包頭地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌分離鑒定的研究

李玉娟 王殿柱

1.內(nèi)蒙古包頭輕工職業(yè)技術(shù)學院農(nóng)牧園林工程學院；2.內(nèi)蒙古包頭稀土高新區(qū)獸醫(yī)站

一、實驗材料

1.試驗動物

包頭市昆區(qū)、青山、九原、石拐等地的各個大型養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖基地及散養(yǎng)戶患子宮內(nèi)膜炎奶牛。

2.試驗藥品及試劑

本試驗所用試劑：Barid-parker （B-P） 瓊脂培養(yǎng)基、Mueller-Hinton（M-H）肉湯、血平板培養(yǎng)基均為青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；革蘭染色液為廣東環(huán)凱生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)； 細菌基因組DNA 提取試劑盒為北京天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

二、試驗方法

1.樣品采集

本試驗對120 頭被臨床獸醫(yī)診斷為臨床型子宮內(nèi)膜炎的奶牛做直腸檢查，并采用直腸把握法采集子宮分泌物，并將其編號，封蓋，貼上標簽，置冰箱（-20℃）保存待檢。

2.葡萄球菌的分離及鑒定

（1）奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌分離。 將采集到的子宮分泌物按常規(guī)方法進行前增菌；挑取前增菌菌液進行劃線接種；將疑似葡萄球菌進行純培養(yǎng)。

（2）葡萄球菌初步鑒定。 葡萄球菌初步鑒定主要是革蘭染色鏡檢。 具體方法參照薛秀恒（2012）。

（3）葡萄球菌的分子生物學鑒定。采用PCR 方法對分離到的葡萄球菌進行分子生物學鑒定。 根據(jù)Ghebremedhin（2008）等報道的引物序列，合成gap 基因的引物，引物信息與反應(yīng)條件見表1。

表1 葡萄球菌分子生物學鑒定PCR 反應(yīng)引物信息

三、試驗結(jié)果

1. 包頭不同轄區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌分離結(jié)果

本試驗從包頭不同轄區(qū)（昆區(qū)、青山區(qū)、九原區(qū)及石拐區(qū)）的奶牛養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖基地及散養(yǎng)戶中共選取了120 頭患子宮內(nèi)膜炎的奶牛， 并采集其子宮分泌物，共分離到葡萄球菌50 株（41.7%）。 結(jié)果顯示，昆區(qū)、青山區(qū)、九原區(qū)及石拐區(qū)患子宮內(nèi)膜炎分泌物中的葡萄球菌分離率分別為43.3%（13∕30）；36.7%（11∕30）；40%（12∕30）；46.7%（14∕30）。包頭市不同轄區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌分離情況見圖1。

2.葡萄球菌分離鑒定結(jié)果

（1）葡萄球菌初步鑒定結(jié)果。 本試驗分離到的葡萄球菌在巴爾德帕克瓊脂平板上的菌落形態(tài)見圖2；革蘭染色鏡檢結(jié)果見圖3。

（2）葡萄球菌分子生物學鑒定結(jié)果。采用PCR 方法對本試驗分離到的菌株做分子生物學鑒定，結(jié)果見圖4， 并且圖中僅顯示部分菌株的PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果。 結(jié)果顯示：50 株經(jīng)初步鑒定的分離菌與標準菌株ATCC 29213 均出現(xiàn)目的條帶。

圖1 包頭市不同轄區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌分離情況

圖2 分離葡萄球菌菌落形態(tài)圖（巴爾德帕克氏瓊脂）

圖3 分離葡萄球菌菌落形態(tài)圖（革蘭染色）

圖4 葡萄球菌gap 基因PCR 產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

四、討論

1.奶牛子宮內(nèi)膜炎(endometritis)又稱產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎，是奶牛產(chǎn)后僅局限于子宮發(fā)生炎癥性變化的一種常見產(chǎn)科疾病。 引起該病的病因很多, 但病原微生物感染是其發(fā)生的直接原因。 在我國，奶牛患子宮內(nèi)膜炎的情況也是非常嚴重的。杜光波等對淮安地區(qū)部分奶牛養(yǎng)殖場中患子宮內(nèi)膜炎的奶牛發(fā)病規(guī)律進行調(diào)查， 結(jié)果顯示： 奶牛子宮內(nèi)膜炎平均發(fā)病率為34.6%。 史同瑞對黑龍江省多個奶牛養(yǎng)殖場進行奶牛疾病調(diào)查，結(jié)果顯示：奶牛患子宮內(nèi)膜炎的發(fā)病率為30%，占產(chǎn)科疾病發(fā)病率的24.62%。

眾所周知， 治療奶牛子宮內(nèi)膜炎不僅費用高、耗精力,而且還會延長奶牛的產(chǎn)犢間隔,嚴重影響奶牛的繁殖力和生產(chǎn)性能, 降低了奶牛養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益。因此，了解哪些病原微生物對奶牛具有感染，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。

2.本試驗從包頭多個轄區(qū)（昆區(qū)、青山區(qū)、九原區(qū)以及石拐區(qū)）的各個大型養(yǎng)殖場、養(yǎng)殖基地及散養(yǎng)戶總共采集了患子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮分泌物120 份，共分離到葡萄球菌50 株，分離率為41.7% 。 彭宇等報道江蘇省奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌的分離率為61.9%，王爽等報道黑龍江地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌的分離率為22.86%， 張子恒等在豫南地區(qū)母牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離鑒定的實驗研究中，報道葡萄球菌的分離率為26.87%， 這些數(shù)據(jù)除江蘇省外均比本試驗實驗結(jié)果低，出現(xiàn)這一結(jié)果可能的原因是引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的病原微生物會因地區(qū)不同而存在差異，或者是由采樣局限性造成的。 本試驗結(jié)果與朱憲光等報道內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌的分離率（50.0%）相近，表明地區(qū)相同或相近奶牛子宮內(nèi)膜炎葡萄球菌的分離率相近。 綜上所述，葡萄球菌是引起該地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌之一。為指導該地區(qū)獸醫(yī)臨床合理用藥提供科學依據(jù)。

五、結(jié)論

1.本試驗從包頭昆區(qū)、青山區(qū)、九原區(qū)及石拐區(qū)患子宮內(nèi)膜炎奶牛的子宮分泌物中分離到葡萄球菌的分離率分別為43.3%（13∕30）；36.7%（11∕30）；40%（12∕30）；46.7%（14∕30）。

2.本試驗共分離到50 株（41.7%）葡萄球菌。

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