• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    hrpZPsg12轉(zhuǎn)基因煙草及其抗性評(píng)價(jià)

    2015-01-07 07:16:54楊麗娜劉興娜盧寶慧吳庠玉白慶榮
    關(guān)鍵詞:野火抗病性病菌

    楊麗娜,劉興娜,盧寶慧,吳庠玉,白慶榮,王 雪,高 潔

    (1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 長春 130118;2 吉林省遼源市 農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,吉林 遼源 136300)

    hrpZPsg12轉(zhuǎn)基因煙草及其抗性評(píng)價(jià)

    楊麗娜1,劉興娜2,盧寶慧1,吳庠玉1,白慶榮1,王 雪1,高 潔1

    (1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,吉林 長春 130118;2 吉林省遼源市 農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站,吉林 遼源 136300)

    【目的】 將來源于大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea)Psg12菌株的hrpZPsg12基因?qū)霟煵荨霸茻?7”,對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行煙草普通花葉病毒(TMV)、煙草馬鈴薯Y病毒(PVY)和煙草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)的抗病性鑒定,為培育多抗煙草新品系奠定基礎(chǔ)?!痉椒ā?采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將hrpZPsg12基因轉(zhuǎn)入煙草“云煙87”中,對(duì)T0和T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)、Southern雜交,并對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因植株的抗病性進(jìn)行評(píng)價(jià)?!窘Y(jié)果】hrpZPsg12基因成功轉(zhuǎn)入“云煙87”中,PCR檢測(cè)表明共獲得7株T0代陽性植株、35株T1代陽性植株。對(duì)T1代PCR陽性植株進(jìn)行Southern檢測(cè),表明外源目的基因hrpZPsg12已經(jīng)整合進(jìn)煙草基因組中,并可在轉(zhuǎn)基因后代植株中穩(wěn)定遺傳??共⌒詼y(cè)定表明,T1代轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV和PVY表現(xiàn)高抗,對(duì)煙草野火病表現(xiàn)中抗?!窘Y(jié)論】 獲得了高抗TMV和PVY及中抗煙草野火病菌的轉(zhuǎn)hrpZPsg12基因植株20和15株。

    煙草;hrpZPsg12基因;農(nóng)桿菌介導(dǎo)法;轉(zhuǎn)基因植株

    hrp(Hypersensitive response and pathogenicity)基因普遍存在于革蘭氏陰性病原細(xì)菌中,其編碼的Harpin類蛋白本身不具有任何殺菌活性,但可以激活植物產(chǎn)生一系列抗性反應(yīng),使植物獲得廣譜的抗病、抗蟲作用,并能促進(jìn)植物生長,提高植物抗逆性,增加作物產(chǎn)量,在生產(chǎn)上具有較好的應(yīng)用前景[1-5]。國內(nèi)外學(xué)者用不同來源的hrp基因轉(zhuǎn)化梨樹、油菜、馬鈴薯、大豆等植物,轉(zhuǎn)基因植株都獲得了不同程度的抗性[6-11]。來源于大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea,Psg)的hrpZPsg12基因大小為1 026 bp,編碼431個(gè)氨基酸,甘氨酸含量為13.19%,編碼蛋白的分子質(zhì)量約為34 ku。由hrpZPsg12基因編碼的Harpin蛋白具有與其他Harpins蛋白類似的特征和功能。姜兆遠(yuǎn)等[12]克隆到該基因,也證明該基因表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)植物生長等效應(yīng)[13-15]。張?jiān)圃碌萚10]、尹俊琦等[11]將hrpZPsta基因轉(zhuǎn)入大豆品種中,轉(zhuǎn)基因后代對(duì)大豆灰斑病的抵抗能力大幅度增強(qiáng)。但目前該基因在煙草抗病性改良方面的研究尚未見報(bào)道,為進(jìn)一步明確該基因在煙草抗性改良中的功能,提高煙草抗病性,本研究將該基因轉(zhuǎn)化到煙草中并對(duì)其進(jìn)行抗病性鑒定,以期進(jìn)一步驗(yàn)證激活hrpZPsg12基因誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)植物生長的能力,為煙草抗病育種和誘導(dǎo)抗病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 受體材料 供試煙草品種為吉林省主栽煙草品種云煙87,由吉林省煙葉公司提供。

    1.1.2 菌株和質(zhì)粒 大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌(Pseudomonassyringaepv.glycinea,Psg)菌株P(guān)sg12、農(nóng)桿菌LBA4404、煙草普通花葉病毒(TMV)、煙草馬鈴薯Y病毒(PVY)和煙草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci),均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病害綜合治理實(shí)驗(yàn)室保存。植物表達(dá)載體pROKⅡ,由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物抗病基因工程研究室惠贈(zèng)。

    1.1.3 主要試劑 PCR擴(kuò)增試劑、限制性內(nèi)切酶,均購自MBI公司;DNA Marker DL2000,購自TaKaRa公司;植物基因組DNA提取試劑盒,購自北京天根公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 方 法

    1.2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)GenBank登錄號(hào)為FJ853143的大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌hrpZPsg12基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物(P1:5′-GCTCTAG-ATGATGCAGAGTCTCAGTCTT-3′和P2:5′-CG-AGCTCTCAGGCAGCAGCCTGGTTTT-3′),在其5′端和3′端分別引入XbaⅠ和SacⅠ酶切位點(diǎn)。以大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌Psg12基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性6 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物與pGM-T連接,構(gòu)建克隆質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,提取重組質(zhì)粒,雙酶切鑒定后送TaKaRa公司測(cè)序。用XbaⅠ和SacⅠ分別對(duì)克隆載體及表達(dá)載體pROKⅡ進(jìn)行雙酶切,回收目的片段。將目標(biāo)基因與植物表達(dá)載體連接、熱激法轉(zhuǎn)化DH5α,提取重組質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切鑒定,測(cè)序。凍融法將其轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404中,用于轉(zhuǎn)化煙草。

    1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草 轉(zhuǎn)化煙草按白慶榮等[16]的方法進(jìn)行,轉(zhuǎn)基因植株種子分單株收獲。

    1.2.3 T0代和T1代植株的分子檢測(cè) 1)PCR檢測(cè)。從T0和T1代轉(zhuǎn)化煙草植株及對(duì)照植株中剪取葉片,CTAB法提取植物基因組DNA,以P1和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以質(zhì)粒pROKⅡ-hrpZPsg12為陽性對(duì)照,未轉(zhuǎn)化的植株為陰性對(duì)照。

    2)Southern blot檢測(cè)。采用植物基因組DNA提取試劑盒提取PCR檢測(cè)陽性植株和對(duì)照植株的基因組DNA,經(jīng)BamHⅠ消化過夜,然后用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離,再用20ΧSSC轉(zhuǎn)移到尼龍膜,80 ℃固定2 h后與探針雜交。地高辛DNA標(biāo)記與檢測(cè)試劑盒(Roche公司)進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)。以純化的hrpZPsg12為模板制備探針,采用隨機(jī)引物標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記,隨后按照試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、雜交、封閉和顯色。

    1.2.4 T1代轉(zhuǎn)基因植株的抗病性評(píng)價(jià) (1)TMV和PVY的抗性評(píng)價(jià)。病毒汁液的制備:取感染TMV和PVY的煙草葉片,用流水沖洗葉片表面,消毒濾紙擦干后剪去主脈,將葉片放入研缽中并加入等量的磷酸緩沖液,在冰上研磨,4 ℃、10 000 r/min 離心10 min,吸取上清液至50 mL離心管中,按1∶5體積比用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%的巰基乙醇,pH 7.2)稀釋后加入體積分?jǐn)?shù)0.05%的Tween-80表面活性劑備用。

    病毒接種:分別選取5株7葉期T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株和空白對(duì)照植株作為接種對(duì)象,每株接種2個(gè)完全展開的新生葉片。先將石英砂均勻撒在葉片上,用滅菌毛刷蘸取病毒汁液在接種葉片上輕度摩擦,1~2 h后用無菌水噴洗接種部位,將接種植株置25 ℃溫室中培養(yǎng)。逐天觀察接種煙草葉片的癥狀變化,參照黃婷等[9,17]的方法分別調(diào)查接種后7,15 d煙草葉片的發(fā)病情況,并對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。

    (2)煙草野火病菌的抗性評(píng)價(jià)。將活化后的煙草野火病菌制成5×108CFU/mL的菌懸液。分別選取15株轉(zhuǎn)基因植株(7葉期)用上述菌懸液噴霧接種,再選取15株非轉(zhuǎn)基因健康植株用無菌水噴霧作為空白對(duì)照,套袋保濕24 h,置25 ℃溫室中培養(yǎng)。接種后7 d,調(diào)查發(fā)病情況,記載葉片病斑直徑,計(jì)算平均病斑直徑和病葉率。

    煙草野火病的病級(jí)指數(shù)采用9級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),其中0級(jí):葉片無病斑;1級(jí):病斑占葉片面積5%以下;3級(jí):病斑占葉片面積6%~10%;5級(jí):病斑占葉片面積11%~20%;7級(jí):病斑占葉片面積21%~40%;9級(jí):病斑占葉片面積40%以上。按下式計(jì)算病情指數(shù):

    病情指數(shù)=[(∑各級(jí)病葉數(shù)×該病級(jí)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)]×100。

    按病情指數(shù)進(jìn)行群體抗性分類。群體抗性分類標(biāo)準(zhǔn)為4級(jí),其中免疫:病情指數(shù)等于0,無侵染;高抗:0<病情指數(shù)≤20;中抗:20<病情指數(shù)≤50;感?。?0<病情指數(shù)≤100。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

    將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGM-T連接,構(gòu)建克隆質(zhì)粒pGM-hrpZPsg12,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,提取重組質(zhì)粒。用XbaⅠ和SacⅠ分別對(duì)克隆載體進(jìn)行酶切,得到1 026 bp的片段,將該片段與相同酶切位點(diǎn)的植物表達(dá)載體pROKⅡ進(jìn)行連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pROKⅡ-hrpZPsg12, PCR和雙酶切鑒定(圖1)及測(cè)序結(jié)果表明,植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

    圖1 質(zhì)粒pROKⅡ-hrpZPsg12的酶切鑒定M.DL2000 DNA Marker;1,2.pROKⅡ-hrpZPsg12質(zhì)粒 XbaⅠ/SacⅠ雙酶切

    2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草的轉(zhuǎn)化

    將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中,葉盤法轉(zhuǎn)化煙草,結(jié)果獲得10株卡那抗性植株(圖2)。

    圖2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的hrpZPsg12基因轉(zhuǎn)化煙草A.預(yù)培養(yǎng);B.共培養(yǎng);C.選擇培養(yǎng);D.分化芽;E.生根培養(yǎng);F.轉(zhuǎn)化植株
    Fig.2 Transformation ofhrpZPsg12gene into tobacco via agrobacterium-mediated method A.Pre-regeneration culture;B.Co-cultivation;C.Callus culture;D.Km resistant buds from tobacco leaf disks;E.Root-reduced culture;F.Transformation plants

    2.3 轉(zhuǎn)基因煙草的分子檢測(cè)

    2.3.1 PCR檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因植株T0代總DNA PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果(圖3)表明,從T0代植株中擴(kuò)增出了與陽性對(duì)照在同一位置的特異性條帶,初步證明hrpZPsg12基因成功地轉(zhuǎn)入到受體煙草品種中,共獲得了7株陽性植株。

    播種PCR檢測(cè)為陽性的T0代植株的種子,獲得T1代轉(zhuǎn)基因植株,將其播種于營養(yǎng)缽中,提取基因組DNA,以其為模板,P1、P2為引物進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果(圖4)表明,外源hrpZPsg12基因在轉(zhuǎn)基因后代中能夠遺傳,共獲得了35株T1代轉(zhuǎn)基因植株。

    2.3.2 Southern雜交 對(duì)部分T1代PCR檢測(cè)為陽性的植株基因組DNA用BamHⅠ進(jìn)行酶切,并進(jìn)行Southern 雜交分析,結(jié)果如圖5所示。圖5顯示,PCR檢測(cè)為陽性的T1植株與陽性對(duì)照在相同位置出現(xiàn)雜交條帶,證明外源hrpZPsg12基因已整合到煙草基因組中并可穩(wěn)定遺傳。

    圖3 T0代轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測(cè)
    1~5.轉(zhuǎn)基因植株;6.未轉(zhuǎn)化植株;7.重組表達(dá)質(zhì)粒 pROKⅡ-hrpZPsg12; M.DL2000 DNA Marker
    Fig.3 PCR analysis of T0transgenic tobacco plants 1-5.Transgenic tobacco plants;6.Non-transgenic plant;7.Recombined plasmid pROKⅡ-hrpZPsg12;M.DL2000 DNA Marker

    圖4 T1代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)1~4.T1代轉(zhuǎn)基因植株;5.未轉(zhuǎn)化植株;M.DL2000 DNA MarkerFig.4 PCR analysis of T1 transgenic tobacco plants 1-4.Transgenic tobacco plants;5.Non-transgenic plant;M.DL2000 DNA Marker

    圖5 轉(zhuǎn)基因煙草的Southern blot分析1.陰性對(duì)照;2.陽性對(duì)照;3,4.轉(zhuǎn)基因陽性株系Fig.5 Southern blot analysis of transgenic tobacco plants1.Negative control;2.Positive control;3,4.Transgenic tobacco plants

    2.4 T1代轉(zhuǎn)基因煙草的抗病性評(píng)價(jià)

    在接種TMV后7 d,轉(zhuǎn)基因煙草接種的2個(gè)葉片產(chǎn)生不規(guī)則的過敏性枯死斑(圖6-A),未轉(zhuǎn)基因植株的葉片產(chǎn)生典型的TMV初期癥狀(圖6-B);在接種后15 d,轉(zhuǎn)基因煙草植株接種的2個(gè)葉片枯死,上部新生葉片正常(圖6-C),而未轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓觌S著病程的持續(xù),整株發(fā)病(圖6-D)。由此可以看出,轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV具有高度抗性。

    圖6 轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草植株接種TMV后的癥狀
    A.接種7 d的轉(zhuǎn)基因植株;B.接種7 d的非轉(zhuǎn)基因植株;C.接種15 d的轉(zhuǎn)基因植株;D.接種15 d的非轉(zhuǎn)基因植株
    Fig.6 Symptoms on leaves of transgenic plants and non-transgenic plants after inoculation with TMV respectively
    A.Transgenic tobacco plants 7 d after inoculation;B.Non-transgenic plants 7 d after inoculation; C.Transgenic tobacco plants 15 d after inoculation;D.Non-transgenic plant 15 d after inoculation

    在接種PVY后7 d,轉(zhuǎn)基因煙草植株生長正常 (圖7-A);非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑娜~片產(chǎn)生典型的PVY癥狀(圖7-B)。在接種后15 d,轉(zhuǎn)基因煙草生長正常(圖7-C),而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆~脈呈褐色至黑色壞死,常延伸到中脈和莖上,造成葉片皺縮卷曲,在葉中脈或側(cè)脈處常發(fā)生大小數(shù)目不一的褐色或白色壞死斑點(diǎn)(圖7-D)。由此可以看出,轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)PVY具有高度抗性。

    圖7 轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草植株接種PVY后的癥狀A(yù).接種7 d的轉(zhuǎn)基因植株;B.接種7 d的非轉(zhuǎn)基因植株;C.接種15 d的轉(zhuǎn)基因植株;D.接種15 d的非轉(zhuǎn)基因植株

    在接種煙草野火病菌的第4天,轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)發(fā)病癥狀(圖8-A),非轉(zhuǎn)基因煙草植株出現(xiàn)水漬狀圓形褪色的小斑點(diǎn)(圖8-B);在接種后13 d,轉(zhuǎn)基因煙草開始有部分葉片出現(xiàn)水漬狀圓形褪色的小斑點(diǎn)(圖8-C),發(fā)病率為5%,推遲發(fā)病7~9 d。非轉(zhuǎn)基因煙草發(fā)病率達(dá)到60%,病斑擴(kuò)大,中心變成褐色,周圍有一圈很寬的黃綠色暈環(huán),病斑合并擴(kuò)大,呈不規(guī)則形(圖8-D);在接種后第21天,轉(zhuǎn)基因植株的平均病情指數(shù)為40,而對(duì)照植株的平均病情指數(shù)為100(表1)。隨著病程的持續(xù),接種30 d時(shí)對(duì)照植株進(jìn)入病情指數(shù)為100的平穩(wěn)期,轉(zhuǎn)基因植株在30 d時(shí)才進(jìn)入病情指數(shù)為80平穩(wěn)期。上述結(jié)果表明,所選取的15株轉(zhuǎn)基因煙草均中抗煙草野火病菌。

    圖8 轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草植株在接種煙草野火病菌后的癥狀A(yù).接種4 d的轉(zhuǎn)基因植株;B.接種4 d的非轉(zhuǎn)基因植株;C.接種13 d的轉(zhuǎn)基因植株;D.接種13 d的非轉(zhuǎn)基因植株

    表1 轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草植株對(duì)煙草野火病菌的抗性Table 1 Resistance of transgenic and non-transgenic plants against Pseudomonas syringae pv.tabaci

    3 討 論

    hrpZ基因編碼的Harpin蛋白在引起植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)的同時(shí),不僅可以誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)性抗性,還能刺激植物生長發(fā)育,誘導(dǎo)其他有益反應(yīng)的發(fā)生[13-16]。Harpin蛋白的作用機(jī)理并不是直接針對(duì)目標(biāo)病原菌,而是刺激植物自身產(chǎn)生過敏性反應(yīng)(HR),從而達(dá)到抵御不利微生物侵害的目的,該反應(yīng)效果已被證實(shí)能夠激發(fā)并提高植物體對(duì)多種微生物病原菌的抗性,而這種自然的免疫機(jī)制可以促進(jìn)植物抵抗一系列的細(xì)菌、真菌和病毒病害,賦予植物廣譜抗病性。目前已經(jīng)得到了高抗晚疫病轉(zhuǎn)hrp基因的馬鈴薯,用馬鈴薯晚疫病菌復(fù)合生理小種挑戰(zhàn)接種測(cè)定表明,HrpN蛋白的轉(zhuǎn)基因植株能夠拮抗病原菌的侵?jǐn)_[7-8]。張?jiān)圃碌萚10]、尹俊琦等[11]將hrpZPsta基因轉(zhuǎn)入2個(gè)大豆品種中,使大豆植株對(duì)真菌類病害的抵抗能力有較顯著的增強(qiáng)。本試驗(yàn)將hrpZPsg12基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入煙草獲得了穩(wěn)定遺傳2代的轉(zhuǎn)基因植株,T1代轉(zhuǎn)基因植株對(duì)TMV、PVY和煙草野火病的抗性都有所增強(qiáng),且對(duì)TMV和PVY表現(xiàn)高抗,對(duì)煙草野火病表現(xiàn)中抗,以上研究結(jié)果說明,hrp基因編碼的Harpin蛋白在誘導(dǎo)植物獲得系統(tǒng)性抗性上有很大的作用,但是具體對(duì)哪種病害的抵抗能力更強(qiáng)尚不甚明確,這有待進(jìn)一步研究。

    近些年,人們對(duì)轉(zhuǎn)基因食品安全性的問題愈加關(guān)注。hrpZPsta基因編碼的Harpin蛋白并非是毒蛋白,不會(huì)對(duì)植物體或者食用植物的動(dòng)物或人造成危害,此種蛋白的主要作用是引起植物體本身的過敏性反應(yīng),以應(yīng)對(duì)病原菌的入侵并產(chǎn)生廣譜的抗病性。因此該基因是較為安全的,不會(huì)給人們帶來對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的恐慌。該基因在增強(qiáng)植株自身抗病性的同時(shí),還可以提高煙草抗病性,改良煙草的品質(zhì),為進(jìn)一步培育抗病轉(zhuǎn)基因煙草新品系奠定了基礎(chǔ)。

    [1] Galān J E,Collmer A.Type Ⅲ secretion machines:Bacterial devices for protein delivery into host cells [J].Science,1999,284(21):1322-1328.

    [2] Staskawicz B J.Genetics of plant pathogen interactions specifying plant disease resistance [J].Plant,2001,25(1):73-76.

    [3] Wei Z M,Laby R J,Zumoff C H,et al.Harpin,elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogenErwiniaamylovora[J].Science,1992,257:85-88.

    [4] Gopalan S,He S Y.Bacterial genes involved in the elicitation of hypersensitive response and pathogenesis [J].Plant Disease,1996,80:604-610.

    [5] 楊 軍,尹啟生,宋紀(jì)真,等.植物病原菌的hrp基因 [J].遺傳,2005,27(5):852-858.

    Yang J,Yin Q S,Song J Z,et al.Review onhrpgenes of plant pathogenic bacteria [J].Hereditas,2005,27(5):852-858.(in Chinese)

    [6] 趙延鵬,姜伯樂,何勇強(qiáng),等.十字花科黑腐病菌hrpW基因?qū)胗筒酥芯砍鯃?bào) [J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,23(4):67-70.

    Zhao Y P,Jiang B L,He Y Q,et al.Preliminary report on obtaining transgenicBrassicanapusL.HarboringhrpWgene ofXanthomonascampestrispv.campestris[J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2007,23(4):67-70.(in Chinese)

    [7] 李先平,何云昆.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)把HarpinEa基因?qū)腭R鈴薯的初步研究 [J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,17(3):252-257.

    Li X P,He Y K.Analysis of late blight resistance in transgenic potato expressingHarpinEagene [J].Journal of Yunnan Agricultural University,2002,17(3):252-257.(in Chinese)

    [8] 黃先群,蔣敏華,陳 堅(jiān),等.轉(zhuǎn)hrap基因馬鈴薯獲得晚疫病抗性研究 [J].分子植物育種,2011,9(2):218-223.

    Huang X Q,Jiang M H,Chen J,et al.Integrating thehrapgene from sweet pepper into potato enhances resistance toPhytopthorainfestans[J].Molecular Plant Breeding,2011,9(2):218-223.(in Chinese)

    [9] 黃 婷,袁治理,成巨龍,等.煙草對(duì)蝕紋病毒和馬鈴薯Y病毒的抗病性鑒定 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,40(6):107-113.

    Huang T,Yuan Z L,Cheng J L,et al.Identification of resistance to TEV and PVY in tobacco varieties [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2012,40(6):107-113.(in Chinese)

    [10] 張?jiān)圃?,付永平,王丕武,?轉(zhuǎn)hrpZPsta抗病基因大豆的研究 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2011,39(9):86-91.

    Zhang Y Y,Fu Y P,Wang P W,et al.Study on transforminghrpZPstagene into soybean [J].Journal of Northwest A&F University:Nat Sci Ed,2011,39(9):86-91.(in Chinese)

    [11] 尹俊琦,王 楠,周 瑩,等.兩個(gè)大豆品種轉(zhuǎn)hrpZPsta基因后代對(duì)大豆灰斑病的抗性分析 [J].大豆科學(xué),2013,32(2):238-241.

    Yin J Q,Wang N,Zhou Y,et al.Analysis on resistance to frogeye leaf spot between two species of transgenic soybean progenies withhrpZPstagene [J].Soybean Science,2013,32(2):238-241.(in Chinese)

    [12] 姜兆遠(yuǎn),鄒曉薇,高 潔,等.大豆細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌harpin編碼基因的克隆與表達(dá) [J].微生物學(xué)報(bào),2009,49(10):1403-1407.

    Jiang Z Y,Zou X W,Gao J,et al.Cloning and expressing of a harpin-encoding gene fromPseudomonassyringaepv.glycinea[J].Acta Microbiologica Sinica,2009,49(10):1403-1407.(in Chinese)

    [13] 王金生.植物病原細(xì)菌學(xué) [M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000:258-264.

    Wang J S.Plant bacteriology [M].Beijing:Agricultrue Publishing House in China,2000:258-264.(in Chinese)

    [14] 陳功友,張 兵,武曉敏,等.大豆斑疹病菌harpin編碼基因的克隆與特性研究 [J].微生物學(xué)報(bào),2005,45(4):496-499.

    Chen G Y,Zhang B,Wu X M,et al.Cloning and characterization of an harpin_encoding gene fromXanthomonasaxonopodispv.glycinesrequired for hypersensitive response on nonhost plant tobacco [J].Acta Microbiologica Sinica,2005,45(4):496-499.(in Chinese)

    [15] 譚放軍,徐澤安,尹文雅,等.Harpin蛋白研究進(jìn)展及其應(yīng)用 [J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué),2003(6):38-40.

    Tan F J,Xu Z A,Yin W Y,et al.Studies on Harpin protein and its application [J].Hunan Agricultural Sciences,2003(6):38-40.(in Chinese)

    [16] 白慶榮,朱俊華,劉曉玲.利用RNA介導(dǎo)的抗病性獲得抗2種病毒的轉(zhuǎn)基因煙草 [J].植物病理學(xué)報(bào),2005,35(2):148-154.

    Bai Q R,Zhu J H,Liu X L,et al.Production of transgenic tobacco plants resistant to two viruses via RNA-mediated virus resistance [J].Acta Phytopathologica Sinica,2005,35(2):148-154.(in Chinese)

    [17] 黃 婷,柯美福,陳 偉,等.煙草品種對(duì)煙草花葉病毒病和黃瓜花葉病毒病的抗性鑒定 [J].植物保護(hù),2012,38(5):115-119.

    Huang T,Ke M F,Chen W,et al.Identification of tobacco variety resistance to Tobacco mosaic virus and Cucumber mosaic virus [J].Plant Protection,2012,38(5):115-119.(in Chinese)

    Transgenic tobacco withhrpZPsg12gene and evaluation of its resistance

    YANG Li-na1,LIU Xing-na2,LU Bao-hui1,WU Xiang-yu1, BAI Qing-rong1,WANG Xue1,GAO Jie1

    (1CollegeofAgronomy,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jinlin130118,China;2AgriculturalTechnologyExtensionStationofLiaoyuanCity,Liaoyuan,Jinlin136300,China)

    【Objective】hrpZPsg12gene fromPseudomonassyringaepv.glycineaPsg12 strain was imported to tobacco variety “Yunyan 87” and the disease resistance to TMV,PVY andPseudomonassyringaepv.tabaciwas identified to provide reference for cultivating resistant tobacco varieties.【Method】hrpZPsg12gene was transferred into “Yunyan 87” by agrobacterium-mediated transformation method.Transgenic plants of T0generation and T1generation were detected by PCR,Southern blot and resistance assay.The disease resistance of T1generation plants was also evaluated.【Result】 PCR detection showed that this study obtained 7 positive transgenic plant lines in T0generation and 35 plant lines in T1generation,indicating thathrpZPsg12gene could inherit in transgenic plants.Southern blot for T1generation confirmed thathrpZPsg12gene was integrated into tobacco.Resistance assay confirmed that T1generation had high resistance against TMV and PVY,and moderate resistance againstPseudomonassyringaepv.tabaci.【Conclusion】 A total of 20 transgenic plants lines with high resistance against TMV and PVY and 15 transgenic plants lines with moderate resistance againstPseudomonassyringaepv.tabaciwere obtained.

    tobacco;hrpZPsg12gene;transformation;multiple resistance transgenic plants

    時(shí)間:2015-09-09 15:41

    10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.10.010

    2014-03-10

    吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20090211);吉林省煙草公司長春市分公司和湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司聯(lián)合資助項(xiàng)目(2012130073);吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)青年啟動(dòng)基金項(xiàng)目(201029);吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(201106)

    楊麗娜(1981-),女,吉林扶余人,實(shí)驗(yàn)師,碩士,主要從事植物病害綜合治理研究。E-mail:yanglina2004@sina.com

    高 潔(1965-),女,吉林梨樹人,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事植物病害綜合治理研究。E-mail:jiegao115@126.com

    S572.034

    A

    1671-9387(2015)10-0070-07

    網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150909.1541.020.html

    猜你喜歡
    野火抗病性病菌
    野火:道是無情卻有情
    旅大紅骨改良先鋒父本選系抗病性鑒定及穗部性狀配合力分析
    基于多特征融合的早期野火煙霧檢測(cè)
    小病菌影響鴉片戰(zhàn)爭(zhēng)
    特別健康(2018年3期)2018-07-04 00:40:24
    頭狀莖點(diǎn)霉病菌的新寄主高粱及病菌的檢疫鑒定(內(nèi)文第98~101頁)圖版
    油茶炭疽病菌拮抗木霉菌的分離與篩選
    病菌來了 快穿好防菌衣
    膜醭畢赤酵母對(duì)草莓采后灰霉病抗病性的誘導(dǎo)
    一氧化氮參與水楊酸誘導(dǎo)的采后番茄果實(shí)抗病性反應(yīng)
    煙草野火病發(fā)生與防治的研究進(jìn)展
    色尼玛亚洲综合影院| 一本精品99久久精品77| 日韩国内少妇激情av| 午夜视频精品福利| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲人成电影免费在线| 午夜久久久久精精品| 99国产精品99久久久久| 午夜日韩欧美国产| 美女被艹到高潮喷水动态| 高潮久久久久久久久久久不卡| 中文在线观看免费www的网站| 国产综合懂色| 一级毛片女人18水好多| 日日夜夜操网爽| 国产 一区 欧美 日韩| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日本黄色片子视频| 欧美极品一区二区三区四区| 夜夜夜夜夜久久久久| 很黄的视频免费| 99热6这里只有精品| www.熟女人妻精品国产| 亚洲国产高清在线一区二区三| 99久久精品热视频| 免费搜索国产男女视频| 黄色丝袜av网址大全| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| av视频在线观看入口| 国产日本99.免费观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品不卡国产一区二区三区| 久久这里只有精品中国| 男女视频在线观看网站免费| 91麻豆av在线| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品,欧美在线| 天堂动漫精品| 九九热线精品视视频播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 俺也久久电影网| 在线免费观看不下载黄p国产 | 精品日产1卡2卡| 亚洲在线自拍视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一区二区三区高清视频在线| 国产男靠女视频免费网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 男人舔奶头视频| 久久天堂一区二区三区四区| or卡值多少钱| 亚洲精华国产精华精| 嫁个100分男人电影在线观看| 青草久久国产| 99精品久久久久人妻精品| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产单亲对白刺激| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线播放国产精品三级| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品电影一区二区三区| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲无线观看免费| 亚洲人成伊人成综合网2020| 99久久综合精品五月天人人| 成人精品一区二区免费| 欧美三级亚洲精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 丰满的人妻完整版| 天天添夜夜摸| 亚洲人与动物交配视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久久久亚洲av毛片大全| 黄片小视频在线播放| 久久中文字幕人妻熟女| 母亲3免费完整高清在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲黑人精品在线| 免费观看的影片在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 女人被狂操c到高潮| 久久伊人香网站| 看免费av毛片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 麻豆久久精品国产亚洲av| 美女免费视频网站| 宅男免费午夜| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 狂野欧美激情性xxxx| 757午夜福利合集在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久亚洲真实| 成人一区二区视频在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 69av精品久久久久久| www.精华液| 在线观看免费视频日本深夜| 国产一区二区在线av高清观看| 美女cb高潮喷水在线观看 | 在线视频色国产色| 久久国产精品影院| 中文资源天堂在线| 欧美激情久久久久久爽电影| 91字幕亚洲| 亚洲自拍偷在线| 国产精品久久久人人做人人爽| 免费av毛片视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 在线观看一区二区三区| АⅤ资源中文在线天堂| 岛国在线免费视频观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产精品 国内视频| 十八禁人妻一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲人与动物交配视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产v大片淫在线免费观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 中文字幕av在线有码专区| 国产99白浆流出| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 日韩欧美免费精品| 男人的好看免费观看在线视频| 国产单亲对白刺激| 国产激情欧美一区二区| 在线a可以看的网站| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲av成人av| 国产日本99.免费观看| 国产精品国产高清国产av| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 两人在一起打扑克的视频| 婷婷亚洲欧美| 色综合站精品国产| 国产精品 欧美亚洲| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 我的老师免费观看完整版| 黄色女人牲交| 一夜夜www| 毛片女人毛片| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| av女优亚洲男人天堂 | 国产成人精品久久二区二区免费| 久久国产精品影院| 国产三级中文精品| 色噜噜av男人的天堂激情| 88av欧美| 亚洲七黄色美女视频| 免费看十八禁软件| 欧美日韩一级在线毛片| 国产v大片淫在线免费观看| 欧美大码av| 国产毛片a区久久久久| av天堂在线播放| 淫秽高清视频在线观看| 天堂√8在线中文| 亚洲精华国产精华精| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产av在哪里看| 欧美性猛交黑人性爽| 热99re8久久精品国产| 国产综合懂色| 天天一区二区日本电影三级| 精品久久久久久,| 成人特级av手机在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 女警被强在线播放| 国产精品久久电影中文字幕| 99国产精品一区二区三区| 国产男靠女视频免费网站| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产成人影院久久av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 国产人伦9x9x在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久久久久大精品| 天堂网av新在线| 色在线成人网| 国产精品av久久久久免费| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美| 美女黄网站色视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 成人三级做爰电影| 久久香蕉精品热| 亚洲,欧美精品.| 桃红色精品国产亚洲av| 中文字幕久久专区| 日本黄色视频三级网站网址| 国产精品九九99| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 天堂√8在线中文| 久9热在线精品视频| 日韩欧美在线乱码| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av成人av| 久久亚洲真实| 一级作爱视频免费观看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| av片东京热男人的天堂| 色综合婷婷激情| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费av毛片视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产激情久久老熟女| 一区二区三区高清视频在线| 十八禁人妻一区二区| 无限看片的www在线观看| 日韩欧美三级三区| svipshipincom国产片| 日韩人妻高清精品专区| 欧美成狂野欧美在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美大码av| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品一区二区三区视频在线 | 国产高潮美女av| 欧美在线一区亚洲| 一区二区三区国产精品乱码| 久久久久久久久久黄片| 高清在线国产一区| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩有码中文字幕| 成年女人看的毛片在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 在线观看舔阴道视频| 精品乱码久久久久久99久播| 高清在线国产一区| avwww免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产爱豆传媒在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av熟女| 国产1区2区3区精品| 丰满的人妻完整版| 日韩欧美在线二视频| 日本五十路高清| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲熟女毛片儿| 69av精品久久久久久| 黑人操中国人逼视频| 男女床上黄色一级片免费看| 精品久久久久久久久久久久久| 日韩成人在线观看一区二区三区| xxxwww97欧美| 日韩精品青青久久久久久| 男人的好看免费观看在线视频| www日本在线高清视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久热在线av| 国产精品,欧美在线| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 男人和女人高潮做爰伦理| 婷婷精品国产亚洲av| 观看美女的网站| 成人精品一区二区免费| 国产三级黄色录像| 日日夜夜操网爽| 免费电影在线观看免费观看| 高清在线国产一区| 99久久精品热视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 男女午夜视频在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品 欧美亚洲| 全区人妻精品视频| www.999成人在线观看| 国产真实乱freesex| 一本精品99久久精品77| 91av网一区二区| 精品无人区乱码1区二区| 1000部很黄的大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 可以在线观看毛片的网站| 午夜福利欧美成人| 国产欧美日韩精品亚洲av| 一二三四社区在线视频社区8| 国产亚洲精品久久久com| 看黄色毛片网站| 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美日韩一级在线毛片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本与韩国留学比较| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产成人啪精品午夜网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产成人精品无人区| 真实男女啪啪啪动态图| av中文乱码字幕在线| 午夜福利在线观看吧| 国产精品野战在线观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 男插女下体视频免费在线播放| 一级毛片高清免费大全| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久久精品欧美日韩精品| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产高清视频在线观看网站| xxxwww97欧美| 成年版毛片免费区| 九色成人免费人妻av| 人妻久久中文字幕网| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久中文字幕一级| 制服人妻中文乱码| 国产三级在线视频| www.www免费av| 黑人操中国人逼视频| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久国产成人精品二区| 欧美日韩黄片免| 久久久久久久精品吃奶| 久久久久久久久中文| 亚洲片人在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 国产成人啪精品午夜网站| av天堂在线播放| 久久久久九九精品影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 午夜日韩欧美国产| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲黑人精品在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲专区中文字幕在线| 日韩欧美免费精品| 国产av一区在线观看免费| 亚洲成人精品中文字幕电影| 男人和女人高潮做爰伦理| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产欧美日韩一区二区三| av在线天堂中文字幕| xxxwww97欧美| 国产亚洲av高清不卡| 综合色av麻豆| 日本三级黄在线观看| 国内精品美女久久久久久| 99在线人妻在线中文字幕| 欧美色欧美亚洲另类二区| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 首页视频小说图片口味搜索| 一级黄色大片毛片| 在线观看免费视频日本深夜| or卡值多少钱| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 免费观看的影片在线观看| svipshipincom国产片| 精品电影一区二区在线| 这个男人来自地球电影免费观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 亚洲欧美日韩高清专用| 伊人久久大香线蕉亚洲五| x7x7x7水蜜桃| 美女免费视频网站| 高清在线国产一区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久久久久久久中文| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产高清有码在线观看视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 黄片小视频在线播放| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 哪里可以看免费的av片| 欧美高清成人免费视频www| 极品教师在线免费播放| 色老头精品视频在线观看| a级毛片在线看网站| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美又色又爽又黄视频| av片东京热男人的天堂| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 天堂动漫精品| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 一夜夜www| 精品福利观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久久久久人人人人人| 欧美黄色淫秽网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久久午夜综合久久蜜桃| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 免费在线观看成人毛片| 国产一区在线观看成人免费| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 免费电影在线观看免费观看| 国产1区2区3区精品| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美乱色亚洲激情| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美在线黄色| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲成av人片在线播放无| 日本a在线网址| av福利片在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲专区中文字幕在线| 中出人妻视频一区二区| 久久中文看片网| 美女被艹到高潮喷水动态| av在线天堂中文字幕| 国产精品国产高清国产av| 99riav亚洲国产免费| 人妻夜夜爽99麻豆av| www国产在线视频色| 久久久国产欧美日韩av| 日本三级黄在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 波多野结衣巨乳人妻| 国产伦人伦偷精品视频| 日本成人三级电影网站| 一级作爱视频免费观看| 免费看a级黄色片| 99热这里只有精品一区 | 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久中文看片网| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 最近最新中文字幕大全免费视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一进一出抽搐动态| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲av成人av| 搞女人的毛片| 男插女下体视频免费在线播放| 又粗又爽又猛毛片免费看| 欧美一级毛片孕妇| 香蕉av资源在线| 久久久精品大字幕| 岛国视频午夜一区免费看| 日本在线视频免费播放| 最新中文字幕久久久久 | 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 窝窝影院91人妻| 欧美黄色片欧美黄色片| 色av中文字幕| 精品国产三级普通话版| 91老司机精品| 久久中文字幕一级| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美成人性av电影在线观看| 99视频精品全部免费 在线 | 午夜福利18| 黄色丝袜av网址大全| 99在线人妻在线中文字幕| 一本综合久久免费| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产三级中文精品| 国产精品 欧美亚洲| 床上黄色一级片| 一个人看视频在线观看www免费 | 99热精品在线国产| 精品国产乱码久久久久久男人| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 操出白浆在线播放| 色噜噜av男人的天堂激情| 午夜精品一区二区三区免费看| 久久中文字幕一级| 日韩中文字幕欧美一区二区| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲午夜理论影院| 中国美女看黄片| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品久久久久久成人av| 国产一区二区在线av高清观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 两性夫妻黄色片| 最好的美女福利视频网| 伦理电影免费视频| 天天添夜夜摸| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 美女 人体艺术 gogo| 久久这里只有精品中国| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| a级毛片在线看网站| 大型黄色视频在线免费观看| 国产久久久一区二区三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产淫片久久久久久久久 | 免费无遮挡裸体视频| 成人av在线播放网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲人成网站高清观看| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美日韩黄片免| 精品久久蜜臀av无| 国产成年人精品一区二区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 欧美乱妇无乱码| 国产成人系列免费观看| 免费在线观看日本一区| 岛国在线免费视频观看| ponron亚洲| 午夜成年电影在线免费观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 午夜激情福利司机影院| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品久久视频播放| 男女床上黄色一级片免费看| 91在线观看av| 久久性视频一级片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 中文字幕久久专区| 免费搜索国产男女视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 级片在线观看| 免费大片18禁| 1000部很黄的大片| 国产成人啪精品午夜网站| 久久久久久大精品| 熟女电影av网| 久久草成人影院| 床上黄色一级片| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国内精品久久久久久久电影| 黄片小视频在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 一本一本综合久久| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产精品电影一区二区三区| a级毛片在线看网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲在线观看片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产精品久久视频播放| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲黑人精品在线| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 一区二区三区国产精品乱码| 91av网站免费观看| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 午夜精品在线福利| 久久欧美精品欧美久久欧美| 精品日产1卡2卡| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 变态另类丝袜制服| 在线a可以看的网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 又紧又爽又黄一区二区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 在线a可以看的网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 床上黄色一级片| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 性色avwww在线观看| 久久久久久人人人人人| www国产在线视频色| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日本免费a在线| 久久国产精品影院| 日韩有码中文字幕| 国内揄拍国产精品人妻在线| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 中文亚洲av片在线观看爽| x7x7x7水蜜桃| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 亚洲人成网站在线播放欧美日韩|