一種離心式微流控生化分析芯片

戴永輝陳 坦王戰(zhàn)會

1(廣東省中醫(yī)院檢驗科 廣州 510120)

2(天津微納芯科技有限公司 天津 300457)

3(中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055)

一種離心式微流控生化分析芯片

戴永輝1陳 坦2王戰(zhàn)會3

1(廣東省中醫(yī)院檢驗科 廣州 510120)

2(天津微納芯科技有限公司 天津 300457)

3(中國科學院深圳先進技術研究院 深圳 518055)

文章介紹了一種低成本、快速、自動化的離心式微流控生化分析芯片。該芯片通過整合樣本前處理和多生化指標檢測，采用了多級微流道與虹吸微閥相結合的方式把樣本的前處理、樣本輸送、樣本與生化試劑反應等過程集成于一體，并通過比色檢測獲得各個生化檢測項目的結果。實驗結果顯示芯片比色孔光程的精密度的變異系數(shù)在 0.08%～0.52%，通過血糖結果的精密度評估的芯片對樣本和稀釋液定量以及兩者混合的精密度變異系數(shù)為 1.4%，同時使用芯片測定 15 個生化項目的日間和批內精密度均小于 3.5%，這表明該離心式微流控生化分析芯片符合臨床檢測要求。

微流控芯片；生化分析；床旁診斷

1 引 言

近年來微流控芯片技術迅速發(fā)展，微流控分析芯片已經開始從基礎與應用基礎研究階段進入深度產業(yè)化及市場開發(fā)階段[1,2]。微流控芯片技術具有消耗試劑少、檢測速度快、容易集成等優(yōu)點[3,4]。微流控芯片技術的迅速發(fā)展，促進了即時檢驗(Point-of-Care Testing，POCT)技術的進一步發(fā)展。1995 年，在加利福尼亞召開的美國臨床化學協(xié)會年會展覽會上辟出一個特殊的展區(qū)，專門展示最新 POCT 技術與設備，帶給所有參觀者以嶄新的概念。2006 年中國 POCT 委員會籌建，2007 年起中國 POCT 高峰論壇每年舉辦一次。中華醫(yī)學會檢驗分會主任委員叢玉隆教授認為：“在未來 5～10 年內，POCT 應該達到檢查方法的 70%～80%，基本改變目前的檢驗格局”。

POCT 技術的發(fā)展使其應用領域不斷擴展，從最初的隱血、血糖、尿糖檢測發(fā)展到醫(yī)學檢驗的各個方面[5-8]。POCT 快速便捷，能隨時隨地對患者進行檢測，且一般只需少量樣本即可在數(shù)分鐘內獲得檢測結果。檢測時間短，可快速報告結果，極大地方便了患者和一些特殊人群的需要，尤其重要的是能夠對急診的危重患者實施更加及時地搶救和治療[2,6]。POCT 診斷的一個重要發(fā)展方向是整合取樣、檢測、校準和報告于一體的微型化、集成化的芯片實驗室技術[9]。微流控分析芯片已經廣泛應用于生化分析、免疫分析、蛋白分析以及核酸檢測等臨床檢測的各個方面。在生化檢測方面，Lee 等[6]研制的生化及免疫分析微流控分析芯片實現(xiàn)了對相關項目的快速、低成本檢測；方群等[10]研制了一種激光誘導熒光檢測微流控分析芯片也實現(xiàn)了對有關項目的便捷、低成本檢測。但這兩款芯片都尚未進行相關的臨床應用研究。在本研究中，操作者將待測樣本添加到試劑芯片中，并將其置于 Celercare M1 分析儀上進行檢測。通過毛細管作用和檢測芯片轉動時的離心力，芯片會將未計量的血液樣本轉換成多等份精確稀釋的血漿，并通過反應孔的光學檢測同時進行多種化學成分的分析。本研究從芯片檢測原理、臨床項目檢測等方面來探討該微流控分析芯片臨床應用的可行性。

2 材料和方法

2.1 生化分析芯片

檢測芯片是一種直徑為 7 cm 且包含檢測所需的凍干試劑的一次性使用芯片。該芯片由兩個注塑成型的塑料部件通過超聲焊接而成。芯片基底和上蓋均由聚甲基丙烯酸甲酯塑料經模塑成型制成。經焊接的基體和上蓋構成的芯片包括樣本槽、稀釋液槽、定量槽、混合槽、廢液槽、液流通道以及比色孔等結構(如圖 1)，它們可對液體進行處理控制。

圖 1 檢測芯片F(xiàn)ig. 1 Microfluidic chip for assay

每個模塑生產的試劑芯片中包含 30 個圓柱形小孔，小孔中可存放凍干試劑小球，樣本進入小孔之后發(fā)生生化反應，檢測時小孔作為比色孔使用。每個芯片包含 23 個能填充稀釋血漿的反應比色孔和 4 個填充稀釋液的比色孔。反應比色孔有 6 種不同的深度，分別為 0.5 mm、1.7 mm、2.1 mm、3.1 mm、4.3 mm 和 5.0 mm，以適應不同試劑的敏感性和分析物的濃度。在生產試劑芯片時，將各生化檢測項目相應的凍干試劑裝入芯片的比色孔中。

2.2 芯片檢測過程

使用該芯片進行檢測時，無需對樣本進行離心等預處理即可進行檢測，因而血清、血漿或全血都可用于檢測。通常經靜脈穿刺獲得全血樣本可在采集后 60 min 內進行分析，而指尖末梢血樣本則應在采集后立即進行分析。使用移液器將樣本和稀釋液分別經芯片的樣本孔和稀釋液孔加入至芯片的樣本槽和稀釋液槽中。 其中，檢測所用的稀釋液為蒸餾水。添加樣本和稀釋液時操作者不必準確計量樣本：通常最少需添加 90 μL 樣本和 450 μL 稀釋液，最多可向芯片中添加 120 μL樣本和 600 μL稀釋液，如圖 2。

圖 2 加入樣本(紅色)和稀釋液(藍色)Fig. 2 Adding sample (red) and diluent (blue)

加樣后操作者可將芯片放入 Celercare M1 分析儀的檢測倉中。檢測倉關閉，芯片裝載至分析儀主軸上固定，接下來儀器會對樣本和稀釋液進行處理。分析開始時，分析儀會使芯片沿逆時針方向加速至 5000 rpm，并以該速度保持 2 min。離心力會使稀釋液從稀釋液槽進入稀釋液定量槽。該定量槽徑向最外側的微流通道使稀釋液以受控的方式填充該定量槽。325.75 μL 稀釋液即可完全填充稀釋液定量槽。剩余的稀釋液會溢出稀釋液定量槽，并經通道順序填充 4 個比色孔，而最終剩下的稀釋液則流入與芯片的其余部分隔離的廢液槽中。這 4 個比色孔用于內部芯片的質量控制。

在稀釋液定量的同時，離心力會使樣本流出樣本槽，并經芯片上的 U 形微流通道流入樣本定量槽。完全充滿樣本定量槽需要 17.5 μL 樣本，其余樣本將溢流進入“樣本充足”比色孔中。多余的樣本則會被阻隔在分離的樣本廢液槽中。如果在“樣本充足”比色孔中沒有檢測到樣本，則檢測分析會因樣本量不足而中止；如果所添加的樣本為全血，則通過離心力，可使樣本定量槽中定量的全血的血漿和紅細胞分隔開來。大多數(shù)樣本僅需 30 s 即可被充分分離。為了提供檢測所需的 20 μL 左右的澄清血漿，血細胞比容更高的樣本需要的分離時間更長。通常芯片旋轉 2 min 足以分離血細胞比容高達 60%的樣本，如圖 3 和圖 4。

圖 3 芯片旋轉開始分離血細胞、血漿定量及稀釋液定量Fig. 3 Blood cells separating, plasma and diluent metering

圖 4 完成分離血細胞(紅色)、血漿(黃色)定量及稀釋液定量Fig. 4 Blood cells (red) separating, plasma(yellow) and diluent metering completed

下一步是混合稀釋液和血漿。兩個毛細管大小的虹吸入口分別位于稀釋液定量槽的徑向最外側點處和樣本定量槽的旁路下方位置。在芯片第一次旋轉期間，這兩個虹吸管都沒有填充液體，因為向外的離心力遠遠大于向內的毛細作用力。分離步驟結束后，試劑芯片停止旋轉，則虹吸微閥產生的毛細力會牽拉液體通過 U 形微流通道，兩個微流通道的出口通向芯片混合槽。

既然是求E點的坐標，理所當然想到過點E作ES⊥x軸，垂足為S，則問題轉化為求ES與AS的長，易知△ASE為等腰直角三角形，即ES=AS，所以問題轉化為求FS的值．由正方形的特征想到延長SE交CD于點R，易證△ESF≌△DRE且△REC也為等腰直角三角形，則FS=ER=CR=BS=1，所以點E的坐標為(3，3)．依此類推，求M坐標自然要過點M作MK⊥x軸，垂足為K，則需求FK與MK的值．由△ESF≌△DRE想到ED=EF，即△DEF為等腰直角三角形，所以∠DFM=

然后，芯片以 5000 rpm 的速度沿順時針方向旋轉，這時稀釋液定量槽會被完全清空。因為U 形微流通道的出口離芯片中心的距離比稀釋液定量槽離芯片中心的距離更遠。樣本定量槽排空至血漿定量 U 形微流通道出口處的徑向距離位置。定量的血漿體積是 17.5 μL，其余的血漿和紅細胞被分隔于血漿定量槽的下半部分。

接下來，改變芯片的轉速以混勻混合槽中定量的稀釋液和血漿。芯片轉速急速降至 1000 rpm，再慢慢升至 4000 rpm，這種混合模式重復 12次。急減速提供了足夠的切向力來移動和混勻混合槽中的液體。在混合過程中所需的最低轉速為1000 rpm，目的是確保所施加的離心力超過最后一個 U 形微流通道的毛細作用力。這樣混合能夠防止 U 形微流通道發(fā)生虹吸，直到液體被均勻地混合為止，如圖 5。

圖 5 完成血漿(黃色)和稀釋液(藍色)混合(綠色)Fig. 5 The mix(green) of the plasma (yellow) and diluent (blue)

當混合完全且芯片停止后，通過 U 形微流通道的毛細力引發(fā)虹吸作用。然后再以 3000 rpm的轉速沿順時針方向旋轉芯片 40 s。稀釋的血漿流出混合槽，并進入分離通道，填充 21 個比色孔和隔離的廢液池。其中，21 個比色孔按順序填充，而剩余的稀釋血漿流入廢液池，如圖 6。

圖 6 完成稀釋后的血漿(綠色)進樣Fig. 6 The diluted plasma(green) entering into the cuvettes

各比色孔都有一個單一通道，液流和空氣可經該通道進入和排放。通過電機對芯片的控制，液流從通道入口的一側向下流，空氣則從另一側排出。液流束的大小可通過虹吸的阻力、芯片的旋轉速度和其余流體前端的壓力來進行控制。同時芯片必須旋轉得足夠快，以克服通道入口(寬0.50 mm 和高 0.14 mm)的毛細力。芯片的每個比色孔中含有一個或兩個適合于特定檢測項目的凍干試劑小球，這些小球在稀釋血漿填充比色孔時隨即完全溶解。

所有的比色孔充滿之后，過量的稀釋血漿被分隔于廢液池中，并使芯片從 1000 rpm 順時針方向旋轉變?yōu)?1000 rpm 逆時針方向旋轉，持續(xù)60 s。這種混合會在比色孔中形成漩渦模式，它能夠使試劑和稀釋液充分混合，并完成生物化學反應，如圖 7。

分析儀的分光光度計通過與芯片旋轉同步閃爍的氙燈來監(jiān)測所有比色孔中的反應，持續(xù)時間為 3.5 min。同時分析儀通過感測芯片比色孔間 45 度楔形件來對比色孔進行定位。每次旋轉時，處理器會選擇對特定的比色孔進行曝光，同時選擇特定的波長進行測定。

圖 7 稀釋血漿和試劑混合并完成生化反應Fig. 7 The mix of diluted plasma and reagents and biochemical reactions fulfilled

3 結 果

3.1 比色孔光程的重復性

3.2 液體定量和混合的精密度

由于光程和儀器所產生誤差是較小的，我們使用芯片在 Celercare M1 分析儀上通過測定英國朗道公司水平 3 質控血清樣本(批號 496UE)血糖結果的精密度來粗略評估芯片對樣本和稀釋液定量以及兩者混合的精密度。使用質控樣本在Celercare M1 分析儀上重復測定 20 次，血糖的平均值為 7.1 mmol/L，變異系數(shù)為 1.4%。

3.3 使用芯片測定生化項目的精密度

在測量過程中誤差的來源包括：血漿定量、稀釋液的定量、血漿和稀釋液混合的均勻程度，試劑和樣本空白比色孔的光程，試劑的不精密度，儀器與儀器間的差異，儀器噪聲以及在分析儀上測定質控品的變化。我們依據(jù) CLSI EP5-A 文件[11]的要求進行精密度試驗，選擇英國朗道公司水平 2 和水平 3 質控血清(水平 2 批號729UN，水平 3 批號 496UE)作為實驗樣本，使用檢測芯片在 Celercare M1 分析儀上對此 2 個水平的樣本重復測定 20 次，計算均值()、標準差(s)和變異系數(shù)(CV)，得到各生化項目批內精密度相關數(shù)據(jù)。對此兩個濃度水平的樣本每天測定1 次，連續(xù)測定 20 天，計算均值、標準差和變異系數(shù)，得到各生化項目日間精密度相關數(shù)據(jù)。我們對 15 項生化檢測項目的精密度進行了測定，包括葡萄糖(GLU)、羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)、乳酸脫氫酶(LDH)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、總蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、總膽紅素(TBIL)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、γ-谷氨酰基轉移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素(UREA)、肌酐(Cr)、尿酸(UA)、膽固醇(CHOL)。各項目的批內精密度和日間精密度結果見表 1。

表 1 檢測芯片測定生化項目批內和日間精密度結果Table 1 The results of within-run and day-to-day precision for biochemical items by microfluidic chip

4 討 論

微流控芯片技術具有消耗試劑少、所需樣本少、檢測時間短、成本低、操作簡便以及易于集成等優(yōu)點[3,4]。該芯片將樣本預處理和檢測過程集成于一體，全血、血清及血漿等樣本都可用于測定。分析時只需將 90 μL 樣本經樣本孔注入含凍干試劑的芯片中，并經稀釋液孔將 450 μL 稀釋液注入芯片中就可進行定量分析。該芯片與便攜式 Celercare M1 分析儀配套使用，10 分鐘左右即能完成同一患者樣本的多項測試，最多可一次性獲得 14 項生化分析結果，操作簡便，檢測效率高，且可以在各種不同場合使用。然而該芯片仍然有需要進一步改進的地方，例如需要手工進樣等。另外該芯片為一次性使用芯片，每次只能檢測一份樣本，因此該檢測芯片不適用于批量標本的快速檢測。

使用芯片進行測定時，芯片本身對測定結果不精密度的影響因素包括不同芯片之間比色孔光程的重復性，以及血漿和稀釋液定量的精密度和兩種液體混合均勻的一致程度。經試驗芯片比色孔光程精密度的變異系數(shù)在0.08%～0.52%。血漿和稀釋液定量和混合的精密度變異系數(shù)小于 2%。

使用英國朗道公司水平 2 和水平 3 質控血清樣本作為實驗樣本，用檢測芯片在 Celercare M1分析儀上測定各生化項目在兩個水平下的批內和日間精密度。結果顯示，15 個生化項目批內精密度的變異系數(shù)在 0.78%～3.45%，而日間精密度的變異系數(shù)在 0.97%～3.43%。這表明使用該芯片用于臨床生化項目的檢測時各項目的精密度符合臨床檢測的要求。

本文從芯片檢測原理、特點以及臨床應用評估等方面介紹了 POCT 生化檢測芯片。該微流控生化芯片與傳統(tǒng)檢驗發(fā)揮各自優(yōu)勢，根據(jù)不同的需要，形成相輔相成的互補形式。隨著芯片實驗室以及家庭診療的日益發(fā)展，相信該微流控芯片未來在臨床檢測領域必有廣闊的應用前景，并推動檢驗醫(yī)學的發(fā)展。

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A Centrifugal Microfluidic Chip for Biochemical Analysis

DAI Yonghui1CHEN Tan2WANG Zhanhui3

1(The Clinical Laboratory of Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine,Guangzhou510120,China)
2(Tianjin Mnchip Technologies Company Limited,Tianjin300457,China)
3(Shenzhen Institutes of Advanced Technology,Chinese Academy of Sciences,Shenzhen518055,China)

In this paper, a low-cost, rapid, automated centrifugal microfluidic chip for biochemical analysis was presented. The chip integrates sample pre-processing and multi-biochemical items assay. Through multi-level microfluidic channels and micro-siphon valves, the chip combines the pre-treatment of samples, sample transportation and the reaction processes between sample and biochemical reagent. The results are obtained by colorimetric detection. It is shown that the reproducibility of cuvette pathlength for chip is from 0.08% to 0.52%. The coefficient of variation (CV) of sample, diluents metering and mixing for chip by the CV of blood glucose results is 1.4%. The CV of day-to-day and within-run precision for 15 biochemical items are less than 3.5%. Therefore, it is concluded that the centrifugal microfluidic chip for biochemical analysis can satisfy the clinical testing requirements.

microfluidic chip; biochemical analysis; point-of-care testing

R 331

A

2014-05-24

：2015-03-17

戴永輝，碩士，研究方向為 POCT 診斷技術及其臨床應用；陳坦，碩士，研究方向為 POCT 微流控生化分析芯片；王戰(zhàn)會(通訊作者)，研究員，博士生導師，研究方向為微流控檢測技術和 POCT 醫(yī)療器械，E-mail：zh.wang@siat.ac.cn。