微球及其表征*

劉清浩，郭金春，段 鵬，劉紅彥，陳立功

（1.中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，河南 鄭州 450002；3.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津300072）

一步法制備羧基聚苯乙烯共聚熒光微球及其表征*

劉清浩1，郭金春1，段 鵬1，劉紅彥2，陳立功3

（1.中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，河南 鄭州 450002；3.天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津300072）

以苯乙烯和丙烯酸/甲基丙烯酸為單體、烯丙基熒光素為熒光染料，采用一步法制備了兩種粒徑均一、表面羧基化的聚苯乙烯共聚熒光微球。用環(huán)境掃描電子顯微鏡、熒光顯微鏡、紅外光譜儀、熒光分光光度計等對其形貌、結(jié)構(gòu)和性能進行表征。結(jié)果表明:所制備的兩種羧基化共聚熒光微球單分散性好、熒光性能好且穩(wěn)定；表面成功引入羧基；聚合在共聚熒光微球中的熒光素具有和烯丙基熒光素一致的性質(zhì)，并證實了共聚熒光微球和烯丙基熒光素在乙醇和甲苯中具有不同熒光光譜的理論。

丙烯酸；甲基丙烯酸；一步法；羧基聚苯乙烯共聚熒光微球

前言

羧基化聚苯乙烯微球具有分散性好、比表面積大、吸附性強、凝集作用大和與各種配體尤其是對生物分子的反應(yīng)活性高等特性，以及其他性狀如中空多孔性、磁性、熒光性等[1,2]，在免疫技術(shù)、蛋白質(zhì)分析、臨床診斷、細胞學(xué)等方面應(yīng)用廣泛[3～5]。將羧基化聚苯乙烯微球與熒光物質(zhì)相結(jié)合得到羧基化聚苯乙烯熒光微球，其穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)及高效的發(fā)光效率，已被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的檢測中[6～8]。國內(nèi)目前對熒光微球的研究多局限于專利[9,10]，且熒光穩(wěn)定性差、易脫落、影響生物樣品、量子效率不高的缺陷存在于各種制備技術(shù)之中；所用的熒光微球多依賴于進口[11,12]，價格昂貴，由此熒光微球的國產(chǎn)化已迫在眉睫，這也必將大大推動生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展。以烯丙基熒光素為熒光染料，采用一步法-分散聚合制備了羧基聚苯乙烯共聚熒光微球，并研究了微球的形貌和光譜性能。在本實驗中，采用帶有可聚合基團的烯丙基熒光素與苯乙烯直接聚合，制備的羧基聚苯乙烯共聚熒光微球具有穩(wěn)定和寬的光譜范圍，且微球表面帶有羧基功能基團，便于后續(xù)生物學(xué)的應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 主要試劑

苯乙烯（St，減壓蒸餾）、偶氮二異丁腈（AIBN，重結(jié)晶）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K30）、無水乙醇（EtOH）、丙烯酸（AA，重結(jié)晶）、甲基丙烯酸（MAA，重結(jié)晶）、3-溴丙烯和熒光素（Flu）均為分析純。實驗用水均經(jīng)離子交換并二次蒸餾純化。

1.2 烯丙基熒光素的合成[13]

向裝有電磁攪拌的100mL四口瓶中加入熒光素2.00g（6.00mmol），3-溴丙烯2.42g（20.00mmol），無水碳酸鉀4.97g（36.00mmol），對苯二酚（痕量），碘（痕量）和干燥的DMF（50mL）。在N2保護且避光的條件下，加熱至回流（71℃）反應(yīng)25h。減壓蒸餾除去DMF，得黃色粗品，用氯仿重結(jié)晶后，干法上樣經(jīng)柱色譜（二氯甲烷，V/V）分離提純得黃色粉末0.91g，收率40.53%。如圖1所示。

圖1 烯丙基熒光素的合成Fig.1 The synthesis of allyl fluorescein

1.3 一步法制備羧基聚苯乙烯共聚熒光微球

分別稱取烯丙基熒光素適量、苯乙烯0.95mL、甲基丙烯酸或丙烯酸0.04mL、偶氮二異丁腈0.02g、聚乙烯吡咯烷酮0.06g、無水乙醇3.0g和水0.4g，置于微量反應(yīng)器中，通氮除氧，密封，超聲得澄清透明溶液。置于恒溫振蕩器中，在70℃，130rpm條件下，反應(yīng)12h。用乙醇反復(fù)洗滌所得微球，50℃真空干燥即得羧基聚苯乙烯共聚熒光微球，避光保存。圖2是一步法制備羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的反應(yīng)歷程圖。

圖2 一步法制備羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的反應(yīng)歷程Fig.2 The preparation of carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere by one step method

1.4 結(jié)構(gòu)表征

羧基聚苯乙烯微球及其熒光微球的形貌通過在其表面均勻噴金后，分別利用JSM-6390型、SU-500型掃描電子顯微鏡（日本電子）表征。運用DM6000-B熒光顯微鏡（德國Leica）用綠光濾光片在630×和400×觀察熒光微球的分散性和熒光的均一度。在拍熒光照片時熒光強度會隨著時間的增加而衰減，最后湮滅，應(yīng)盡量在熒光湮滅之前快速拍攝以保證測試結(jié)果的準(zhǔn)確度。將所制備的羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯熒光微球分別與KBr混合壓片后由島津8400S FTIR光譜儀測定紅外光譜。利用美國Varian公司生產(chǎn)的Cary Eclipse型熒光分光光度計和日本島津UV2450紫外-可見分光光度計對熒光微球和烯丙基熒光素的光譜性能進行表征。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的SEM形貌

圖3（A）是采用丙烯酸單體制備的羧基聚苯乙烯微球的SEM圖，粒徑約為2 μ m。圖3（C）是采用甲基丙烯酸單體制備的羧基聚苯乙烯微球的SEM圖，粒徑比較大，約為3.7μ m。在同樣的實驗條件下，加入相同量不同的單體（丙烯酸或甲基丙烯酸），卻得到兩種粒徑的微球。原因是丙烯酸（AA）和甲基丙烯酸（MAA）均是水溶性單體，且丙烯酸比甲基丙烯酸的極性大，在本實驗中含有丙烯酸分散介質(zhì)的極性比含甲基丙烯酸分散介質(zhì)的極性大，使P（St-AA）鏈比P（St-MAA）鏈在分散介質(zhì)中的溶解度、沉淀的臨界鏈長減小的多，使P（St-AA）比P（St-MAA）的成核粒子數(shù)目增多，粒徑減小。

圖3 羧基聚苯乙烯微球（A）和（C）和羧基聚苯乙烯共聚熒光微球（B）和（D）的SEM照片F(xiàn)ig.3 TheSEMimagesofcarboxylate-modifiedpolystyrenemicrospheres（A）（×6000）,（C）（×5000）and carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microspheres（B）（×6000）,（D）（×8000）

從圖3（A）（C）可以看出，所制備的羧基聚苯乙烯微球粒徑均一且單分散性好，這為制備羧基聚苯乙烯共聚熒光微球奠定了基礎(chǔ)。圖3（B）是采用丙烯酸單體制備的羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的SEM圖，圖3（D）是采用甲基丙烯酸單體制備的羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的SEM圖。由圖1可知，熒光染料烯丙基熒光素分子較大且有兩個雙鍵，在共聚過程中存在一定程度的空間位阻，具有自阻聚作用。但加入少量烯丙基熒光素，可以保證羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的粒徑均一。從圖3（B）（D）可以看出，羧基聚苯乙烯共聚熒光微球和羧基聚苯乙烯微球（A）（C）具有基本相同的粒徑和分散性。

2.2 羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的熒光形貌

圖4 羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的熒光照片F(xiàn)ig.4 Thefluorescentimagesofcarboxylate-modifiedpolystyrenecopolymerized fluorescent microsphere（A），（B）（×630）and（C）,（D）（×400）

圖4是羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的熒光顯微鏡照片。由圖（A）、（B）、（C）和（D）可以看出，熒光微球單分散性好，熒光物質(zhì)在微球中均勻分布，使得微球發(fā)光效率高且很穩(wěn)定，這將使其在以后的研究應(yīng)用中能較好的發(fā)揮作用。

2.3 羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的紅外光譜圖

圖5是羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的紅外光譜圖。在羧基聚苯乙烯微球的紅外光譜圖A中可以觀察到，1702cm-1處為C=O基的伸縮振動峰，3446cm-1為羧酸中羥基的伸縮振動峰，說明微球表面羧基的存在；1489cm-1和1448cm-1處為苯環(huán)上C-C的伸縮振動峰，700cm-1和758cm-1為苯環(huán)上C-H鍵的面外彎曲振動峰，3019、3060和2921cm-1為苯環(huán)上不飽和C-H鍵的伸縮振動峰。上述紅外光譜圖A可證明成功的制備了羧基聚苯乙烯微球。比較羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的紅外光譜圖B和羧基聚苯乙烯微球的紅外光譜圖A，二者基本一樣，這是由于熒光微球中烯丙基熒光素是共聚在微球內(nèi)部且含量少，紅外譜圖不能表征出熒光染料的特征峰。

圖5 羧基聚苯乙烯微球和羧基聚苯乙烯共聚熒光微球的紅外光譜圖Fig.5 The FT-IR spectrum of carboxylate-modified polystyrene microsphere and carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere

2.4 烯丙基熒光素的光譜圖

圖6為烯丙基熒光素和熒光素在0.1MNaOH溶液中的熒光和紫外-可見光譜圖，將圖中所示的最大吸收波長確定為測熒光時的激發(fā)波長。如圖6所示，烯丙基熒光素在455和473nm處有兩個吸收峰，且烯丙基熒光素紫外光譜圖的寬度和其熒光光譜圖的寬度是一致的，表明合成的烯丙基熒光素具有穩(wěn)定和寬的光譜范圍。在引入烯丙基后，和母體染料相比，烯丙基熒光素在0.1MNaOH溶液中的熒光光譜發(fā)生了紅移。

圖6 烯丙基熒光素和熒光素在0.1M NaOH溶液中的紫外-可見和熒光光譜Fig.6 The UV-vis and fluorescence spectra of allyl fluorescein and fluorescein in 0.1M NaOH solution（λex of ally fluorescent is 455nm and λex of fluorescein is 491nm）

2.5 羧基聚苯乙烯共聚熒光微球、烯丙基熒光素和M在四氫呋喃中的光譜圖

圖7 羧基聚苯乙烯共聚熒光微球，烯丙基熒光素和M在四氫呋喃中的紫外-可見光譜和熒光光譜（λex=455 nm）（1代表烯丙基熒光素的熒光微球；M代表和相應(yīng)熒光微球等物質(zhì)的量烯丙基染料和聚苯乙烯的混合物）Fig.7 The UV-vis spectra and fluorescence spectra of carboxylatemodified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere,allyl fluorescein and M in THF（λex=455nm）（1 is a representative of ally fluorescent microsphere;M is a representative of the mixture of allyl dye and polystyrene which has an equal amount of substance with fluorescent microsphere）

圖7是羧基聚苯乙烯共聚熒光微球、烯丙基熒光素和M在四氫呋喃中的熒光和紫外-可見光譜圖。由圖可以看出，在四氫呋喃溶液中，它們有很相似的紫外和熒光光譜。上述結(jié)果表明烯丙基熒光素的染料特性在共聚熒光微球中保持不變，同時也證實微球的芳香環(huán)境或聚苯乙烯的剛性結(jié)構(gòu)不影響烯丙基熒光素在四氫呋喃中的光譜性質(zhì)。

2.6 羧基聚苯乙烯共聚熒光微球、烯丙基熒光素在乙醇或甲苯中的光譜圖

圖8是烯丙基熒光素在乙醇和甲苯中的熒光和紫外-可見光譜圖（熒光微球分散在乙醇中的熒光光譜圖）。由圖可以看出，在乙醇溶液中熒光微球的熒光光譜相對于烯丙基熒光素出現(xiàn)了紅移。為探究這種熒光光譜移動的原因，選擇和聚苯乙烯具有同樣芳香結(jié)構(gòu)的甲苯作為溶劑，將烯丙基熒光素溶入甲苯測定其熒光光譜。

圖8 烯丙基熒光素在乙醇和甲苯及相應(yīng)熒光微球在乙醇中的光譜（1代表烯丙基熒光素在乙醇中，2代表烯丙基熒光素在甲苯中，3代表熒光微球在乙醇中。烯丙基熒光素λex-ethanol=458nm and λex-toluene=436nm；熒光微球λex=458nm）Fig.8 The fluorescence spectra and UV-vis spectra of allyl fluorescein in ethanol and toluene and the carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere dispersed in ethanol（1,2 is a representative of ally fluorescein in ethanol and in toluene respectively, and 3 is a representative of fluorescent microsphere in ethanol.λexethanol=458nm and λex-toluene=436nm for ally fluorescein and λex= 458nm for fluorescent microsphere)

圖8表明相對于烯丙基熒光素在乙醇溶液中的熒光光譜，烯丙基熒光素在甲苯和熒光微球在乙醇溶液中的熒光光譜有不同程度的紅移，這說明當(dāng)熒光微球在乙醇溶液中，熒光光譜發(fā)生紅移主要是芳香環(huán)境和聚苯乙烯基質(zhì)的剛性結(jié)構(gòu)造成的。

3 結(jié)論

（1）合成出光譜范圍寬且具有可聚合基團的熒光染料烯丙基熒光素。

（2）采用丙烯酸或甲基丙烯酸為功能單體，一步法分別制備了2μm和3.7μ m的兩種單分散性好、粒徑均一、熒光發(fā)光效率較高且性能穩(wěn)定的羧基聚苯乙烯共聚熒光微球。

（3）羧基聚苯乙烯共聚熒光微球上的羧基易與不同生物分子的氨基相結(jié)合，在生物醫(yī)學(xué)方面有廣泛的應(yīng)用前景，尤其可應(yīng)用到免疫檢測等生物學(xué)研究中。

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圖5 G2.0含量對體系彎曲強度的影響Fig.5 The effect of G2.0 content on the bending strength of G2.0－modified system

3 結(jié)論

本文以TMA為核，PCL2054為接枝單體，采用“準(zhǔn)一步法”合成了端羧基超支化聚酯第二代產(chǎn)物G2.0并對其進行了表征，證明合成了目標(biāo)產(chǎn)物。對G2.0改性環(huán)氧體系的性能測試表明，添加適量的G2.0可明顯提高環(huán)氧體系的粘接性能，同時其固化物的拉伸性能和沖擊強度都明顯提高，改善效果明顯。但聚酯含量過高，改性體系固化物彎曲強度下降明顯。

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The Preparation of Carboxylate-modified Polystyrene Copolymerized Fluorescent Microspheres by One-step Method and Characterization

LIU Qing-hao1,2,GUO Jin-chun1,DUAN Peng1,LIU Hong-yan2and CHEN Li-gong3
（1.College of Chemical Engineering and Environment,North University of China,Taiyuan 030051,China;2.Institute of Plant Protection,Henan Academy of Agriculture Sciences,Zhengzhou 450002,China;3.College of Chemical Engineering and Technology,Tianjin University,Tianjin 300072,
China）

Two kinds of carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microspheres with uniform particle size were synthesized by one step method with using allyl fluorescein as fluorescent dye,styrene and acrylic acid/methacrylic acid as monomer.The morphology,structure and performances of these fluorescent microspheres were characterized by environmental scanning electron microscopy,fluorescence microscopy,Fourier transform infrared spectrometer,fluorescence spectrophotometer,etc.The results indicated that these two kinds of fluorescent microspheres were obtained with good dispersity and stable and high fluorescence intensity.And the carboxyl groups were successfully introduced on the surface.Furthermore,the properties of fluorescein in copolymerized fluorescent microspheres remained the same as it was in the allyl fluorescein,and the theory of the copolymerized fluorescent microspheres and allyl fluorescein in ethanol and toluene having different fluorescence spectrum had been proved.

Acrylic acid;methacrylic acid;one step method;carboxylate-modified polystyrene copolymerized fluorescent microsphere

TB332；O63

A

1001-0017（2015）06-0429-05

2015-06-16 *基金項目：省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目（編號：1404211305）

劉清浩(1979-)，女，河南南陽人，講師，博士，主要從事新型熒光功能材料合成、性能和生物應(yīng)用的研究。