同源重組整合 vgb基因提升枯草芽孢桿菌亞麻脫膠能力

張懿 翔，丁 若垚，2，3，陳婷，郁 崇文，2，3，張興 群*（.東華大學(xué)生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海20620；2.東華大學(xué)紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 20620；3.東華大學(xué)紡織學(xué)院，上海 20620）

同源重組整合 vgb基因提升枯草芽孢桿菌亞麻脫膠能力

張懿 翔1，丁 若垚1，2，3，陳婷1，郁 崇文1，2，3，張興 群1*
（1.東華大學(xué)生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201620；
2.東華大學(xué)紡織面料技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201620；
3.東華大學(xué)紡織學(xué)院，上海 201620）

【目的】將透明顫菌血紅蛋白 （VHb）基因 （vgb）在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行整合表達(dá)，以改善枯草芽孢桿菌的呼吸強(qiáng)度，通過高密度培養(yǎng)提高果膠酶的表達(dá)量，最終明顯改善脫膠效果?！痉椒ā繕?gòu)建含有 vgb基因、amyE基因以及啟動子 P43的 pSK－vgb（＋）質(zhì)粒，通過同源重組的方法，將 vgb基因整合到枯草芽孢桿菌 A5的染色體上，得到穩(wěn)定表達(dá)透明顫菌血紅蛋白的枯草芽孢桿菌 A5－vgb（＋）。分別采用 PCR和 CO差光譜分析法檢測 vgb基因的整合狀態(tài)與血紅蛋白的穩(wěn)定表達(dá)，并通過發(fā)酵搖瓶試驗(yàn)研究 VHb對菌株果膠酶產(chǎn)量的影響。將構(gòu)建好的 A5－vgb（＋）菌株進(jìn)行脫膠試驗(yàn)，通過 XRD結(jié)晶度與電鏡掃描分析鑒定脫膠效果?！窘Y(jié)果】PCR與 CO差光譜檢測表明，vgb基因成功整合在 A5菌株中，且正確表達(dá)的 VHb具有生物學(xué)活性，在150 rpm，37℃，pH＝8.0，16小時發(fā)酵的條件下，vgb基因的表達(dá)促使A5－vgb（＋）菌株的果膠酶產(chǎn)量較不含 vgb基因的菌株提升了29.5%。XRD與電鏡掃描結(jié)果表明，構(gòu)建的 A5－vgb（＋）菌株的脫膠效果相較于不含 vgb的菌株，在結(jié)晶度上提高了 0.55%，表面更光滑。【結(jié)論】將 vgb基因整合至枯草芽孢桿菌 A5菌株中，可提高 A5菌株的脫膠效果。

生物脫膠；果膠酶；枯草芽孢桿菌；vgb基因；同源重組

在眾多的紡織纖維中，麻類纖維是極具發(fā)展?jié)摿Φ木G色環(huán)保纖維。然而，作為麻類纖維原料的原麻中含有大量的膠質(zhì)，如果膠、半纖維素、木質(zhì)素和蠟脂質(zhì)等，不能直接用于紡紗工藝，必須經(jīng)脫膠處理才能進(jìn)行后續(xù)加工。麻脫膠是一個復(fù)雜的提取麻纖維的過程［1］。從環(huán)境保護(hù)角度考慮，生物脫膠被認(rèn)為是能夠取代耗能大、效率低、污染嚴(yán)重的傳統(tǒng)脫膠工藝的極有發(fā)展前途的一種方法［2］。用基因工程菌產(chǎn)生的堿性果膠酶處理代替堿對麻織物進(jìn)行煮練加工和整理工藝，以去除初生胞壁中的果膠物質(zhì)，在比較緩和的 pH值和溫度條件下使織物手感柔軟，強(qiáng)度高，而且還能避免因微生物處理造成的纖維素的降解［3－5］。

近年來，人們對透明顫菌VHb基因 （vgb）已進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)能夠改善宿主細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度、降低細(xì)胞臨界氧濃度、促進(jìn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)，可促進(jìn)宿主細(xì)胞的生長，提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量以及蛋白的合成，延長細(xì)胞的壽命［6－10］。

從中國湖南腐爛苧麻上篩選得到的 Bacillus subtilis A5是一種能產(chǎn)生具有脫膠活性的堿性果膠酶的微生物。作為革蘭氏陽性菌，且具有外分泌性強(qiáng)、細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素和發(fā)酵性能良好等特點(diǎn)。為了提高其產(chǎn)果膠酶能力，本研究通過同源重組方法將vgb基因整合到Bacillus subtilis A5染色體上，得到能夠正確表達(dá)血紅蛋白的菌株 Bacillus subtilis A5－vgb（＋），并研究其亞麻脫膠效果，為利用基因工程菌產(chǎn)生的堿性果膠酶亞麻脫膠工藝提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶、磷酸化修飾酶均購自Takara公司。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株

大腸桿菌 （DH5α）、帶有 vgb基因的質(zhì)粒 pMD 18－vgb、枯草芽孢桿菌A5，均由本實(shí)驗(yàn)室保存和構(gòu)建，帶有氯霉素篩選基因的質(zhì)粒 pHSG－398購自 Takara公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù) GenBank中枯草芽孢桿菌 amyE基因、啟動子p43以及 vgb基因的序列，參考文獻(xiàn)［9］，利用引物設(shè)計(jì)軟件 Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)引物 amyE－up1、amyE－up2、amyE－down1、amyE－down2、p1、p2、vgb1、vgb2。根據(jù)pHSG－398質(zhì)粒圖譜分別設(shè)計(jì)引物 cm1、cm2： amyE－up1：5’－ATTGCTCGAGATGTTTGCAAAACGATTCAAA－3’amyE－up2：5’－GGATAAGCTTTGTGTGTTTCCATGTGTCCAGT－3’

amyE－down1：5’－ATTGTCTAGAGCTGTGCTTTATCCTGATGATA－3’

amyE－down2：5’－ATTACCGCGGTCAATGGGGAAGAGAACCGCT－3’

p1：5’－ATTAGAATTCTGTCGACGTGCATGCAGGC－3’

p2：5’－GTAGGATCCGCTTCTGTTATTAATTCTTG－3’

vgb1：5’－CGCGGATCCGGAAGACCCTCATGTTAGA－3’

vgb2：5’－ATTATCTAGATTATTCAACCGCTTGAGCGTA－3’

cm1：5’－AATGAAGCTTTGAGACGTTGATCGGCAC－3’

cm2：5’－ACTGGAATTCAGGGCACCAATAACTGCC－3’

在上述引物5’端分別加入酶切位點(diǎn)：amyE－up1（XhoI），amyE－up2（HindIII），amyE－down1（XbaI），amyE－down2（SacI），p1（EcoRI），P2（BamHI），vgb 1（BamHI），vgb 2 （XbaI），cm1（HindIII），cm2（EcoRI）（下劃線堿基即為酶切位點(diǎn)）。引物由生工生物 （上海）有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

細(xì)菌采用液體 LB培養(yǎng)基 （蛋白胨10g／L、酵母提取物5 g／L和氯化鈉 5 g／L）于37℃培養(yǎng)。發(fā)酵搖瓶試驗(yàn)使用30mL LBG培養(yǎng)基 （液體 LB培養(yǎng)基 ＋葡萄糖10 g／L）的250mL三角瓶，在37℃，180 rpm條件下培養(yǎng)。

1.2.2 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化

大腸桿菌和枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備與轉(zhuǎn)化參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行。

1.2.3 含有 vgb基因的 pSK質(zhì)粒 （pSK－vgb（＋））的構(gòu)建

分別以amyE－up1、amyE－up2，amyE－down1、amyE－down2為引物從 A5菌株中 PCR擴(kuò)增出 amyE上下游片段作為同源重組臂。片段經(jīng)過純化后，分別使用限制性內(nèi)切酶 XhoI、HindIII（上游片段amyE－up），XbaI、SacI（下游片段amyE－down）進(jìn)行雙酶切，插入pSK質(zhì)粒中形成pSK－amyE。以cm1、cm2為引物從pHSG－398中擴(kuò)增出氯霉素抗性基因 （cm），PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、雙酶切之后插入 pSK－amyE的HindIII、EcoRI兩個位點(diǎn)之間形成pSK－vgb（－）。

P43與vgb的片段以 p1、p2和 vgb1、vgb2為引物，分別從A5菌株以及 pMD－vgb質(zhì)粒中得到。P43兩邊的位點(diǎn)為EcoRI、BamHI，vgb兩邊的位點(diǎn)為BamHI、XbaI，將 vgb置于p43啟動子下游位置。純化雙酶切后插入pSK－vgb（－），得到pSK－vgb（＋）。

圖1 pSK－vgb（＋）的質(zhì)粒圖Fig.1 Plasmid pSK－vgb（＋）

1.2.4 整合有 vgb基因的 A5菌株 （A5－vgb（＋）菌株）的構(gòu)建

如圖2所示，將所得到的pSK－vgb（－）與pSK－vgb（＋）質(zhì)粒進(jìn)行 XhoI的單酶切，并使用堿性磷酸酶去磷酸化，純化后的片段通過電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)化 （2.0kv，4.5ms－5ms）。37℃，200 rpm振蕩培養(yǎng)，復(fù)蘇3小時后，培養(yǎng)在含有 10ug／mL的氯霉素 LB固體培養(yǎng)基上涂布，過夜培養(yǎng)，在此平板上生長的菌落即為穩(wěn)定整合血紅蛋白基因的 A5－vgb（＋）枯草芽孢桿菌菌株，不含血紅蛋白基因的菌株則為A5－vgb（－）枯草芽孢桿菌菌株。

圖2 A5－vgb（＋）的整合Fig.2 Integration of vgb gene

1.2.5 血紅蛋白的測定

一氧化碳差光譜法測定血紅蛋白的方法參見文獻(xiàn)［12－13］。將離心后的細(xì)胞重懸于磷酸鹽緩沖液 （100mmol／L，pH＝7.5）中，采用加入過量的 Na2S2O4進(jìn)行還原處理和將菌泥置于 －20℃的冰箱中進(jìn)行凍融處理兩種方法進(jìn)行破菌處理，進(jìn)行一氧化碳差光譜分析。

1.2.6 果膠酶活性測定

本實(shí)驗(yàn)采用 DNS法測定酶活［14］。接種等量枯草芽孢桿菌A5－vgb（＋）與 A5－vbg（－）的過夜培養(yǎng)物于搖瓶中。在37℃，pH＝8.0，接種量1：200，轉(zhuǎn)速150 rpm的條件下在亞麻發(fā)酵培養(yǎng)基 （K2HPO41g，MgSO40.5g，亞麻粉 5g，（NH4）2SO45g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.01g，水1000mL）中進(jìn)行培養(yǎng)。分別在發(fā)酵培養(yǎng)2、4、8、12、16、20、24和30 h取樣，測定果膠酶的活性。

1.2.7 亞麻脫膠實(shí)驗(yàn)

分別將菌株A5－vgb（－）與A5－vgb（＋）在LB液體培養(yǎng)基中活化，37℃，pH8.0，150 rpm震蕩培養(yǎng)12小時后，按照1：200的比例接種至亞麻發(fā)酵培養(yǎng)基中。在37℃，150rpm，再培養(yǎng)16小時。

使用細(xì)菌發(fā)酵液來對亞麻粗紗脫膠。脫膠條件為37℃，浴比 1：10，轉(zhuǎn)速 200rpm脫膠 9小時，然后用沸水 （97－99℃）對殘菌進(jìn)行滅活，防止生物污染，滅活時間為20min。

1.2.8 掃描電鏡 （SEM）分析

掃描電子顯微鏡用于分析粉狀樣品的形態(tài)、表面特征。實(shí)驗(yàn)中采用日本 JEOL公司生產(chǎn)的JSM－5600LV型掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。在進(jìn)行形態(tài)和表面觀察前樣品粉末先分散于乙醇中，用超聲波振蕩器振蕩后滴于載波片上，然后于真空下鍍金。分析過程中儀器加速電壓設(shè)為20kV。

1.2.9 X－射線衍射 （XRD）分析

實(shí)驗(yàn)中使用日本RIGAKU，D／Max－2550PC型 X－射線衍射儀 （XRD）對樣品進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)分析。管電壓為40 kV，管電流為200 mA，2θ角測量范圍：0.5～145°；2θ角測量準(zhǔn)確性：≤0.01°。

2 結(jié)果與討論

2.1 pSK－vgb（＋）質(zhì)粒及 A5－vgb（＋）菌株的構(gòu)建

通過基因克隆的方法我們將 vgb基因構(gòu)建到 pSK質(zhì)粒中，為了鑒定我們得到菌落為陽性克隆，我們采用了兩種方法進(jìn)行鑒定。抽取篩選平板上得到的陽性菌株中的質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR鑒定與酶切鑒定。其中以vgb 1，vgb 2為引物進(jìn)行 PCR，質(zhì)粒 PCR顯示能得到 400bp左右的片段；以BamHI、XbaI進(jìn)行雙酶切，也得到400bp左右的片段 （圖3），這一片段大小與 vgb基因大小一致。后經(jīng)測序證實(shí) vgb基因已成功克隆到 pSK載體上。

將獲得的pSK－vgb（＋）質(zhì)粒酶切后，轉(zhuǎn)入枯草桿菌 A5菌株中，通過同源重組方式將 vgb基因整合在枯草桿菌 A5菌株的染色體，已達(dá)到穩(wěn)定表達(dá)血紅蛋白的目的。為了鑒定 vgb基因是否整合在 A5菌株的染色體上，我們以篩選平板上得到的菌株為模板，以 vgb 1，vgb 2為引物進(jìn)行菌落PCR，得到與vgb基因 （400bp左右）大小一致的片段 （圖4），從而證明vgb基因成功隨同源重組臂整合到A5的染色體中。

圖3 pSK－vgb（＋）質(zhì)粒的酶切鑒定M：DL2000 DNA Marker；1：pSK－vgb（＋）BamHI／XbaI雙酶切產(chǎn)物；2：以 v1／v2為引物，pSK－vgb（＋）為模板的 PCR產(chǎn)物Fig.3 Enzyme of plasmid pSK－vgb（＋）M：DL2000 DNA Marker；1：pSK－vgb（＋）digested with BamHI／XbaI；2：product of primers v1／v2 using pSK－vgb（＋）as template

圖4 A5－vgb（＋）的 PCR分析驗(yàn)證M：1kb DNA Marker；1、2：以A5－vgb（＋）為模板，v1／v2為引物pcr產(chǎn)物；3：vgb陽性對照4：vgb陰性對照Fig.4 PCR analysis of Bacillus subtilis A5－vgb（＋）M：1kb DNA Marker；1、2：Product of primers v1／v2 using A5－vgb（＋）as template；3：vgb positive control；4：vgb negative control

2.2 CO差光譜分析

CO與 VHb結(jié)合后在波長約420nm處會產(chǎn)生明顯的吸收峰，從而形成典型的 VHb蛋白特征曲線，故用此法來檢測所表達(dá)的VHb是否具有活性。CO差光譜試驗(yàn)結(jié)果如圖 5所示，A5－vgb（＋）表達(dá)的 VHb蛋白在420nm處有明顯吸收峰，與之前的報(bào)道相符［15］。而對照組 A5－vgb（－）中并沒有出現(xiàn)特征峰。這說明vgb基因成功整合到A5菌株中，并且表達(dá)出的 VHb蛋白具有生物學(xué)活性。

圖5 VHb的 CO差光譜分析Fig.5 CO－difference spectra of VHb

2.3 果膠酶活性對比

由圖6可知，在轉(zhuǎn)速為150 rpm條件下，枯草芽孢桿菌 A5－vbg（＋）較A5－vbg（－）的果膠酶活性有所提高。不含有 vgb基因的菌株 A5－vbg（－）在0－8h的時間段內(nèi)酶活增加比較平穩(wěn)，然后進(jìn)入對數(shù)期，而枯草芽孢桿菌A5－vbg（＋）在6h之后更早的進(jìn)入對數(shù)生長期。在16h處菌株 A5－vbg（－）進(jìn)入平穩(wěn)生長期，而含有 vgb基因的菌株能繼續(xù)快速生長，果膠酶活性對比提升了29.5%。

圖6 菌株 A5－vgb（＋）與菌株 A5－vgb（－）的果膠酶酶活性曲線Fig.6 Activity curves of Pectinase of Bacillus subtilis A5－vgb（＋）and A5－vgb（－）

2.4 經(jīng)整合血氧蛋白基因的枯草桿菌 A5菌株脫膠能力檢測

我們通過兩種方式對整合血氧蛋白基因的枯草桿菌 A5菌株脫膠能力進(jìn)行了鑒定。

2.4.1 掃描電鏡 （SEM）檢測脫膠效果

亞麻纖維周圍被膠質(zhì)所包覆而無法呈現(xiàn)單纖維狀態(tài) （圖 7A）。因此，需要進(jìn)行脫膠處理。亞麻原麻經(jīng)過過生物脫膠處理后，包覆在纖維周圍的膠質(zhì)被完全去除，纖維表面變得光潔，纖維的橫節(jié)和豎紋都能夠清晰的觀察到。與未整合 vgb的枯草桿菌 A5相比，經(jīng)A5－vgb（＋）菌株脫膠后的亞麻樣品輪廓更加清晰，表面也比較光滑，證明插入 vgb基因之后的菌株脫膠效果有所提高。圖中裂縫與小坑可能是由于在脫膠過程中部分表面效果過強(qiáng)，纖維素在脫膠過程中受到了損傷，進(jìn)而導(dǎo)致精干麻物理機(jī)械性能的下降。

圖7 掃描電鏡 （SEM）檢測脫膠效果圖A：原麻樣品電鏡照片 （×3000），B：使用 A5－vgb（－）脫膠樣品電鏡照片 （×3000），C：使用 A5－vgb（＋）脫膠樣品電鏡照片 （×3000）Fig.7 Fibers scanned on electronmicroscopy（SEM）A：Non－degummed samples（×3000），B：A5－vgb（－）Degummed samples（×3000），C：A5－vgb（＋）Degummed samples（×3000）

2.4.2 X－衍射測試 （XRD）

X－衍射測試是麻類脫膠效果的常用檢測手段，在脫膠過程中原麻膠質(zhì)的增加或減少會引起結(jié)晶度的變化，而這一變化通過X－衍射來觀察 （圖8）。我們比較了亞麻原麻和野生型 A5菌株，整合了血氧蛋白的 A5－vgb（＋）菌株的亞麻脫膠樣品的晶體結(jié)構(gòu)變化。X－衍射研究顯示不同樣品的結(jié)晶度依次上升。原麻樣品為 60.81%、A5－vgb（－）脫膠樣品為 66.38%、A5－vgb（＋）脫膠樣品為66.93%。這是因?yàn)橥ㄟ^生物脫膠工藝去除了原麻中的果膠、半纖維素和水溶物等膠質(zhì)，使得原麻中的無定形區(qū)減小，結(jié)晶度提高。這表明利用插入 vgb的 A5菌株的脫膠比對照組，在效果上有一定提高。而且，2θ角最高峰依次為，原麻樣品 d＝23.020、A5－vgb（－）脫膠樣品d＝22.900、A5－vgb（＋）脫膠樣品 d＝22.820，發(fā)生了左移，這說明隨著脫膠的進(jìn)行，原麻的晶體結(jié)構(gòu)也發(fā)生了細(xì)微改變。

圖8 不同處理后，亞麻脫膠樣品的 X－衍射測試 （XRD）圖A：原麻，B：A5－vgb（－）脫膠樣品，C：A5－vgb（＋）脫膠樣品Fig.8 X－ray diffraction（XRD）of degummed flax of different treatmentsA：Non－degummed samples，B：A5－vgb（－）degummed samples，C：A5－vgb（＋）degummed samples

3 結(jié)論與討論

利用工程菌進(jìn)行亞麻脫膠的方法，近年來在國內(nèi)外都有一定的運(yùn)用。酶法亞麻脫膠與傳統(tǒng)的溫水浸漬脫膠相比，酶法亞麻脫膠可控性強(qiáng)，脫膠條件溫和，對纖維損傷小，可以從根本上解決傳統(tǒng)工藝存在的環(huán)境和能源等問題，在質(zhì)量與環(huán)保方面具有傳統(tǒng)工藝無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。

本研究采用堿性果膠酶，利用整合vgb基因的方法，使Bacillus subtilis A5菌株具有表達(dá)VHb蛋白的能力，獲得工程菌A5－vgb（＋），一定程度上解決菌株生長發(fā)酵過程中的溶氧、供氧不足的限制問題，能夠在高密度、低氧的條件下使工程菌的果膠酶產(chǎn)量提升，在對照菌進(jìn)入平穩(wěn)期的時候仍能繼續(xù)一段時間的對數(shù)生長，相較于對照菌酶活提高了29.5%。通過掃描電鏡測試（SEM）、X－衍射測試（XRD）分析觀察發(fā)現(xiàn)，相較于不含有vgb基因的菌株，工程菌A5－vgb（＋）的脫膠樣品能更多去除纖維周圍的膠質(zhì)，使其表面更加光滑，在結(jié)晶度上提升了0.55%。從而證實(shí)此方法能夠一定程度上提升 Bacillus subtilis A5菌株的脫膠能力。對于工程菌的最佳發(fā)酵條件仍需優(yōu)化才能進(jìn)一步發(fā)揮其優(yōu)勢，為亞麻脫膠的深入研究開闊了思路。

［1］董政娥，管映亭.一種野生麻纖維脫膠初探 ［J］.印染助劑，2003，20（3）：23－25.

［2］張寧，童步章.酶在紡織工業(yè)中應(yīng)用有利于環(huán)保 ［J］.國外紡織技術(shù)，2003，（5）：40－42.

［3］薛長湖，張永勤.果膠及果膠酶研究進(jìn)展 ［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，24（6）：94－99.

［4］Cao J，Zheng L，Chen S.Screening of pectinase producer from alkalophilic bacteria and study on its potential application in degumming of ramie［J］.Enz.Microbiol.Technol，1992，14：1013－1016.

［5］樊增祿.權(quán)衡果膠酶BioprepTM處理對棉織物性能的影響 ［J］.印染助劑，2002，19（5）：11－13.

［6］Ruijuan Ma，Xiangzhi Lin，et al.Vitreoscilla hemoglobin gene（vgb）improves lutein production in Chlorella vulg aris［J］. Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2014（2）：390－396.

［7］Shaohua Wang，F(xiàn)ei Liu，et al.Enhancement of natamycin production on Streptomyces gilvosporeus by chromosomal integration of the Vitreoscilla hemoglobin gene（vgb）［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2014，（4）：1369－1376.

［8］Liu Q，et al.Microbial production of l－glutamate and l－glutamine by recombinant Corynebacterium glutamicum harboring Vit-reoscilla hemoglobin gene vgb［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2008，（6）：1297－1304.

［9］Yishan Su，Xia Li，et al.Improved poly－γ－glutamic acid production by chromosomal integration of the Vitreoscilla hemoglobin gene（vgb）in Bacillus subtilis［J］.Bioresource Technology，2010，（12）：4733－4736.

［10］Zhang W，et al.Chromosome integration of the V itreoscilla hemoglobin gene（vgb）mediated by temperature-sensitive plasmid enhances γ-PGA production in B acillus amyloliquefaciens［J］.FEMS Microbiol Lett，2013，（2）：127-134.

［11］RGREEN M，SAMBROOK J.Molecular Cloning：A Laboratory Manual［M］.

［12］王大威，胡鳶雷.顫菌血紅蛋白基因在提高枯草芽孢桿菌產(chǎn)脂肽功能中的研究 ［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2007，（5）：116－127.

［13］李兵，周艷芬.CO差光譜法分析重組大腸埃希菌及產(chǎn)黃青霉中 VHb的活性表達(dá) ［J］.中國抗生素雜志，2005，30 （5）：267－303.

［14］Fan，J，Q，Yamamoto，K，Matsumoto，Y，et，al.Action of endo－a－N－acetylgalacto saminidasc from Alcaligcncs sp.on amino acid－O－glycans：Comparison with the enzyme from Diplococcuspneumoniae［J］.Biochemical and biophysical research communications，1990，169（2）：751－757.

［15］Liu C Y，Webst D A.Spectral Characteristics and Interconversions of the Reduced，Oxidized，and Oxygenated Forms of Purified Cytochrome o［J］.J.Biol.Chem，1974，（249）：4261－4266.

Improvement of Flax Degumming by Chromosomal Integration of Vitreoscilla Hemoglobin Gene（vgb）in Bacillus subtilis

ZHANG Yi－xiang1，DING Ruo－yao1，2，3，CHEN Ting1，YU Chong－wen1，2，3，ZHANG Xing－qun1*
（1.Key Laboratory of Science＆Technology of Eco－Textile，Ministry of Education，Shanghai 201620，China；
2.Key Laboratory of Textile Science＆Technology，Ministry of Education，Shanghai 201620，China；
3.College of Textiles，Donghua University，Shanghai 201620，China）

The gene Vitroscilla Hemoglobin was integrated and expressed in Bacillus subtilis to enhance the effect of degumming by improving pectinase production.Promoter p43 and gene amyE，pSK－vgb（＋）were integrated into expression vector.Through the method of homologous recombination，gene vgb was integrated into Bacillus subtilis A5，and then got a vgb integrated expression strain named Bacillus subtilis A5－vgb（＋）.The result was identified by PCR analysis and CO－spectral analysis. A5－vgb（＋）strain was applied in flax degumming，shake flask experiment was used to study the function of protein VHb in production of Pectinase.X－ray diffraction（XRD）and canning electron microscope（SEM）were uesd to analysis the effect of degumming.PCR analysis and CO－spectral analysis showed that the gene vgb was succeed in being integrated into Bacillus subtilis A5 and protein VHb had bioactivity.The results of shake flask experiment showed that the expression of gene vgb could improve Pectinase production，and the activity of Pectinase was 29.5%higher than that of the control under 150 rpm，37℃，pH＝8.0，16 hours.The data of XRD and SEM showed that being compared with the strain without gene vgb，the degumming effect of A5－vgb（＋）strain improved 0.55%in crystallinity，and had a smoother surface.To some extent，the VHb could enhance the degumming effect of Bacillus subtilis A5.

bio－degumming；Pectinase；Bacillus subtilis；gene vgb；homologous recombination；

Q789

A

1671－3532（2015）02－0087－08

2014－09－26

中國博士后科學(xué)基金面上資助 （2014M561386）；國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目 （CARS－19）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)專項(xiàng)資金 （14D110524）；大學(xué)生 “小平科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)”（麻類纖維生物脫膠技術(shù)產(chǎn)業(yè)化集成研發(fā)團(tuán)隊(duì)）

張懿翔 （1987－），男，碩士研究生，研究方向：紡織生物技術(shù)。E－mail：512413278＠qq.com。

*通訊作者：張興群 （1963－），男，副教授，研究方向：紡織生物技術(shù)。E－mail：xqz＠dhu.edu.cn。