oleosin-MT融合蛋白在擬南芥中的表達及鑒定

官麗莉，陳 昱，朱 棟，韓怡來，崔 琪，李海燕，李校堃，姜 潮

(吉林農(nóng)業(yè)大學 a 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，b 生命科學學院，吉林 長春 130118)

oleosin-MT融合蛋白在擬南芥中的表達及鑒定

官麗莉a,b，陳 昱a,b，朱 棟a,b，韓怡來a,b，崔 琪a,b，李海燕a,b，李校堃a，姜 潮a

(吉林農(nóng)業(yè)大學 a 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，b 生命科學學院，吉林 長春 130118)

【目的】 獲得轉(zhuǎn)金屬硫蛋白(MT)基因的擬南芥植株，為利用植物生物反應(yīng)器規(guī)模化生產(chǎn)MT奠定基礎(chǔ)。【方法】 利用融合PCR方法，擴增擬南芥MT基因與油體蛋白oleosin基因的融合基因，將融合基因克隆至表達載體pOP上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pOP-oleosin-MT。采用凍融法將質(zhì)粒pOP-oleosin-MT轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化擬南芥，用PCR檢測并篩選轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株，采用SDS-PAGE法檢測oleosin-MT融合蛋白的表達，用鄰苯三酚自氧化法和結(jié)晶紫法測定融合蛋白的體外抗氧化活性?！窘Y(jié)果】 成功構(gòu)建了植物油體特異表達載體pOP-oleosin-MT,融合蛋白oleosin-MT在擬南芥種子中成功表達，其分子質(zhì)量為26 ku；總蛋白質(zhì)量濃度達到50 μg/μL時，超氧陰離子的清除率最高，為58.5%；總蛋白質(zhì)量濃度為10 μg/μL時，羥自由基清除率可達69.7%?！窘Y(jié)論】 成功獲得轉(zhuǎn)MT基因的擬南芥株系，并證明融合蛋白oleosin-MT在擬南芥中具有良好的體外抗氧化活性。

金屬硫蛋白；擬南芥；油體蛋白；基因表達

金屬硫蛋白(Metallothionein,MT)是一類低分子質(zhì)量(6～7 ku)、富含半胱氨酸、可與大量金屬離子(如Zn2+、Cd2+和 Cu2+)相結(jié)合的獨特蛋白質(zhì)或活性肽，是機體內(nèi)惟一一種在金屬代謝中起重要調(diào)節(jié)作用的小分子蛋白[1]。1957年，富含Cd的金屬蛋白首次在馬腎臟細胞中被發(fā)現(xiàn)[2]。對金屬硫蛋白進行提純，發(fā)現(xiàn)其含有大量的半胱氨酸殘基和金屬，并因此將其命名為“Metallothionein”[3]。研究證實，植物MT的高巰基含量使其在空氣中極不穩(wěn)定，導致分離困難，目前僅在小麥Ec蛋白[4]和擬南芥MT1、MT2和MT3[5]中分離純化獲得，MT基因的表達可增強植物在重金屬脅迫過程中的抗逆作用，對組織細胞損傷修復具有顯著功效[6-10]。同時研究還發(fā)現(xiàn)，MT2可與金屬結(jié)合，具有清除自由基、防輻射、加速皮膚炎癥修復和延緩衰老等功效[11-12]。

近年來，隨著植物基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，植物表達系統(tǒng)日益受到重視，其中植物油體表達系統(tǒng)已成為現(xiàn)階段植物生物反應(yīng)器研究的熱點之一，已有多種蛋白或多肽在植物中成功表達，但有關(guān)MT在植物油體中的表達研究尚未見報道。本研究通過構(gòu)建MT油體特異性表達載體，轉(zhuǎn)化擬南芥獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株，并對MT蛋白的體外抗氧化活性進行測定，旨在為研究MT蛋白功能及其在化妝品、藥物開發(fā)中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Arabidopsisthalianaecotype Columbia)種子，由吉林農(nóng)業(yè)大學生物反應(yīng)器與教育部工程研究中心保存。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株 農(nóng)桿菌菌株EHA105、植物表達載體pOP(以pCAMBIA1390載體骨架為藍圖進行改造后獲得)、pUC19-oleosin、大腸桿菌菌株DH5α，均由吉林農(nóng)業(yè)大學生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心構(gòu)建及保存；pEASY-Blunt Cloning Kit ，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試 劑 限制性內(nèi)切酶、PfuDNA聚合酶、DNA分子質(zhì)量標準Marker(DL2000)、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0試劑盒、DNA小量提取試劑盒、Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒、Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0試劑盒及DNA Ligation Kit Ver.2等，均購自大連寶生物工程有限公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank上的擬南芥MT2基因和oleosin基因堿基序列，利用Primer Primier 5.0引物設(shè)計軟件，分別設(shè)計MT(M1/M2)和oleosin(Y1/Y2)特異性引物，引物合成及測序均由金唯智生物科技(北京)有限公司完成。所設(shè)計的引物及序列如下。

M1：5′-ATGTCTTGCTGTGGTGGAAGCTG-3′；

M2：5′-CAAGCTTATTTGCAGGTGCAGGT-GCAAGGGTT-3′。下劃線部分為Hind Ⅲ的酶切位點和保護堿基。

Y1：5′-CATGCCATGGCGGATACAGCTAG-AGGAACCCAT-3′，下劃線部分為NcoⅠ的酶切位點和保護堿基；

Y2：5′-CTCCATCCTCTGGCAAAGCTGGC-ATAGTAGTGTGCTGGCCACCACG-3′。

1.2.2MT及oleosin基因的PCR擴增 從擬南芥葉片中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此為模板，利用MT基因特異性引物進行PCR擴增，50 μL PCR 反應(yīng)體系如下：10×PfuBuffer(含MgSO4) 5 μL，5′端引物M1(10 μmol/L) 1 μL，3′端引物M2(10 μmol/L) 1 μL，模板1 μL (500 ng/μL)，PfuDNA聚合酶1 μL， dNTP (25 mmol/L)4 μL，去離子水37 μL。PCR反應(yīng)程序為:95 ℃變性4 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min， 31個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。以pUC19-oleosin質(zhì)粒為模板，Y1、Y2 為引物，利用PCR擴增得到目的基因oleosin，體系及反應(yīng)程序同上。PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測并回收目的片段，于-20 ℃保存。

最后將3個年級的數(shù)據(jù)進行合并，利用基于K-means算法的評選方法和傳統(tǒng)評選方法的結(jié)果對比。見表11。

1.2.3oleosin-MT基因的PCR擴增 以PCR擴增得到的oleosin片段和MT片段為模板，Y1和M2分別為上、下游引物，擴增得到oleosin-MT融合基因片段，反應(yīng)體系及程序同1.2.2節(jié)。PCR 產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，檢測并回收目的片段，于-20 ℃保存。

將融合目的基因片段oleosin-MT與pEASY-Blunt 克隆載體連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性克隆經(jīng)PCR 鑒定和酶切鑒定后，將陽性克隆搖菌保種命名為pEASY-oleosin-MT，送測序公司進行分析。

1.2.4 含oleosin-MT植物表達載體的構(gòu)建NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切測序正確的pEASY-oleosin-MT重組子經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,割膠回收目的片段。利用SolutionⅠ連接酶將目的基因與酶切回收的pOP植物表達載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，陽性克隆經(jīng)PCR 鑒定和酶切鑒定后獲得重組pOP-oleosin-MT質(zhì)粒，利用凍融法將測序正確的pOP-oleosin-MT轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，獲得用于侵染用的工程菌株。

1.2.5oleosin-MT基因轉(zhuǎn)化擬南芥 侵染前1 d給予待侵染擬南芥充足的水分，轉(zhuǎn)化前剪掉種莢、開花和露白的花芽。將農(nóng)桿菌工程菌株接種于YEP液體培養(yǎng)基(50 μg/mL Kan、100 μg/mL Rif)中，28 ℃、180 r/min進行過夜培養(yǎng)。將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心10 min收集菌體，用Floral-Dip Buffer重懸菌體。將擬南芥全部浸入重懸的農(nóng)桿菌菌液中，靜置7 min，放平轉(zhuǎn)化后的營養(yǎng)缽，用保鮮膜包裹保濕過夜，第2天可稍露一小縫，第3天正常放置。待種子成熟后收獲種子，即為T0代。

1.2.6 擬南芥陽性植株的篩選 將收獲得到的擬南芥T0代種子進行播種，待擬南芥幼苗長出4～6片葉時，用體積分數(shù) 1% Basta噴灑幼苗，每隔1 d 1次，共3次。此時依然能夠生長的幼苗即為陽性苗。將生長狀況良好的陽性擬南芥幼苗進行移栽，每盆5株，2個月后可收獲T1代種子。對收獲的T1代種子進行播種和篩選，方法同T0代；2個月后可收獲T2代種子，對T2代種子進行后續(xù)的外源蛋白檢測。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因擬南芥外源蛋白表達的檢測 取40粒T2代擬南芥種子，放到特制的擬南芥研磨專用EP管中，將30 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)加入EP管內(nèi)，用小研棒充分研磨，研磨后用4 ℃、12 000 r/min離心10 min，離心后液體分3層：表層白色油膜層、中間層油液體和底層沉淀。棄沉淀，將上2層液體混勻后即為油體蛋白提取液。取30 μL油體蛋白樣品和6 μL 5×Loading Buffer，混合均勻后，沸水中煮10 min，取10 μL進行上樣，用12%SDS-PAGE鑒定。

清除率=(ΔOD0-ΔOD)/ΔOD0×100%。

上述體系在加入H2O2之前，加入0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35，0.40，0.45，0.50 mL的轉(zhuǎn)MT基因及野生型擬南芥種子油體蛋白溶液，測定吸光度ODa，計算表觀抗羥自由基氧化率(S)，即：

S=(ODa-ODb)/(OD0-ODb)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 MT基因的克隆

以擬南芥葉片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用M1和M2特異性引物進行PCR擴增，結(jié)果(圖1)顯示，在238 bp左右位置擴增出目的片段，經(jīng)DNA測序分析，同源性為100%，說明成功從擬南芥中克隆出MT基因。

圖1MT基因的PCR擴增
M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2.MT基因
Fig.1 PCR amplification ofMTgene M.DL2000 DNA Marker;1.Negative control；2.MTgene

2.2 oleosin-MT融合基因的克隆及驗證

以pUC19-oleosin質(zhì)粒為模板，Y1、Y2 為引物，通過PCR擴增目的基因oleosin，PCR擴增結(jié)果(圖2)顯示，在約762 bp處擴增出目的片段；以MT和oleosin2個目的基因為模板，Y1、M2 為引物，通過

PCR擴增得取融合基因oleosin-MT，結(jié)果(圖3)顯示，在1 000 bp左右位置擴增出目的片段。將融合目的基因片段oleosin-MT與pEASY-Blunt 克隆載體連接、轉(zhuǎn)化后，構(gòu)建pEASY-oleosin-MT。對含有融合基因的大腸桿菌菌液進行搖菌及PCR驗證，然后用試劑盒提取pEASY-oleosin-MT質(zhì)粒，進行質(zhì)粒的NcoⅠ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4，5所示。由圖4，5可知，PCR和酶切鑒定均釋放出 1 000 bp左右的目的條帶。送至測序公司進行分析，結(jié)果正確，表明融合基因已融合成功。

2.3 植物表達載體pOP-oleosin-MT的構(gòu)建

將融合后的oleosin-MT基因與植物表達載體過夜連接，轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中。將含有pOP-oleosin-MT重組質(zhì)粒的菌液過夜搖床培養(yǎng)，對培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌菌液進行PCR鑒定，結(jié)果(圖6)顯示，在1 000 bp處出現(xiàn)目的條帶，表明融合基因已成功插入到pOP載體中，植物表達載體構(gòu)建成功。

圖2 oleosin基因的PCR擴增M.DL2000 DNA Marker；1.陰性對照；2.oleosin基因Fig.2 PCR amplification of oleosin geneM.DL2000 DNA Marker;1.Negative control；2.oleosin gene

圖3 oleosin-MT基因的PCR擴增M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照；2.oleosin-MT基因Fig.3 PCR amplification of oleosin-MT geneM.DL2000 DNA Marker;1.Negative control；2.oleosin-MT gene

圖4 pEASY-oleosin-MT菌液的PCR鑒定M.DL2000 DNA Marker;1.oleosin-MT基因；2.陽性對照Fig.4 PCR amplification of pEASY-oleosin-MTM.DL2000 DNA Marker;1.oleosin-MT gene;2.Positive control

圖5 pEASY-oleosin-MT的雙酶切鑒定M.DL2000 DNA Marker;1～3.質(zhì)粒酶切Fig.5 Restriction digestion analysis of pEASY-oleosin-MTM.DL2000 DNA Marker；1-3.Plasmid digest

圖6 pOP-oleosin-MT菌液的PCR鑒定
M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照2.oleosin-MT基因
Fig.6 PCR amplification of plasmids pOP-oleosin-MT
M.DL2000 DNA Marker;1.Negative control；2.oleosin-MTgene

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株種子目標蛋白的SDS-PAGE電泳
M.蛋白Marker；1.非轉(zhuǎn)基因植株；2～5.轉(zhuǎn)基因植株
Fig.7 SDS-PAGE analysis of transgenic plant seeds
M.Protein marker;1.Wild type plant；2-5.Transgenic plants

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥目標蛋白的表達

經(jīng)過Basta抗性篩選，初步篩選出17株擬南芥抗性植株。分別提取4株陽性擬南芥T2代種子的油體蛋白，以野生型擬南芥種子的油體蛋白作陰性對照，進行SDS-PAGE分析。由圖7可見，轉(zhuǎn)基因植株oleosin-MT 2～5號在26 ku處都有條帶，初步證明oleosin-MT基因已在擬南芥T2代種子中得到表達。

2.5 MT蛋白的抗氧化活性檢測

2.5.1 超氧陰離子清除能力 鄰苯三酚吸光度值的測定結(jié)果見表1。

表1 鄰苯三酚自氧化速率及其吸光值的變化Table 1 Changes of autoxidation rate and absorption value of pyrogallol

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中MT蛋白的超氧陰離子清除活性Fig.8 Scavenging effect of MT protein from transgenetic Arabidopsis on superoxide anion free radical

圖9 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中MT蛋白對羥自由基的清除能力Fig.9 Hydroxyl radical scavenging activity of MT protein from transgenic Arabidopsis

2.5.2 羥自由基清除能力 以野生型擬南芥作為對照，考察金屬硫蛋白清除羥自由基(·OH)的能力。由圖9可以看出，隨金屬硫蛋白質(zhì)量濃度的升高，轉(zhuǎn)MT基因擬南芥的油體蛋白對·OH的清除能力亦逐漸增強。當金屬硫蛋白的質(zhì)量濃度增加至10 μg/μL時，清除率可達到69.7%。而在野生型擬南芥中，金屬硫蛋白對羥自由基僅有微弱的清除能力，且隨著金屬硫蛋白質(zhì)量濃度的升高，清除率變化并不明顯。

3 結(jié)論與討論

金屬硫蛋白含有豐富的半胱氨酸殘基，能通過半胱氨酸 (Cys)上的巰基 (-SH) 與金屬離子結(jié)合，具有解除金屬離子毒害以及調(diào)節(jié)體內(nèi)金屬離子平衡的作用[17-18]。目前，對植物金屬硫蛋白功能的研究正在逐步深入。金屬硫蛋白基因中豐富的巰基及其與重金屬的結(jié)合能力，決定了其功能的多樣性[19]。Xue等[20]在篩選棉花(Gossypiumhirsutum)cDNA 文庫時發(fā)現(xiàn)，MT基因GhMT3a能在氧化脅迫的逆境條件下上調(diào)表達；但當有外源抗氧化物質(zhì)存在時，GhMT3a在逆境條件下的上調(diào)表達會受到抑制，暗示GhMT3a可能具有抗氧化功能。植物金屬硫蛋白所具有的抗氧化活性受到廣泛關(guān)注，預(yù)示在植物中可能存在另一種新型高效的抗氧化系統(tǒng)，且其在植物中發(fā)揮著重要作用。

吉林農(nóng)業(yè)大學生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心保存的pOP質(zhì)粒(含有Basta篩選標記基因)是植物油體蛋白特異性表達載體，該載體加入了特異性的菜豆啟動子和終止子、35S啟動子、oleosin基因、Bar基因等作用原件。首先，利用此載體將oleosin基因編碼的終止子TAA密碼子修飾去除，使得油體蛋白與目的蛋白更易于融合表達；然后，選用菜豆特異性啟動子和終止子(phaP、phaT)，使轉(zhuǎn)基因種子中的目的基因可以更好地特異性表達；最后，添加Bar基因的35S啟動子和NOS poly A終止子，以Bar基因作為抗性篩選標記，便于轉(zhuǎn)基因植株的篩選，為后續(xù)轉(zhuǎn)基因植株的培育提供了便利條件。

目前，商品化的MTs 大多從兔肝中誘導提取，其生產(chǎn)成本高、價格昂貴，尋找廉價且含有豐富MTs 的新資源是降低生產(chǎn)成本及擴大其應(yīng)用領(lǐng)域的重要途徑。本研究對轉(zhuǎn)MT基因擬南芥種子與野生型擬南芥種子的總蛋白進行SDS-PAGE分析，初步證實融合蛋白oleosin-MT在擬南芥種子中有表達。野生型擬南芥中金屬硫蛋白對超氧自由基雖然有微弱的清除能力，但是隨著蛋白質(zhì)量濃度的升高，清除率變化不明顯，且均小于20%，而轉(zhuǎn)MT基因擬南芥總蛋白質(zhì)量濃度達到50 μg/μL時，超氧陰離子的清除率達到最高，為58.5%。轉(zhuǎn)MT基因擬南芥總蛋白質(zhì)量濃度增加至10 μg/μL時，羥自由基清除率可達69.7%，表明轉(zhuǎn)MT基因擬南芥具有較高的抗氧化活性。研究擬南芥種子中表達的金屬硫蛋白的生物學活性，為下一步將融合基因?qū)爰t花油體系統(tǒng)表達奠定了理論基礎(chǔ)。

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Expression and identification of oleosin-MT fusion protein inArabidopsis

GUAN Li-lia,b,CHEN Yua,b,ZHU Donga,b,HAN Yi-laia,b,CUI Qia,b,LI Hai-yana,b,LI Xiao-kuna,JIANG Chaoa

(aMinistryofEducationBioreactorandDrugDevelopmentReseachCenter;bCollegeofLifeScience,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China)

【Objective】 This study obtainedMTgene transgenicArabidopsisthaliana plants to improve the plant bioreactor technology and reduce the cost of separation and purification of therapeutic proteins.【Method】 Molecular biology method (PCR) was used to amplifyMTandoleosinfusion gene.Then,oleosin-MTgene was cloned into the expression vector pOP to construct recombinant plasmid pOP-oleosin-MT and the freeze-thaw method was used to transfer plasmid pOP-oleosin-MT intoAgrobacteriumtumefaciensEHA105.It was transformed intoArabidopsisbyAgrobacterium-mediated.Positive transgenic plants were determined by PCR analysis and SDS-PAGE.Antioxidant activity analysis of MT protein was also detected by pyrogallol autoxidation method and crystal violet method.【Result】 Plant binary expression vector pOP-Oleosin-MT was successfully constructed.SDS-PAGE showed that the fusion protein expressed inArabidopsisseeds with a molecular weight of 26 ku.Invitroantioxidant activity assay showed that the superoxide anion free radical clearance rate was the highest of 58.5% when MT protein concentration was 50 μg/μL.Total protein concentration was 10 μg/μL and hydroxyl radical scavenging rate was 69.7%,indicating that transgenicArabidopsishad high antioxidant activity.【Conclusion】Arabidopsislines withMTgene were successfully obtained,and it was proved that recombinant protein had good antioxidant activity.

MT protein;Arabidopsisthaliana;oleosin protein;gene expression

時間:2015-09-09 15:41

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.021

2014-03-11

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863)項目(2011AA100606)；國家自然科學基金項目(31201237，31101172)；吉林省科技廳中青年領(lǐng)軍人才及優(yōu)秀創(chuàng)新團隊項目(20111815)；教育部博士點基金青年教師基金項目(20122223120002)；吉林省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新基金項目(13C26212201223)

官麗莉(1982-)，女，吉林梅河口人，實驗師，主要從事藥用植物與生物技術(shù)研究。 E-mail：guanll2004@163.com

姜 潮 (1955-)，男，加拿大人，博士，研究員，主要從事植物生物反應(yīng)器研究。E-mail：chaojiang10@hotmail.com

Q943.2

A

1671-9387(2015)10-0155-07

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