基于SPR技術(shù)的磺胺二甲氧嘧啶高靈敏檢測(cè)

趙 媛， 徐麗廣， 吳曉玲， 劉麗強(qiáng)， 胥傳來(lái)

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

基于SPR技術(shù)的磺胺二甲氧嘧啶高靈敏檢測(cè)

趙 媛， 徐麗廣， 吳曉玲， 劉麗強(qiáng)， 胥傳來(lái)*

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

磺胺類(lèi)藥物的過(guò)量使用會(huì)對(duì)人體造成過(guò)敏性反應(yīng)，并可能具有致癌性，而磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）在食品中磺胺類(lèi)藥物的使用中占有很大的比例，因此基于表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）技術(shù)建立了奶粉樣品中SDM的快速、高靈敏檢測(cè)方法。通過(guò)待測(cè)樣品與SPR芯片表面修飾的SDM抗體分子特異性識(shí)別引起金膜表面折射率變化，進(jìn)而導(dǎo)致SPR角的變化以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。建立SPR響應(yīng)信號(hào)和SDM濃度間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低檢測(cè)限達(dá)到0.19 ng/mL，奶粉樣品添加回收率在94.0%～98.3%。和傳統(tǒng)方法相比，SPR技術(shù)具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確性且操作簡(jiǎn)便，SPR傳感芯片完整性好且可重復(fù)用于實(shí)際樣品檢測(cè)中。

表面等離子體共振；生物傳感器；共振信號(hào)；磺胺二甲氧嘧啶

SDM是一種磺胺類(lèi)藥，具有較強(qiáng)的抗細(xì)菌及原蟲(chóng)感染的作用，常被用作飼料添加劑及畜禽疾病的治療和預(yù)防，同時(shí)SDM也具有的一定毒性，引起過(guò)敏、造血系統(tǒng)障礙、急性溶血性貧血等[1]，因此磺胺二甲氧嘧啶在肉類(lèi)、乳類(lèi)、禽蛋等食品性動(dòng)物組織中的殘留問(wèn)題備受關(guān)注[2-6]。中國(guó)農(nóng)業(yè)部2002年發(fā)布的動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留量，嚴(yán)格規(guī)定了動(dòng)物性食品中磺胺類(lèi)藥物最大殘留量為25 ng/mL。目前針對(duì)磺胺二甲氧嘧啶大致分為一下幾種，TTC法是中國(guó)制定的抗生素殘留量的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn) （GB5409-85），但耗時(shí)長(zhǎng)、要求操作人員具有一定的專(zhuān)業(yè)知識(shí)并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中菌液的制備和水浴過(guò)程的控制都要求嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，否則易出現(xiàn)假陽(yáng)性，以致出現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性[6-7]。高效液相色譜檢測(cè)法屬于一種理化檢測(cè)方法，檢測(cè)程序復(fù)雜，費(fèi)用相對(duì)較高，需購(gòu)買(mǎi)色譜儀等檢測(cè)設(shè)備，不適合小型檢驗(yàn)室 使 用[2-5]。 酶 聯(lián) 免 疫 法 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一種結(jié)合了酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的方法[8-9]，但操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)靈敏度不高，有時(shí)容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[6-7]。

SPR技術(shù)利用了金屬薄膜光學(xué)耦合產(chǎn)生的物理光學(xué)現(xiàn)象，是一種具有高靈敏度的光學(xué)分析手段[10-15]。在傳感芯片表面固定一層生物分子識(shí)別膜，然后將待測(cè)樣品流過(guò)芯片表面，若樣品中有能夠與芯片表面的生物分子識(shí)別膜相互作用的分子，會(huì)引起金膜表面折射率變化，最終導(dǎo)致SPR角變化，通過(guò)檢測(cè)SPR角度變化，獲得被分析物的濃度、親和力、動(dòng)力學(xué)常數(shù)和特異性等信息，SPR檢測(cè)器追蹤溶液中分子與芯片表面分子的結(jié)合、解離整個(gè)過(guò)程的變化，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品安全、環(huán)境檢測(cè)、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[14，16]。作者基于表面等離子體共振原理建立針對(duì)磺胺二甲氧嘧啶的高靈敏檢測(cè)。和傳統(tǒng)方法相比[17-18]，SPR技術(shù)無(wú)需標(biāo)記步驟、所需樣品量極少、檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)磺胺二甲氧嘧啶的實(shí)時(shí)、快速、無(wú)損傷檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺二甲氧嘧啶抗體：質(zhì)量濃度1 mg/mL，作者所在實(shí)驗(yàn)室自制，半抑制率（IC50）為0.8 ng/mL，LOD為0.31 ng/mL；磺胺二甲氧嘧啶：純度大于90%，干粉，購(gòu)自Sigma（上海）貿(mào)易有限公司；碳二亞胺（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀及其他分析試劑：購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

梅特勒-托利多分析電子天平：上海儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q Integral Cabinet 3型超純水制備儀：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；XW-80A旋渦混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；可調(diào)移液器：美國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.3 芯片表面修飾磺胺二甲氧嘧啶抗體

首先將磺胺二甲氧嘧啶抗體溶解在10 mmol/L pH 5.0的乙酸鈉溶液中，控制其終濃度為0.05 mg/ mL。其次向傳感器內(nèi)通入pH為7.4 PBS緩沖溶液（包括137 mmol/L氯化鈉，2.7 mmol/L氯化鉀，4.3 mmol/L磷酸氫二鈉，1.4 mmol/L磷酸二氫鉀和1/ 1 000甲醇），控制流量為10 μL/min，觀察基線，待其穩(wěn)定后加入相同體積的4.2 mg/mL EDC和5.0 mg/mL NHS溶液，反應(yīng)5～10 min，活化羧基纖維素，從而形成有活性的NHS-纖維素層。第三，通入PBS緩沖溶液進(jìn)行沖洗，待基線穩(wěn)定后加入已配制好的磺胺二甲氧嘧啶抗體溶液，抗體上的羧基和纖維素上的氨基形成共價(jià)鍵偶聯(lián)。隨后，通入1 mol/L的乙醇胺溶液以封閉為參與反應(yīng)的NHS-纖維素位點(diǎn)。

1.4 基于SPR技術(shù)的磺胺二甲氧嘧啶檢測(cè)

將磺胺二甲氧嘧啶溶液按照二倍濃度進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)稚⒃趐H 7.4 PBS緩沖液中，濃度變化包括5、2.5、1.25、0.63、0.32 ng/mL。將不同濃度的磺胺二甲氧嘧啶溶液依次通入SPR儀，優(yōu)化流入流速和反應(yīng)結(jié)合時(shí)間，觀察SPR信號(hào)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)。反應(yīng)結(jié)束，用pH 7.4的PBST緩沖液 （包括6.7 mmol/L的磷酸氫二鈉、1.25 mmol/L的磷酸二氫鉀、150 mmol/L的氯化鈉和0.005%的Tween-20）進(jìn)行洗脫，以去除結(jié)合上的磺胺二甲氧嘧啶，便于下一個(gè)樣品的測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)主要原理如圖1所示，基片的表面鍍有一層金膜，構(gòu)成傳感芯片的核心部分。在金膜表面修飾一種生物分子如磺胺二甲氧嘧啶抗體，當(dāng)待測(cè)溶液流過(guò)芯片表面時(shí)，待測(cè)分子與芯片表面的磺胺二甲氧嘧啶抗體發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致金膜表面介質(zhì)折射率的改變，得到不同角度的反射光的光強(qiáng)，其中使反射光完全消失的入射角即為共振角，金膜表面自由電子受入射光激發(fā)而產(chǎn)生電子震蕩，入射光的能量被轉(zhuǎn)移，形成表面等離子體。記錄角度和反射光強(qiáng)之間變化曲線圖，曲線圖中對(duì)應(yīng)波谷處為該曲線的共振角，對(duì)應(yīng)的角度即為共振信號(hào)，記錄時(shí)間和共振信號(hào)間的變化曲線即為SPR傳感曲線，分析不同濃度待測(cè)溶液下體系共振信號(hào)的變化達(dá)到對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。

圖1 基于SPR技術(shù)的SDM檢測(cè)原理圖Fig.1 Schematic illustration of SPR-based SDM detection

2.2 SPR芯片再生測(cè)試

在進(jìn)行實(shí)際樣品測(cè)定中，由于要接觸不同濃度的待測(cè)樣品，SPR芯片在反復(fù)吸附、洗滌等多個(gè)循環(huán)過(guò)程后使得表面偶聯(lián)分子失去活性或脫落，因此傳感芯片的完整性和重復(fù)性是完成待測(cè)樣品高靈敏檢測(cè)的關(guān)鍵。其中金屬膜的化學(xué)穩(wěn)定性是一個(gè)需要考慮的重要因素，和其他金屬膜相比如銀膜或銅膜相比，金膜的穩(wěn)定性最好，不易被空氣氧化且不易與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，具有化學(xué)惰性，適合長(zhǎng)期使用。如圖2所示，結(jié)合不同質(zhì)量濃度的磺胺二甲氧嘧啶（0.32、0.63、1.25、2.50、5.0 ng/mL）后的 SPR芯片，經(jīng)過(guò)多次洗滌和再生之后，測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)較弱，且彼此間并沒(méi)有太大的差別，不存在非特異性吸附和交叉感染，SPR可以實(shí)時(shí)觀測(cè)到分子結(jié)合、薄膜形成等表面現(xiàn)象，并能給出高靈敏度、高選擇性同時(shí)最小的非特異結(jié)合的信號(hào)。再生后的芯片中金膜尚且完整，可重復(fù)利用。

2.3 基于SPR技術(shù)的磺胺二甲氧嘧啶檢測(cè)

將不同質(zhì)量濃度的磺胺二甲氧嘧啶溶液通入芯片表面，待測(cè)的磺胺二甲氧嘧啶會(huì)與修飾在SPR傳感芯片表面的磺胺二甲氧嘧啶抗體直接發(fā)生特異性親和識(shí)別反應(yīng)，待測(cè)分子和芯片表面的抗體結(jié)合引起金膜和溶液界面折射率的上升，從而導(dǎo)致共振角發(fā)生變化，共振角對(duì)應(yīng)的角度為共振信號(hào)，從而得到時(shí)間與對(duì)應(yīng)共振信號(hào)的傳感曲線。如圖3所示，當(dāng)待測(cè)溶液濃度大，結(jié)合產(chǎn)物多，引起傳感器的響應(yīng)大；當(dāng)待測(cè)溶液濃度小，結(jié)合產(chǎn)物少，引起傳感器的響應(yīng)小。因此，待測(cè)溶液濃度與傳感器響應(yīng)信號(hào)之間存在正比關(guān)系（圖4），當(dāng)在300 s時(shí)，響應(yīng)信號(hào)達(dá)到最大，建立樣品濃度和300 s處響應(yīng)信號(hào)間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示出較好的線性（R2為0.99），計(jì)算出針對(duì)磺胺二甲氧嘧啶的LOD為0.19 ng/mL。基于SPR技術(shù)的檢測(cè)方法比傳統(tǒng)ELISA方法具有更高的靈敏度，且穩(wěn)定性好，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，可以作為ELISA的一種替代技術(shù)，應(yīng)用于待測(cè)樣品的測(cè)定。

圖2 SPR芯片的再生鑒定Fig.2 Renewable identification of SPR chips

圖3 不同質(zhì)量濃度SDM隨時(shí)間變化的SPR響應(yīng)信號(hào)Fig.3 Time-variant changes of SPR response signal f SDM with different concentrations

圖4 SDM濃度和SPR響應(yīng)信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve represented the relationship between SDM concentration and SPR response signal

2.4 添加回收試驗(yàn)

取已采用理化方法確認(rèn)為陰性的奶粉樣品1.0 g共4份，充分溶解于1 mL的超純水中，分別添加不同劑量的SDM，使其終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0和4.0 ng/mL。分別加入5 mL乙腈溶液，混合均勻后離心，取上清液真空抽干，分散在1 mL pH 7.4 PBS緩沖液中，加入1 mL正己烷去脂，離心去上層，重復(fù)3次，取下層水相用0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾。將不同含有不同濃度SDM的濾液依次通入SPR儀中，記錄不同SDM濃度下SPR響應(yīng)信號(hào)，分析檢測(cè)濃度并計(jì)算樣品回收率在94.0%～98.3%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 奶粉樣品中SDM添加回收率Table 1 Recovery of SDM spiked in milk powder

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)在SPR芯片表面修飾針對(duì)磺胺二甲氧嘧啶的抗體，鑒于待測(cè)抗原和抗體間的特異性親和原理，采用表面等離子共振技術(shù)實(shí)現(xiàn)了針對(duì)磺胺二甲氧嘧啶濃度的高靈敏檢測(cè)，其LOD達(dá)到0.19 ng/ mL，奶粉樣品添加回收率在94.0%～98.3%。和傳統(tǒng)ELISA方法相比，表面等離子共振技術(shù)操作簡(jiǎn)單、樣品用量少、檢測(cè)時(shí)間快且靈敏度較高，可以沿向小型化、自動(dòng)化、多樣化和高通量應(yīng)用目標(biāo)，推廣到食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)應(yīng)用中。

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High Sensitive Detection of Sulfadimethoxine Based on SPR Technique

ZHAO Yuan， XU Liguang， WU Xiaoling， LIU Liqiang， XU Chuanlai*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The overdose of sulfa drugs will cause allergic reactions and possibly carcinogenic. Among the all sulfa drugs used in food，sulfadimethoxine（SDM）takes up a large proportion.In this research，a new method based on surface plasmon resonance（SPR）was proposed for the rapid and high sensitive detection of SDM in milk powder.The detection was based on the changes of SPR angles，which was subsequently caused by the changes in the refractive index of gold film induced by the specific recognition of samples by the SDM antibody modified on the surface of SRP chips.A standard curve represented the relationship between SRP response signal and SDM concentration.The limit of detection（LOD）for SDM was as low as 0.19 ng/mL，and the milk powder recovery was in the range of 94.0%～98.3%.Compared with the traditional methods，SPR technique has highsensitivity，high accuracy and easy operation.SPR sensor chips can be repeatedly used for sampledetection in practical application with good integrity.

surface plasmon resonance，biosensor，resonance signal，sulfadimethoxine

TS 207.3

A

1673—1689（2015）07—0699—05

2014-08-25

國(guó)家重大科學(xué)儀器設(shè)備開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目。

趙 媛（1986—），女，江蘇徐州人，工學(xué)博士，副教授，主要從事食品安全檢測(cè)研究。E-mail：zhaoyuan0731@126.com

*通信作者：胥傳來(lái)（1965—），男，江蘇鹽城人，工學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事食品安全研究。E-mail：xcl@jiangnan.edu.cn