高效液相色譜法測定延胡索藥材中7 種異喹啉類生物堿的含量

趙新娟，沈 梅，石俊敏，韓偉立*

1山西省晉中市第一人民醫(yī)院藥劑科，晉中 030600;2 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院 衛(wèi)生檢測中心，廣州 510515;3 華南師范大學(xué)藥物研究院，廣州 510632

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索(Corydalis yanhusuoW.T.Wang)的干燥塊莖，其具有活血、利氣和止痛的功效。臨床上主要用于治療胸脅、脘腹疼痛、經(jīng)閉痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻和跌打腫痛等癥［1］。在2010年版《中國藥典》中，接近30%的復(fù)方制劑中使用了延胡索［2］。建立全面有效的延胡索藥材質(zhì)量評價方法，直接關(guān)系到延胡索相關(guān)藥品及臨床處方使用安全及療效。

現(xiàn)代藥理研究表明，延胡索中主要活性成分為異喹啉類生物堿，目前延胡索的質(zhì)量控制多以異喹啉類生物堿四氫巴馬汀作為主要指標(biāo)，具體方法包括化學(xué)發(fā)光法、紫外分光光度法、高效液相色譜法及質(zhì)譜法等［3-6］。然而，延胡索中除四氫巴馬汀外，其它異喹啉類生物堿也具有顯著的生理活性且含量較大，如小檗堿具有抗腫瘤作用［7］，四氫黃連堿具有抗焦慮作用［8］等。顯然用單一成分(四氫巴馬汀)很難全面控制延胡索藥材的內(nèi)在質(zhì)量。延胡索多組分質(zhì)量控制在國內(nèi)亦有相關(guān)報道，其中周卿［9］等對延胡索中四種生物堿，高建莉［10］等對延胡索中五種生物堿的含量進(jìn)行了多組分質(zhì)量控制研究的嘗試，而針對更多活性組分的質(zhì)量控制研究，在國內(nèi)文獻(xiàn)上報道相對較少。因此，本課題組在前期對延胡索化學(xué)成分研究的基礎(chǔ)上［11］，利用高效液相色譜法對延胡索藥材中含量較大的7 種異喹啉生物堿類成分(巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿、四氫巴馬汀、異紫堇球堿、紫堇堿及四氫黃連堿)進(jìn)行了定性及定量分析，并分別考察了不同購買地延胡索藥材中7 種生物堿的含量，以期為延胡索原藥材較為合理的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Waters 高效液相色譜儀(Waters Corp.，USA)，包括2695 型分離色譜系統(tǒng)和2996 型光電二極管矩陣檢測器。加熱回流裝置BUCHI Syncore 系統(tǒng)(BUCHI Corp.，German)。所用乙腈、冰醋酸和三乙胺均為色譜純(Merck Corp.，USA)，水為超純?nèi)ルx子水(Millipore Corp.，USA)。巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿、四氫巴馬汀、異紫堇球堿、紫堇堿和四氫黃連堿對照品均為自制［11］，純度均高于96%。市售延胡索藥材分別購于浙江、安徽、陜西及廣東，由山西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定室王兵鑒定為延胡索(Corydalis yanhusuoW.T.Wang)的干燥塊莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的制備

取0.5 g 干燥延胡索藥材粉末(過60 目篩)，精密稱定，加入濃氨試液-甲醇(1 ∶20)混合溶液50 mL，稱定重量，冷浸1 h 后加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用濃氨試液-甲醇(1∶20)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑，殘渣加甲醇溶解，定容至5 mL。用0.45 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿、四氫巴馬汀、異紫堇球堿、紫堇堿和四氫黃連堿標(biāo)準(zhǔn)品4.01、3.95、10.13、9.98、4.12、10.01 和3.97 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得濃度為0.401 mg/mL 的巴馬汀，0.395 mg/mL 的小檗堿、1.013 mg/mL 的去氫紫堇堿、0.998 mg/mL 的四氫巴馬汀、0.412 mg/mL 的異紫堇球堿、1.001 mg/mL 的紫堇堿和0.397 mg/mL 的四氫黃連堿混合對照品儲備溶液。

2.3 液相色譜條件

色譜柱:Agilent SB C18柱(4.6 × 250 mm，5(m);保護(hù)柱:Agilent SB C18柱(4.6 ×12.5 mm，5(m);流動相:乙腈(A)，0.1%的醋酸水溶液(三乙胺調(diào)pH 至5.0)(B)，采用梯度洗脫方式:0～18 min，30% A;18～35 min，30%～80% A;35～40 min，80% A;40～42 min，80%～30% A;42～45 min，30% A。流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃。藥材樣品中各定量成分與標(biāo)準(zhǔn)品生物堿成分色譜峰保留時間一致，紫外譜圖一致。色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)和延胡索樣品(B)的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mix standard (A)and C.yanhusuo sample (B)

2.4 線性關(guān)系考察

吸取“2.2”項中混合對照品儲備溶液，甲醇分別稀釋10、20、40、80、100、200 倍，按照2.3 項下色譜條件進(jìn)行分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表1。

表1 7 個異喹啉生物堿的線性方程Table 1 Calibration curve and linear ranges of the 7 investigated isoquinoline alkaloids

2.5 精密度試驗

2.5.1 日內(nèi)精密度試驗

取混合對照品溶液，按樣品測定項下色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，重復(fù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果顯示巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿、四氫巴馬汀、異紫堇球堿、紫堇堿和四氫黃連堿峰面積的RSD 分別為0.29%、0.17%、0.24%、0.24%、0.70%、0.45%和0.17%。

2.5.2 日間精密度試驗

取混合對照品溶液，連續(xù)3 日，每日連續(xù)進(jìn)樣2針，測定結(jié)果顯示巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿、四氫巴馬汀、異紫堇球堿、紫堇堿和四氫黃連堿峰面積的RSD 分 別 為0.45%、0.29%、0.37%、0.27%、1.83%、0.33%和0.28%。以上結(jié)果表明色譜系統(tǒng)穩(wěn)定，儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

精密稱取6 份相同的延胡索樣品粉末，按照樣品測定項下方法進(jìn)行測定，得到相應(yīng)的峰面積并計算含量，結(jié)果顯示巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿、四氫巴馬汀、異紫堇球堿、紫堇堿和四氫黃連堿成分含量的RSD 分別為3.41%、3.51%、3.59%、2.88%、3.75%、1.60%和3.48%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性好。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取混合對照品溶液，進(jìn)樣量為10 (L，分別于0、2、4、6、8、10 h 在樣品測定項下方法進(jìn)行測定，計算峰面積RSD，結(jié)果顯示巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿、四氫巴馬汀、異紫堇球堿、紫堇堿和四氫黃連堿樣品峰面積RSD 分別為0.23%、0.14%、0.18%、0.34%、0.56%、0.59%和0.26%。表明試樣溶液在10 h 內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.8 加樣回收率實驗

精密稱取0.50 g 的9 份已知含量的延胡索藥材粉末，加入低、中、高3 個濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(其中中濃度相當(dāng)于7 種待測生物堿在藥材中的實際含量)，具體數(shù)據(jù)見表1，按“2.1”項中方法制備供試品溶液，再按“2.3”相中色譜條件進(jìn)樣測定，計算含量及加樣回收率結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率(n=3)Table 2 Results of recovery tests (n=3)

2.9 樣品測定

取不同來源［安徽合肥(A)、浙江杭州(B)、陜西寶雞(C)、廣東珠海(D)］延胡索藥材制備定量供試品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法計算供試品中各生物堿含量，結(jié)果見表3。

表3 不同購買地延胡索中7 種異喹啉生物堿的含量Table 3 Determination 7 isoquinoline alkaloids in C.yanhusuo from different purchase places

3 討論與結(jié)果

本文在優(yōu)化流動相過程中，考察了甲醇-水和乙腈-水系統(tǒng)，分別加入醋酸、醋酸銨、醋酸和三乙胺等;同時還對不同pH 值(pH 4.5、5 和6)及不同醋酸濃度(0.1%和0.2%)的分離效果進(jìn)行了測試。其中乙腈-0.1% 的醋酸水溶液(三乙胺調(diào)pH 至5.0)系統(tǒng)效果最好，此外，等度洗脫不能達(dá)到7 種異喹啉生物堿的基線分離，故采用了梯度洗脫。從色譜圖看，各個色譜峰均能得到很好的分離。

本文利用建立的分析方法對不同購買地市場延胡索藥材中巴馬汀、小檗堿、去氫紫堇堿、四氫巴馬汀、異紫堇球堿、紫堇堿及四氫黃連堿的含量進(jìn)行了測定。實驗結(jié)果顯示，《中國藥典》2010 版中延胡索含量測定的指標(biāo)化合物四氫巴馬汀所占藥材生物堿含量在不同購買藥材中并非含量最高(去氫紫堇堿及紫堇堿含量較四氫巴馬汀高)，此外不同市場藥材中7 種異喹啉生物堿的含量存在較大的差異。因此單一使用四氫巴馬汀作為延胡索的質(zhì)量控制指標(biāo)是不妥的，建議對延胡索藥材采用多指標(biāo)質(zhì)量控制。

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