CCL2在變應性鼻炎患者鼻黏膜組織中的差異表達*

葉實明關兵徐英冀德君

·研究生園地·

CCL2在變應性鼻炎患者鼻黏膜組織中的差異表達*

葉實明1關兵1徐英2冀德君2

目的探討趨化因子CCL2在變應性鼻炎發(fā)病過程中的作用。方法參照變應性鼻炎評定標準，留取2例變應性鼻炎手術者部分下鼻甲組織及1例正常鼻甲組織作為對照，進行RNA轉錄組測序，并進行差異表達分析。結果與正常對照組相比，趨化因子CCL2表達上調，其所參與KEGG通路中相關聯基因表達上調的主要有：CXCL12、CXCL14、IL-6及EGF；涉及的主要信號通路有細胞因子與受體作用、趨化因子信號傳導及NOD樣受體信號通路等；相關的下調基因主要有：CXCL9、IL-8、AP1及LIF等，涉及的主要信號通路有B細胞、T細胞受體信號等通路，相關差異基因多與炎性及細胞生長增殖等反應有關。結論CCL2在變應性鼻炎患者鼻黏膜中表達增強，可能是變應性鼻炎發(fā)病及向鼻息肉增生轉變的主要因素。

變應性鼻炎；趨化因子CCL2；差異表達；鼻息肉

變應性鼻炎（allergic rhinitis,AR）是一種發(fā)病廣泛、呈全球蔓延的鼻腔變態(tài)反應疾病，嚴重困擾著人們生活、工作和學習，影響全球約30%的成人和40%的兒童[1]。AR屬于IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應，致病原因主要涉及環(huán)境及遺傳兩個方面。趨化因子CCL2是第一個被鑒定出的CC類趨化因子，其分子結構包括23個氨基酸組成的信號肽和76個氨基酸組成的成熟肽。最初對CCL2的研究主要是針對其對粒細胞趨化作用，但隨著研究的深入，發(fā)現在變態(tài)反應、腎病、炎性腸病、免疫缺陷性疾病、血腦屏障通透性相關疾病、動脈粥樣硬化和腫瘤等疾病過程中都發(fā)揮重要作用，而目前尚未見以RNA轉錄組測序手段探究CCL2在AR發(fā)病中作用的研究報道。本研究進行RNA轉錄組測序，根據樣本的各基因表達情況，進行差異表達分析，對照在線數據庫，獲得相應基因的注解，通過進一步分析各趨化因子基因與其它主要的AR應答基因之間的關聯性，探討趨化因子CCL2在AR發(fā)病中的作用機制。

材料與方法

1 一般資料

收集2014年1月至2014年3月，在江蘇省蘇北人民醫(yī)院耳鼻咽喉科住院行手術治療的AR患者2例（男女各1例，年齡分別為43歲和46歲），診斷按照“2009年武夷山指南”[2]。另選取行單純鼻中隔偏曲矯正的患者1例（男，48歲）為對照組。全部病例術前詳細詢問病史，行鼻內鏡檢查了解黏膜有無蒼白水腫、有無鼻息肉，行變應原皮膚點刺試驗檢測致敏原。本研究取材在取得患者本人知情同意的前提下進行，術前3周內均未用抗組胺藥及皮質類固醇激素等藥物。

2 標本收集

AR標本2例，患者除AR癥狀外不伴有其它鼻部疾病，術中在鼻內鏡直視下鉗取少許下鼻甲黏膜組織。對照組1例，術中在鼻內鏡直視下鉗取部分下鼻甲黏膜組織。取下的標本組織去除血跡后，放入凍存管后并立即置于液氮中，后轉入—70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3 實驗方法

3.1 總RNA提取

分別取AR患者及對照者下鼻甲冰凍組織約100mg，運用Trizol法提取組織總RNA，步驟如下：將組織放入預冷的研缽中徹底研碎呈粉末狀，加入Trizol試劑，勻漿液靜置后按照5∶1比例加入氯仿室溫靜置后離心15min，取上層水相置于新離心管中，按2∶1比例加入異丙醇室溫靜置再次離心10min，棄上清，加入等量的75%乙醇進行洗滌，渦旋混合后離心5min，棄上清，讓沉淀的RNA在室溫下自然干燥（5~10min），用RNase-free water溶解RNA沉淀，將提取好的總RNA經檢測合格后，放置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 RNA序列測定及分析

按照Illumina公司提供的標準操作程序執(zhí)行，包括樣本制備實驗和測序實驗，實驗中保證每個樣品測序產生不少于5M的原始reads序列，保證Q30達到80%，并將reads序列與參考基因序列的比對分析，使用Bowtie軟件將各樣品測序得到的reads與物種Unigenes進行比對，在比對過程中，對于比對到多個位置的情況，則會輸出前200個比對結果。然后根據比對信息并利用Cufflinks/RSEM[3]進行表達量水平估計。最后，利用RPKM值[4]（Reads Per Kb per Million reads）來反映對應Unigenes的表達豐度，RPKM能消除基因長度和測序量差異對計算基因表達的影響，通過RPKM量化基因的表達水平，計算得到的基因表達量可直接用于比較不同樣品間的基因，進而篩選出有差異表達的基因。檢測差異表達基因時，以樣品類型為依據選取合適的差異基因分析軟件，DESeq[5]適用于有生物學重復的樣品進行差異表達基因的篩選，對于沒有生物學重復的樣品選擇EBSeq[6]進行差異表達分析。在差異基因篩選中，選取FDR＜0.01且Flod Change≥2作為標準。這里FDR（False discovery rate）表示錯誤發(fā)現率，它是通過對P值進行校正得到的。因為RNASEQ中的差異基因分析是對大量的基因進行獨立的統計假設檢驗，它會導致總體假陽性偏高的問題，故在差異軟件進行差異分析過程中，我們都會采用Benjamini-Hochberg校正方法對原有假設檢驗得到的P值進行校正，最終采用FDR作為差異基因篩選取的關鍵指標。

3.3 基因功能比對注釋

使用BLAST[7]軟件對差異表達基因序列與KEGG[8]數據庫進行比對，獲得差異表達基因的注釋信息。

結果

本實驗其中一例AR患者獲得差異表達基因376條，與對照組相比較，AR組253條基因至少上調2倍，123條基因下調至少50%；另一例AR患者獲得差異表達基因659條，與對照組相比較，AR組274條基因至少上調2倍，385條基因下調至少50%（表1）。

表1 樣品間的差異表達基因數目統計表

進一步將差異表達基因與KEGG數據庫對比分析（圖1），得出趨化因子CCL2及其參與的KEGG通路中相關上調表達基因主要有：CCL2、CXCL12、CXCL14、IL-6和EGF，涉及的主要信號通路有細胞因子及受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、趨化因子信號通路（chemokine signaling pathway）及 NOD樣受體信號通路（NOD-like receptor signaling pathway）；相關的下調基因主要有：CXCL9、IL-8、AP1和LIF等，涉及的主要信號通路有B cell、T cell受體信號通路等，相關差異基因多與細胞生長、增殖及免疫等炎性反應有關。

圖1 差異基因KEGG富集散點圖

而且，對照基因表達量表我們得出，在細胞因子及受體相互作用通路中各差異表達因子對應的基因編碼及其RPKM值（表2），根據各分組RPKM值得出細胞因子差異表達對比圖（圖2）。

表2 細胞因子及受體相互作用通路中各差異表達因子及對應RPKM值

圖2 細胞因子及受體相互作用通路中細胞因子差異表達情況對比表中E1為對照組，E2和E3為AR組

表2和圖2中顯示CCL2、IL-6和EGF均顯示表達上調，且其中一例AR患者（E3組）CXCL12及CXCL14表達也增強，提示CCL2、CXCL12、CXCL14及IL-6的mRNA量比對照組增高，而CXCL9、IL-8及LIF均顯示表達下調，提示CXCL9、IL-8及LIF的mRNA量比正常對照組下降。

同時，結合基因表達量表與KEGG數據庫對比分析結果，CCL2、IL-6及IL-8等在NOD樣受體信號通路中也存在差異表達，各差異表達因子對應的基因編碼及其RPKM值（表3），根據各分組RPKM值我們得出細胞因子差異表達對比圖（圖3）。

表3 NOD樣受體信號通路中各差異表達因子及對應RPKM值

圖3 NOD樣受體信號通路中細胞因子差異表達情況對比表中E1為對照組，E2和E3為AR組

以上表3和圖3中顯示CCL2和IL-6表達均上調，而其中一例AR患者（E2組）同時伴有IL-8的表達下調，另一例（E3組）則伴有JNK的表達下調。

討論

CCL2原名為單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1），目前已經發(fā)現的單核細胞趨化蛋白還有4種，分別為MCP-2（CCL8）、MCP-3（CCL7）、MCP-4（CCL13）及MCP-5（CCL12），而與AR有關的主要是MCP-1、MCP-3、MCP-4及Christodou1opou1os等[9]。用免疫組織化學方法發(fā)現MCP-1、MCP-3和MCP-4在鼻黏膜的表達定位于上皮細胞內。在鼻黏膜刺激實驗前后MCP-3和MCP-4的表達有顯著差異，而MCP-1差異不明顯，鼻黏膜上皮中MCP-1表達細胞主要是單核巨噬細胞，其次是T細胞和嗜堿粒細胞。Fujikura等[10]發(fā)現組胺能誘導AR患者鼻黏膜中CCL類趨化因子（包括MCP-1、MCP-3、Eotaxin、RANTES）的表達，提示可能存在一個組胺-MCPs軸，在AR發(fā)病中起著重要作用。變應原刺激局部鼻黏膜后，產生的包括MCPs在內的各種趨化因子增加，誘導各種炎性細胞（如單核巨噬細胞、嗜酸性粒細胞等）在鼻黏膜及黏膜下聚集，當再次受到變應原刺激后產生大量的以組胺為主的炎性遞質，導致鼻黏膜變態(tài)反應發(fā)生，同時也誘導產生更多的趨化因子（MCPs等），從而形成一個惡性循環(huán)，使AR癥狀的加重和反復的發(fā)作。

細胞因子及受體相互作用滲透到AR的多個環(huán)節(jié)，如Thl/Th2失衡及二大類細胞因子的相互調節(jié)、AR的致敏及激發(fā)階段。在這個過程中，本研究的IL-6高表達、IL-8的低表達與Thl/Th2失衡學說中Th2類細胞因子優(yōu)勢表達相符合，EGF是一類廣泛存在于人和動物體內、可促進或抑制多類細胞生長的多肽。國內有關研究提示[11]，EGF可促進鼓膜纖維層血管增生以促進鼓膜穿孔的愈合。有研究[12]發(fā)現，EGF和EGFR在慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻竇黏膜中均有明顯表達。本實驗組中EGF和CCL2等因子的高表達提示AR與鼻息肉可能存在一定相關性。

Bogefors等[13]研究發(fā)現，在人類鼻腔中存在三種NOD樣受體（Nodl、Nod2和Nalp3）。AR患者在花粉過敏季節(jié)，Nodl和Nalp3的表達下調，而Nod2的表達無差異。Shin等[14]通過AR動物模型實驗證明，Nodl的配體可以增強變應原特異性Th2的應答，但Th2細胞因子對Nodl的表達卻有抑制作用。本次實驗通過RT-PCR檢測提示，與對照組比較，AR患者鼻甲組織中CCL2的mRNA表達量顯著增加，進一步對照KEGG在線數據庫結果提示在趨化因子CCL2參與的NOD樣受體信號通路，同時伴有Th2類細胞因子IL-6表達上調，其中一例AR患者顯示JNK及Th1類細胞因子IL-8表達下調。我們推測，CCL2參與AR的發(fā)病過程，可能在NOD樣受體信號通路中起某種作用。

CXCL12又名SDF-α/β，其受體是 CXCR4。CXCL12與CXCR4相互作用形成CXCL12/CXCR4軸，在AR發(fā)病中起著一定的作用。Gonzalo等[15]通過對鼠科動物的研究發(fā)現如下證據支持CXCL12/ CXCR4軸與變應性氣道疾病相關：①變應性炎癥的嚴重程度與CXCR4細胞數量存在相關性；②應用抗CXCR4抗體或抗CXCL12抗體都能抑制變應性炎癥反應；③變應性氣道疾病局部的白細胞中存在CXCR4的過度表達。而Eddleston等[16]研究人變應性氣道疾?。ㄏ癆R）中CXCL12/CXCR4軸的作用，發(fā)現CXCL12和CXCR4在疾病發(fā)病期患者鼻黏膜及肺的Ⅱ型呼吸上皮中的表達都比正常人明顯增高，說明CXCL12/CXCR4軸在人類變應性氣道疾病的發(fā)病中很可能也起著重要作用。

CXCL14是趨化因子CXC家族的一個新成員，最早是由Hromas于1999年從人類乳腺和腎臟組織中分離克隆出來的，定位于染色體5q31。CXCLl4在正常組織中主要表達于表皮、腎臟、小腸和肝臟，近年學者們發(fā)現其在多種腫瘤細胞及組織中表達異常，且其表達存在組織特異性[17]。

同時，我們也注意到，對于在同類研究中多次報道的嗜酸粒細胞的特異性趨化因子Eotaxin及另一種對嗜酸粒細胞和T淋巴細胞都有趨化作用的趨化因子RANTES（CCL5）在本次試驗過程并未出現陽性結果，可能與實驗標本采取部位、實驗中男女對照陽性標準不同、病變的個體差異及AR本身復雜的發(fā)病機制有關，對此值得進一步探討。

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（收稿:2015-03-12）

10.16542/j.cnki.issn.1007-4856.2015.02.015

江蘇省社會發(fā)展項目（BE2012706）；揚州市2012科技攻關項目（YZ2011055）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程項目

1 揚州大學臨床醫(yī)學院 江蘇省蘇北人民醫(yī)院耳鼻咽喉科（揚州，225009）

2 揚州大學動物科學與技術學院

關兵，主任醫(yī)師. Email: aliceguan0685@sina.com