麥角硫因的合成與降解代謝

劉 琦，張維亞，2，姜文俠*

1中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國科學(xué)院系統(tǒng)微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300308;2 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457

麥角硫因(L-Ergothioneine，EGT)是天然的2-硫代咪唑氨基酸，溶解狀態(tài)下存在硫醇和硫酮兩種結(jié)構(gòu)的互變異構(gòu)體，由于硫羰基的穩(wěn)定性高于巰基［1］，故在生理pH 條件下主要以硫酮的形式存在。EGT 的標(biāo)準(zhǔn)氧化還原電勢為-0.06 V，其它硫醇的電勢一般在-0.2～-0.32 V 之間［2］，因此，EGT 在生理環(huán)境下比其它抗氧化劑更加穩(wěn)定，不易自發(fā)氧化。圖1 是EGT 幾種異構(gòu)體的化學(xué)結(jié)構(gòu)［3］。

圖1 麥角硫因的互變異構(gòu)體結(jié)構(gòu)Fig.1 Tautomeric structures of ergothioneine

EGT 是次生代謝產(chǎn)物，蕈菌是目前發(fā)現(xiàn)的最有潛力的生物合成制備EGT 的菌種，但關(guān)于EGT 生物合成與降解代謝的研究報(bào)導(dǎo)較少，至今EGT 在大型真菌中的合成代謝途徑尚不清楚。由于近年來EGT 的應(yīng)用與合成重新受到重視，本文主要介紹EGT 的代謝研究進(jìn)展，以期指導(dǎo)EGT 的高強(qiáng)度發(fā)酵合成研究及產(chǎn)品的應(yīng)用開發(fā)。

1 EGT 在微生物中的生物合成

1.1 麥角菌中EGT 的生物合成

最初Tanret［4］在麥角菌(Claviceps purpurea)的菌核中發(fā)現(xiàn)EGT。Heath 等［5］研究麥角菌中EGT 的生物合成時發(fā)現(xiàn)，EGT 主要分布于分生孢子而非菌核中，并且，EGT 與生物堿的生物合成過程相互獨(dú)立。

Heath 和Wildy［6］在以［2-14C］醋酸鹽為碳源的化學(xué)合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)麥角菌，10 d 后收集菌體，對分離得到的EGT、組氨酸、谷氨酸及其它氨基酸進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):EGT 經(jīng)堿處理降解為三甲胺和巰基咪唑丙烯酸，然后進(jìn)一步降解巰基咪唑丙烯酸，先經(jīng)鈉汞齊還原，再利用H2O2氧化生成咪唑丙酸，咪唑環(huán)經(jīng)苯甲酰氯裂解，依次酯化及水解，再經(jīng)亞鉻酸銅脫羧，最終檢測到EGT 咪唑環(huán)上的脒碳、5 碳鏈、羧基和甲基具有放射性同位素。采用與上述相同的實(shí)驗(yàn)方法降解分離得到的組氨酸，生成帶有放射性的脒碳、5 碳鏈和羧基，證明EGT 降解產(chǎn)物和組氨酸降解產(chǎn)物的放射性分布極相似，說明麥角菌中EGT 和組氨酸的生物合成途徑可能一致，由此推測EGT 由組氨酸或組氨酸的結(jié)構(gòu)類似物合成。在含有［2(環(huán))-14C］組氨酸和［α-14C］組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)麥角菌，分離得到的EGT 經(jīng)檢測具有放射性，證明組氨酸分子中的咪唑環(huán)完全參與了EGT 的生物合成，驗(yàn)證了組氨酸是合成EGT 的前體［7］。

研究同時發(fā)現(xiàn)分離得到的谷氨酸鹽的放射性也很高，推測醋酸鹽經(jīng)三羧酸循環(huán)形成谷氨酸鹽，但EGT 和組氨酸側(cè)鏈中的碳原子放射性均較低，說明其側(cè)鏈并非來自谷氨酸鹽。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，［2(環(huán))-14C］組胺不能將咪唑環(huán)提供給EGT 和組氨酸，表明組胺不是合成EGT 的前體。利用相同的方法驗(yàn)證了一些含組胺或帶側(cè)鏈的咪唑衍生物也并非合成EGT 的前體［8］。

Heath 等［8］利用含有［35S］蛋氨酸的培養(yǎng)基培養(yǎng)麥角菌，分離得到具有放射性的EGT，證明蛋氨酸參與了EGT 的生物合成。

綜上得知組氨酸和蛋氨酸是麥角菌中合成EGT 的前體，谷氨酸鹽、組胺及一些含組胺或帶側(cè)鏈的咪唑衍生物并未參與EGT 的生物合成。

1.2 粗糙鏈孢霉中EGT 的生物合成

Melville 等［9，10］發(fā)現(xiàn)粗糙鏈孢霉(Neurospuru Crussa)能夠合成EGT，并利用同位素示蹤法研究了EGT 生物合成的前體及其生物合成途徑。

1.2.1 EGT 分子中咪唑環(huán)的來源

Melville［10］將粗糙鏈孢霉置于含有［2-14C］組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，利用氧化鋁柱層析分離［11］，對流出組分進(jìn)行放射性檢測［12］，結(jié)果表明:具有放射性的峰與EGT 的出峰時間及峰形均一致，堿處理此組分后生成帶有微量放射性的三甲胺和具有明顯放射性的巰基咪唑丙烯酸，證明了流出組分是EGT，組氨酸是合成EGT 的前體［9］。

此外，發(fā)現(xiàn)如果培養(yǎng)基中含有高濃度的［14C］組氨酸，則巰基咪唑丙烯酸與組氨酸的比放射性一致，說明內(nèi)源組氨酸合成EGT 的途徑完全被外源的［14C］組氨酸所抑制。同時，在組氨酸合成EGT 的過程中，咪唑環(huán)被完整地保留下來，這是因?yàn)槿绻溥颦h(huán)在C-2 原子處發(fā)生裂解，則必將丟失部分被標(biāo)記的碳原子。

1.2.2 EGT 分子中側(cè)鏈的來源

Melville 推測EGT 合成可能的中間體還包括咪唑丙烯酸、咪唑丙酮酸及其含硫衍生物，它們可能取代了組氨酸分子中的α-氨基氮原子。為驗(yàn)證此推測，Melville［13］將含有15N 標(biāo)記的組氨酸(［15N］組氨酸的來源:將粗糙鏈孢霉置于以［15N］銨鹽為唯一氮源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)結(jié)束后，酸解菌體蛋白分離得到［15N］組氨酸)作為前體培養(yǎng)粗糙鏈孢霉，分離得到的EGT 被降解成巰基咪唑丙烯酸和三甲胺，通過分析組氨酸、EGT 及其降解產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)15N 在巰基咪唑丙烯酸分子中的咪唑環(huán)和三甲胺分子中的α-氮原子間的分布高度一致，證明整個組氨酸分子，包括側(cè)鏈中的氮原子均參與了EGT 的生物合成［9］。

1.2.3 EGT 分子中甲基的來源

將粗糙鏈孢霉置于含有［14C］蛋氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，合成的EGT 具有高度放射性，降解得到的甲基也具有放射性［10］。利用［14C］甲酸鹽和［14C］甲醛作為前體，合成的EGT 并非在甲基處產(chǎn)生放射性，而是部分巰基咪唑丙烯酸帶有了放射性，說明EGT 分子中的甲基可能通過轉(zhuǎn)甲基作用合成，要驗(yàn)證此推測，需要含放射性氫原子標(biāo)記的甲基供體作實(shí)驗(yàn)材料。

Melville 等［13］利用同時含有14C 和氘(D)標(biāo)記的蛋氨酸進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，含有雙標(biāo)記的蛋氨酸合成EGT后被降解成三甲胺，比較含有14C 的三甲胺與［14C］蛋氨酸，發(fā)現(xiàn)兩者均含有大量的氘。由于蛋氨酸甲基中氫和碳原子的個數(shù)比為3∶1，甲酸鹽分子中氫和碳原子的比為1∶1，甲醛分子中的氫和碳原子之比為2∶1。將蛋氨酸甲基中D∶14C 的比值設(shè)為1，假設(shè)蛋氨酸中的甲基碳原子經(jīng)甲酸鹽或甲醛介導(dǎo)轉(zhuǎn)移至EGT:如果是通過甲酸鹽介導(dǎo)，則EGT 甲基中D∶14C 的比值不會超過1/3，若是經(jīng)甲醛介導(dǎo)，比值則不會超過2/3，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示D∶14C 的比值超過了2/3，說明蛋氨酸至少轉(zhuǎn)移了一個完整的甲基至EGT。由于實(shí)驗(yàn)對放射性同位素進(jìn)行了高度稀釋，未得到其它兩個甲基的確切來源。

為驗(yàn)證EGT 分子中三個甲基的來源，將蛋氨酸缺陷型突變株置于含有雙標(biāo)記蛋氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，合成的EGT 經(jīng)降解得到的三甲胺含有大量的14C 和氘，同時，三甲胺分子中D∶14C 的比值與蛋氨酸分子中D∶14C 的比值基本一致。如上所述，若EGT分子中的甲基來自于蛋氨酸經(jīng)由甲酸鹽或甲醛介導(dǎo)生成，則降解得到的三甲胺分子中D∶14C 的比值會小于蛋氨酸分子中D∶14C 的比值，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)三甲胺和蛋氨酸分子中的D∶14C 比值基本一致，由此說明了EGT 分子中的三個甲基均經(jīng)蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基作用合成。

1.2.4 EGT 分子中硫原子的來源

Melville 等［10］在含有放射性標(biāo)記的硫酸鹽培養(yǎng)基中添加大量不具放射性的含硫化合物，如胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、硫代硫酸鹽、膽堿硫酸鹽、硫代乙酰胺和硫氰酸鹽，進(jìn)行了巰基供給的競爭性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明硫代硫酸鹽和含硫氨基酸是合成EGT 有效的巰基供體，其中胱氨酸優(yōu)于蛋氨酸，半胱氨酸則是最佳的巰基供體，硫代硫酸鹽要首先轉(zhuǎn)化為半胱氨酸，再參與EGT 的合成。這個反應(yīng)也在構(gòu)巢曲霉(Asp.nidulans)中得到了驗(yàn)證［14］。

1.2.5 EGT 分子的生物合成順序

Melville［9］推測EGT 的生物合成順序有兩種:(1)組氨酸經(jīng)半胱氨酸巰基化合成巰基組氨酸(thiolhistidine)，再經(jīng)蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基作用生成EGT;(2)組氨酸經(jīng)蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基作用生成組氨酸甜菜堿(hercynine)，再經(jīng)半胱氨酸巰基化合成EGT。

為此，將粗糙鏈孢霉置于含有［2-14C］巰基組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，合成的EGT 具有極微量的放射性［10］。由于菌體的抽提物具有大量的放射性，表明巰基組氨酸能夠穿透細(xì)胞膜，由此證明了巰基組氨酸不是合成EGT 的中間體。

Melville［9］將粗糙鏈孢霉分別置于添加了外源［2-14C］組氨酸，以及［2-14C］組氨酸和組氨酸甜菜堿組合物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，研究產(chǎn)物中EGT 的含量及總放射性的變化。經(jīng)氧化鋁柱層析分離，［2-14C］組氨酸實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)了兩個放射性峰，第二個峰的峰面積大于第一個峰，EGT 的出峰時間與第二個峰一致。添加［2-14C］組氨酸與組氨酸甜菜堿組合物的實(shí)驗(yàn)組中，同樣出現(xiàn)兩個放射性峰，但第一個峰的峰面積遠(yuǎn)大于第二個峰，EGT 的出峰時間仍與第二個峰一致，其中第二個峰的峰面積與［2-14C］組氨酸實(shí)驗(yàn)組中第二個峰的峰面積相近。實(shí)驗(yàn)證明了EGT的保留時間長于［2-14C］組氨酸的保留時間，同時外源添加的組氨酸甜菜堿幾乎完全抑制了內(nèi)源組氨酸合成EGT 的過程，說明組氨酸甜菜堿是EGT 合成的直接中間體，即EGT 的生物合成順序?yàn)榻M氨酸先經(jīng)蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基作用生成組氨酸甜菜堿，再與半胱氨酸發(fā)生巰基化合成EGT。

當(dāng)硫源缺乏時，粗糙鏈孢霉細(xì)胞內(nèi)僅含有組氨酸甜菜堿，硫源充足時，細(xì)胞內(nèi)迅速合成EGT，同時組氨酸甜菜堿的含量不斷下降，亦證明了組氨酸甜菜堿是合成EGT 的中間體。

1.2.6 催化EGT 合成的酶的推測

Ishikawa 等［15，16］使用粗糙鏈孢霉的無細(xì)胞抽提液證明了EGT 由組氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸合成，其中組氨酸甜菜堿和組氨酸甜菜堿-半胱氨酸硫氧化物(hercynylcysteine sulfoxide)是合成EGT 的中間體，推測S-腺苷蛋氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶［S-adenosyl methionine (SAM)-dependent methyltransferases］，F(xiàn)e2+依賴性氧化酶［iron(II)-dependent oxidase］和5-磷酸吡哆醛依賴性β-裂合酶［pyridoxal 5-phosphate (PLP)-dependent-lyase］很可能在EGT 的合成途徑中起到了催化的作用，但并未對這幾種酶進(jìn)行研究與驗(yàn)證。

1.3 分枝桿菌中EGT 的生物合成

1.3.1 分枝桿菌科中EGT 生物合成的前體

Genghof 等［17］研究了100 余種分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)中EGT 及組氨酸甜菜堿的生物合成過程，結(jié)果同Melville 的研究結(jié)果一致。在分別添加［35S］硫酸鹽和［2-14C］組氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)分枝桿菌，分離得到EGT 和組氨酸甜菜堿，由于EGT和組氨酸甜菜堿的保留時間差異很小，采用兩根氧化鋁層析柱串聯(lián)分離兩種物質(zhì)，并單獨(dú)分析每根色譜柱的流出組分，得到組分的放射性和甜菜堿峰隨時間的變化曲線。由于甜菜堿是EGT 和組氨酸甜菜堿分子中的特殊基團(tuán)，對甜菜堿的檢測可以間接反映EGT 和組氨酸甜菜堿的動態(tài)變化過程。

［35S］硫酸鹽實(shí)驗(yàn)組樣品經(jīng)第一根色譜柱分離，出現(xiàn)一個具有放射性的甜菜堿峰，再經(jīng)第二根色譜柱分離，出現(xiàn)兩個甜菜堿峰，但只有第二個色譜峰具有放射性，說明第一個色譜峰是組氨酸甜菜堿，第二個色譜峰是EGT，EGT 保留時間長于組氨酸甜菜堿的保留時間，放射性來源于［35S］硫酸鹽。

［2-14C］組氨酸實(shí)驗(yàn)組樣品經(jīng)第一根色譜柱分離后，同樣出現(xiàn)一個具有放射性的甜菜堿峰，再經(jīng)第二根色譜柱分離，出現(xiàn)具有兩個放射性的甜菜堿峰，表明［2-14C］組氨酸參與了組氨酸甜菜堿和EGT 的生物合成過程，上述兩個色譜峰分別為組氨酸甜菜堿和EGT。

實(shí)驗(yàn)證明了EGT 和組氨酸甜菜堿在分枝桿菌中的合成路徑一致，組氨酸分子中的咪唑環(huán)完整地參與了EGT 和組氨酸甜菜堿的生物合成，組氨酸甜菜堿再經(jīng)巰基化合成EGT。因此，組氨酸甜菜堿是分枝桿菌(Mycobacteria)合成EGT 的直接前體。

1.3.2 分枝桿菌EGT 生物合成途徑中關(guān)鍵酶的推測

Ishikawa［15，16］推測SAM依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶、Fe2+依賴性氧化酶和PLP 依賴性β-裂合酶可能對EGT 的生物合成起到了催化作用。為探尋控制EGT 合成的相關(guān)基因，Seebeck［18］利用上述幾種酶進(jìn)行體外催化實(shí)驗(yàn)，模擬分枝桿菌中EGT 的生物合成途徑。由于Fe2+依賴性酶［iron(II)-dependent enzymes］難以從序列中被單獨(dú)識別，同時PLP 結(jié)合蛋白(PLP-binding proteins)的功能尚不明確［19］，研究人員首先從甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferases)入手分析。編碼分枝桿菌甲基轉(zhuǎn)移酶的一組基因緊鄰PLP 結(jié)合蛋白，形成含有5 個基因的基因簇，推測這個基因簇很可能與EGT 的合成相關(guān)，Seebeck 將這5個基因命名為egtA、egtB、egtC、egtD 和egtE，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，圖2 是對分枝桿菌EGT 生物合成途徑的推測［18］。

圖2 分枝桿菌中麥角硫因生物合成途徑的推測Fig.2 Possible biosynthetic pathway of mycobacterial ergothioneine

為驗(yàn)證EgtD 是否為組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，從包皮垢分支桿菌(Mycobacterium smegmatis)中克隆出其相關(guān)基因，并在E.coli 中重組表達(dá)。純化后，采用蛋白原氨基酸(proteinogenic amino acids)作為底物分析了EgtD 的甲基化活性，同時利用SAM 和S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase)進(jìn)行了對比分析。反應(yīng)過程中，產(chǎn)物2-組氨酸甜菜堿是電噴霧質(zhì)譜唯一檢測到的甲基化產(chǎn)物，并利用酶與紫外偶聯(lián)檢測技術(shù)驗(yàn)證了組氨酸和α-N，N-二甲基組氨酸(R-N，N-dimethylhistidine)是EgtD的最適底物［20］。

此外，對egtA、egtB、egtC 和egtE 四個基因編碼的產(chǎn)物進(jìn)行了驗(yàn)證。EgtA、EgtC 和EgtE 的序列分別類似于γ-谷氨酰半胱氨酸裂合酶(γ-glutamyl cysteine ligase)、Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(class-II glutamine amidotransamidase)和PLP 結(jié)合蛋白［21］，EgtB具有與甲酰甘氨酸合成酶(formylglycine-generating enzymes，F(xiàn)GEs)相同的DUF323 結(jié)構(gòu)域［22］，并且EgtB 和EgtC 的真菌同系物作為融合蛋白被編碼，表明這兩個蛋白形成了一個功能單元。

為驗(yàn)證EgtB 是否具有硫氧化酶的活性，利用γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-glutamylcysteine)作為巰基供體與產(chǎn)物2 進(jìn)行反應(yīng)，HPLC 分析顯示250 nm 處產(chǎn)物的分子量與產(chǎn)物3 相同，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H、COSY 和HSQC NMR 光譜得到驗(yàn)證，證明了EgtB 具有硫氧化酶的活性。同時發(fā)現(xiàn)只有Fe2+存在時EgtB 才表現(xiàn)出活性［15］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物2 是優(yōu)先的巰基受體，組氨酸與EgtB 的親和力則較弱［15，16］。為推測產(chǎn)物2 能否直接與半胱氨酸反應(yīng)生成產(chǎn)物4，利用半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)和谷胱甘肽替代γ-谷氨酰半胱氨酸與EgtB 進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果均未生成產(chǎn)物4，證明產(chǎn)物3 是分枝桿菌EGT生物合成途徑的重要中間體。

對于產(chǎn)物3 發(fā)生谷氨酰胺鍵的水解以及由產(chǎn)物4 生成EGT 的反應(yīng)，推測分別由EgtC 和EgtE 催化。實(shí)際上，由重組EgtB 和EgtC 催化產(chǎn)物2 形成產(chǎn)物4的過程，即證明EgtC 具有谷氨酰氨基轉(zhuǎn)移酶(glutamine amidotransferase)的活性。由于重組EgtE 失敗，實(shí)驗(yàn)由β-裂合酶替代EgtE 催化產(chǎn)物4 與丙酮酸鹽反應(yīng)生成了EGT［18］。

Seebeck 研究推測了EgtA、EgtB、EgtC、EgtD 和EgtE 在EGT 生物合成途徑中所起到的作用，其中最重要的兩個反應(yīng)是由組氨酸特異性甲基轉(zhuǎn)移酶(histidine-specific methyltransferase)EgtD 催化組氨酸發(fā)生的甲基化反應(yīng)，以及由Fe2+依賴性酶EgtB催化產(chǎn)物2 發(fā)生的氧化硫化反應(yīng)。不同微生物中含有這組酶暗示了EGT 是放線菌目、藍(lán)細(xì)菌、盤菌亞門、擔(dān)子菌門、擬桿菌門和α-、β-、γ-、δ-變形菌門的共同產(chǎn)物。由于高等真核生物缺乏這簇基因，Seebeck 認(rèn)為闡明EGT 的生物合成途徑有可能為抗菌治療提供一個新的靶點(diǎn)［18］。

1.4 其它微生物中EGT 的生物合成

Genghof［23］研究了包括鏈霉菌在內(nèi)的一些真菌及放線菌中EGT 與組氨酸甜菜堿的生物合成，所考察的菌株均能合成EGT，而且除黑曲霉之外均能合成組氨酸甜菜堿。EGT 的含量在1.7～46.6 mg/100 g DW 之間，多數(shù)菌株中組氨酸甜菜堿的含量低于EGT 的含量，少數(shù)菌株中組氨酸甜菜堿的含量較EGT 高。在外源硫原子耗盡時，組氨酸甜菜堿的含量升高，EGT 的含量隨之下降，由此推測組氨酸甜菜堿是合成EGT 的前體。

2 麥角硫因的降解代謝

2.1 微生物中EGT 的降解代謝

本文1.2 敘述了組氨酸甜菜堿是EGT 生物合成的直接前體，但它是否為EGT 的降解產(chǎn)物?Neufeld 等［24］研究發(fā)現(xiàn)EGT 分子中的硫原子可被來自稻瘟病菌(Piricularia oryzae)和云芝(Polyporus versicolor)中的硫氧化酶氧化，氧化產(chǎn)物并不知曉，但如果這個氧化反應(yīng)與EGT 的化學(xué)反應(yīng)類似，則產(chǎn)物應(yīng)該是組氨酸甜菜堿。Yanasugondha 等［25］研究了糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)中EGT 的降解代謝，EGT 被降解成三甲胺和巰基咪唑丙烯酸。

2.2 EGT 在哺乳動物體內(nèi)的代謝與分布

藥物代謝動力學(xué)分析表明，向老鼠靜脈注射EGT 后，EGT 迅速地由血液流向組織，主要流入肝臟和腎臟，即使肝、腎被切除也不會改變流向［9］。Wolf 等［26］將含有α-14C 的EGT 注入老鼠體內(nèi)，研究其代謝產(chǎn)物及分布，結(jié)果表明6 h 內(nèi)EGT 發(fā)生分解，僅有0.14%的EGT 生成CO2，而相同條件下注入等量的［α-14C］組氨酸，發(fā)現(xiàn)4 h 內(nèi)即會有12% 的［α-14C］組氨酸生成CO2。此外，約6 h 后肝臟中2%～6%的EGT 轉(zhuǎn)化為合成蛋白質(zhì)所需的氨基酸，而肝臟中非蛋白成分的放射能則非常高，約為EGT注射劑量的17%～31%，因此肝臟是EGT 代謝的主要場所，EGT 在代謝過程中首先聚集于肝臟，隨后降解成組氨酸甜菜堿，再進(jìn)一步發(fā)生分解。由此推測EGT 的主要代謝反應(yīng)是首先脫去巰基，Heath［27］證實(shí)了此推測，他在研究含35S 的EGT 在老鼠體內(nèi)的降解過程中發(fā)現(xiàn)，尿液中35%的35S 以硫酸鹽的形式存在。

經(jīng)受長期禁食的老鼠，其組織中仍含有EGT，Kawano 等［28］證實(shí)了EGT 在老鼠體內(nèi)的半衰期大概為一個月。Potter 等［29］對老鼠進(jìn)行了限制EGT 供給量的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)老鼠的尿液和糞便中均不含EGT，并且每天還會進(jìn)行適量地吸收與積累。一只225 g 的老鼠每天可積累20 μg EGT，相對僅消耗2 μg，累積率達(dá)90%。據(jù)此計(jì)算，對于一個150 英鎊的成年人，每天積累約6 mg 的EGT。Paul 等［30］證實(shí)了關(guān)于EGT 的低代謝率和高積累率部分是由腎臟對EGT 的強(qiáng)吸收所造成。

Heath［27］研究了老鼠、兔子、狗和貓?bào)w內(nèi)的EGT代謝分布，發(fā)現(xiàn)EGT 主要分布于肝臟、紅細(xì)胞和腎臟等組織。表1 是EGT 在四種動物組織中的分布［9］。

表1 麥角硫因在幾種動物組織中的分布Table 1 Concentrations of ergothioneine in different animal tissues

數(shù)據(jù)顯示，EGT 在不同的動物或同一動物的不同組織中分布顯著不同，說明組織的功能與對EGT的需求相關(guān)。

3 結(jié)語

綜上所述，組氨酸是麥角菌、粗糙鏈孢霉和分支桿菌等微生物中合成EGT 的前體。在粗糙鏈孢霉和分支桿菌中，組氨酸先經(jīng)甲基化作用生成組氨酸甜菜堿，再由組氨酸甜菜堿合成EGT，其中在EGT的合成過程中甲基轉(zhuǎn)移酶和Fe2+依賴性氧化酶起到了重要的催化作用。蛋氨酸參與了麥角菌和粗糙鏈孢霉中EGT 的生物合成。半胱氨酸等含硫氨基酸和硫代硫酸鹽等含硫化化合物作為巰基供體參與了粗糙鏈孢霉中EGT 的合成。在糞產(chǎn)堿菌中EGT降解生成三甲胺和巰基咪唑丙烯酸。在哺乳動物體內(nèi)，EGT 首先脫去巰基生成組氨酸甜菜堿，再進(jìn)一步降解。

鑒于EGT 獨(dú)特的生理活性和應(yīng)用價(jià)值，EGT 具有廣闊的市場前景，隨著研究的深入，可能開發(fā)EGT 在一些特殊領(lǐng)域中的應(yīng)用。由于食用蕈菌菌絲體中EGT 的含量較高，利用新型工業(yè)發(fā)酵技術(shù)易實(shí)現(xiàn)大規(guī)?？煽厣a(chǎn)，是EGT 商業(yè)化綠色生產(chǎn)的主導(dǎo)方向。蕈菌中EGT 生物合成途徑的研究，將為EGT 的代謝調(diào)控及高強(qiáng)度生物合成研究提供理論依據(jù)。

本文作者利用食用蕈菌菌絲體液體發(fā)酵制備EGT，通過添加外源氨基酸等營養(yǎng)因子大幅度地提高了EGT 的代謝積累量，搖瓶發(fā)酵水平超過190 mg/L。相信隨著生產(chǎn)成本的下降，EGT 必將適應(yīng)更廣闊的應(yīng)用需求。

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