中華鱘促甲狀腺激素β亞基基因(TSHβ)cDNA序列的克隆及其表達(dá)分析

李創(chuàng)舉，岳華梅，葉 歡，楊曉鴿，單喜雙

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430223)

中華鱘促甲狀腺激素β亞基基因(TSHβ)cDNA序列的克隆及其表達(dá)分析

李創(chuàng)舉，岳華梅，葉 歡，楊曉鴿，單喜雙

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部淡水多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430223)

【目的】 克隆中華鱘(Acipensersinesis)促甲狀腺激素β亞基(TSHβ)基因，分析其序列特征和進(jìn)化特征，研究其在中華鱘中的組織表達(dá)特征和不同年齡垂體中的差異表達(dá)，為中華鱘生長發(fā)育調(diào)控研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)?！痉椒ā?采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，克隆中華鱘TSHβ，對其cDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行序列特征分析和系統(tǒng)發(fā)生分析；采用實(shí)時熒光定量PCR(Real-time PCR)方法，對TSHβmRNA在中華鱘肝、心、脾、性腺、腸、垂體、下丘腦、中腦、端腦、小腦和延腦等組織中的表達(dá)狀況,以及在1，3，5齡中華鱘個體垂體中的表達(dá)差異進(jìn)行研究?！窘Y(jié)果】 克隆獲得TSHβ基因，該cDNA序列全長649 bp,5′和3′端非編碼區(qū)分別為142和75 bp;開放閱讀框432 bp,編碼143 個氨基酸。TSHβ亞基成熟多肽含有12個半胱氨酸(Cys)和2個N連糖基化位點(diǎn)。氨基酸序列多重比對表明，中華鱘TSHβ與促濾泡激素β亞基和促黃體激素β亞基的一致性分別為36%和35%，但與糖蛋白激素α亞基的一致性約為10%。與其他脊椎動物的TSHβ氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，中華鱘TSHβ亞基與西伯利亞鱘一致性最高(98%)；與魚類、兩棲類、鳥類和哺乳類的序列一致性分別約為44%，55%，56%和60%；脊椎動物TSHβ的Cys和N連糖基化位點(diǎn)位置高度保守。TSHβ亞基僅在中華鱘垂體中有表達(dá)；3齡雄性個體垂體中TSHβ的表達(dá)量約為1齡的9倍，3齡和5齡雌性個體垂體中的表達(dá)量均約為1齡的5倍左右?！窘Y(jié)論】 成功獲得了中華鱘TSHβ亞基基因，該基因具有與其他動物TSHβ相似的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征；雄性個體表達(dá)量高于雌性個體，其在中華鱘個體的生長發(fā)育過程中表達(dá)量上升。

中華鱘；TSHβ；基因克隆；基因表達(dá)

魚類“下丘腦-垂體-甲狀腺”調(diào)控軸是重要的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)。在此調(diào)控軸中，下丘腦合成并分泌促甲狀腺激素釋放激素，刺激垂體分泌促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)，后者通過血液循環(huán)作用于甲狀腺，實(shí)現(xiàn)生長和生殖調(diào)控功能。TSH和促性腺激素均屬糖蛋白激素家族成員，由2個非共價鍵連接的亞基(α亞基和β亞基)構(gòu)成[1]。在同一物種中，異源二聚體蛋白的α亞基相同，其功能可能與腺苷酸環(huán)化酶的激活有關(guān)；TSHβ亞基結(jié)構(gòu)具有種屬特異性，與受體識別有關(guān)，并對TSH 的生物學(xué)活性起著決定性作用[2]。TSH的生理功能包括促進(jìn)甲狀腺的生長、對分化的甲狀腺功能的刺激，如碘的攝取和有機(jī)化、甲狀腺內(nèi)碘化甲腺氨酸的合成和釋放。此外，也有報(bào)道表明，TSH與石斑魚的性逆轉(zhuǎn)及生殖細(xì)胞發(fā)育相關(guān)[3]。

中華鱘(AcipensersinensisGray)為硬骨魚綱、軟骨硬鱗總目、鱘形目、鱘科、鱘屬魚類，國際自然保護(hù)聯(lián)盟(IUCN)瀕危級(Endangered，EN)物種，國際瀕危動植物種貿(mào)易公約(CITES)附錄Ⅱ保護(hù)物種。中華鱘個體大，生長期長，雌性初次性成熟為14～26齡(平均18齡)，雄性為8～18齡(平均12齡)，繁殖間隔長(2～7年)；中華鱘為江海洄游性魚類，棲息空間跨度大，因此，種群一旦遭到破壞，就很難恢復(fù)。近幾十年來，由于人類活動的影響(如過度捕撈、航運(yùn)、污染和水利工程等)，中華鱘的生存環(huán)境持續(xù)惡化，棲息地和產(chǎn)卵場遭到嚴(yán)重破壞，尤其是長江中游葛洲壩水利工程的修建阻斷了中華鱘的溯河產(chǎn)卵洄游路線，導(dǎo)致中華鱘產(chǎn)卵量急劇減少，野生資源量持續(xù)下降[4]。國內(nèi)外多家科研機(jī)構(gòu)對中華鱘進(jìn)行了資源動態(tài)[4-5]、自然繁殖生態(tài)[6-7]、遺傳多樣性[8-9]、人工繁殖及幼魚的培育[10-11]等理論和應(yīng)用研究，實(shí)現(xiàn)了中華鱘的全人工繁殖[12-13]，但仍有許多問題亟待解決，如人工養(yǎng)殖中華鱘個體偏小、性腺發(fā)育慢且難以發(fā)育成熟、雌雄性別發(fā)育不同步等。因此，有必要開展中華鱘生長生殖調(diào)控機(jī)理研究，以促進(jìn)人工養(yǎng)殖中華鱘的生長和生殖調(diào)控。

近年來，本實(shí)驗(yàn)室從分子和細(xì)胞水平角度系統(tǒng)研究了中華鱘生長生殖調(diào)控的分子基礎(chǔ)，通過基因克隆，從中華鱘下丘腦、垂體、肝臟和性腺中克隆鑒定了一批生長生殖和生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)控基因，如生殖調(diào)控開關(guān)Kiss/GPR54(未發(fā)表)、生長抑素[14]、促性腺激素釋放激素[15]、生長激素家族[16-17]、促性腺激素[18]、阿黑皮素原[19]、胰島素樣生長因子(未發(fā)表)、E型載脂蛋白[20]、卵殼蛋白[21]及生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)控基因pou2[22]、nanos1[23]和dazl/boule[24]等，為解析中華鱘的生長生殖調(diào)控機(jī)制提供了大量數(shù)據(jù)。本研究通過基因同源克隆，獲得了中華鱘TSHβ亞基基因的cDNA序列，并對其序列特征、同源性、組織表達(dá)特征及其在1齡、3齡和5齡中華鱘垂體中的表達(dá)變化進(jìn)行了分析，以期為進(jìn)一步研究其生長生殖調(diào)控功能提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

養(yǎng)殖中華鱘取自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所荊州太湖試驗(yàn)場，選取健康無損傷的1齡子二代中華鱘3尾，體質(zhì)量約為1 000 g/尾，在實(shí)驗(yàn)車間暫養(yǎng)2周備用。試驗(yàn)魚經(jīng)麻醉、放血，取肝、脾、心、性腺、腎、腸、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦和延腦，在液氮中速凍，然后存放于-80 ℃冰箱備用。

1.2 引物設(shè)計(jì)

首先在GenBank數(shù)據(jù)庫中搜尋TSHβ亞基基因的同源基因編碼區(qū)序列，通過Clustal X2比對分析保守區(qū)，設(shè)計(jì)引物P1F/P1R，用于擴(kuò)增中華鱘TSHβ基因保守片段；根據(jù)測序獲得的中華鱘TSHβ基因保守片段，設(shè)計(jì)引物P3和P4，分別用于擴(kuò)增TSHβcDNA的3′末端和5′末端。P5/P6為熒光定量表達(dá)的基因特異引物；β-actinF/β-actinR為熒光定量表達(dá)的內(nèi)參引物。以上引物均采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。引物信息見表1。

表1 中華鱘TSHβ亞基基因擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers used in TSHβ subunit gene PCR experiment of Chinese sturgeon

1.3 總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

將中華鱘垂體組織加入Trizol(Invitrogen,USA)，充分研磨，按照Trizol法提取總RNA。提取的RNA經(jīng)DNaseⅠ(Promega,USA)消化后用瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)(Eppendorf,Germany)檢測其質(zhì)量和濃度。使用SMARTerTMRACE cDNA Rapid Amplification(Clontech,USA)試劑盒分別合成3′RACE和5′RACE庫，-20 ℃保存。

1.4 中華鱘TSHβ基因全長cDNA序列的擴(kuò)增與序列分析

以上述3′ RACE cDNA庫為模板，P1F和P1R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25 μL，其中10×Buffer 2.5 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Taq酶(Takara,Japan)0.3 μL，模板1 μL，以去離子水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。將擴(kuò)增所得到的PCR產(chǎn)物上樣至1.5%瓊脂糖凝膠，200 V電壓下電泳18 min左右，在紫外燈下割膠回收目的片段，用DNA凝膠回收試劑盒(Omega)回收。然后將純化的PCR產(chǎn)物連入pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，經(jīng)PCR檢測后，將陽性菌株送到上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將獲得的序列進(jìn)行BLAST比對，確認(rèn)是否為中華鱘TSHβ基因序列。

根據(jù)獲得的中華鱘TSHβ保守段cDNA序列，分別設(shè)計(jì)3′ RACE和5′ RACE基因特異性引物P3和P4，按照SMARTerTMRACE cDNA Rapid Amplification(Clontech,USA)試劑盒說明書，分別進(jìn)行cDNA序列3′和5′末端的快速擴(kuò)增，凝膠回收、克隆及測序方法同上。所得序列用BLAST軟件進(jìn)行同源性分析，用ORF Finder查找開放閱讀框，并推導(dǎo)其相應(yīng)的氨基酸序列；運(yùn)用SignalP V3.0軟件預(yù)測信號肽所在位置，通過NetNGlyc 1.0來預(yù)測N連糖基化位點(diǎn);利用Cluster X進(jìn)行氨基酸序列多重比對，比對結(jié)果用Box shade程序呈現(xiàn)；運(yùn)用mega5.2進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.5 實(shí)時熒光定量PCR

提取中華鱘的心、肝、脾、腎、腸、精巢、卵巢、垂體、下丘腦、端腦、中腦、小腦、延腦組織總RNA，用于組織表達(dá)特征研究；另取實(shí)驗(yàn)室保存的3齡及5齡人工養(yǎng)殖中華鱘垂體樣本各2個，提取RNA用于TSHβ在不同年齡中華鱘垂體中的表達(dá)量變化研究，所得總RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測。取各組織總RNA 0.2 μg，用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara)試劑盒合成第一鏈cDNA，稀釋10倍后作為模板。熒光定量PCR采用引物P5/P6和內(nèi)參引物β-actinF/β-actinR。利用SYBR green real-time PCR master mix(BioRad)進(jìn)行熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL SYBR green real-time PCR master mix，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、3 μL稀釋的cDNA 模板，加去離子水補(bǔ)足體積。PCR反應(yīng)在CFX 96TMReal Time System(Bio-Rad)上完成。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，讀板溫度77 ℃，讀板時間5 s；40次循環(huán)，做熔解曲線分析溫度為65～95 ℃。所有試驗(yàn)樣品均重復(fù)3次。所得數(shù)據(jù)用2-ΔCT方法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華鱘TSHβ亞基基因cDNA全長序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列

中華鱘TSHβ亞基基因cDNA全長649 bp(不包括PolyA尾)，開放閱讀框?yàn)?32 bp，編碼143個氨基酸，5′非編碼區(qū)為142 bp， 3′非編碼區(qū)為75 bp，PolyA尾上游11 bp處有一典型的加尾信號(AATAAA)，該序列GenBank登錄號為KJ162575(圖1)。利用SignalP V3.0軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，TSHβ具有18個氨基酸的信號肽。通過軟件NetNGlyc 1.0進(jìn)行N連糖基化位點(diǎn)的預(yù)測，結(jié)果表明，TSHβ的氨基酸序列存在2個潛在的N連糖基化位點(diǎn)(Asn43和Asn92)。

圖1 中華鱘TSHβcDNA序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列
*表示終止密碼子；多聚腺苷酸加尾信號(AATAAA) 用方框標(biāo)出；信號肽序列用下劃線標(biāo)示；N連糖基化位點(diǎn)用陰影標(biāo)示
Fig.1 Nucleotide sequence of Chinese sturgeonTSHβcDNA and its deduced amino acids sequence The termination codon (TAG) is presented by ‘*’.Consensus polyadenylation signals AATAAA are boxed.The signal peptide is underlined.Potential N-glycosylation sites are shaded in gray

2.2 中華鱘TSHβ氨基酸序列的同源性分析

運(yùn)用BLAST軟件對中華鱘TSHβ蛋白進(jìn)行氨基酸序列多重比對和同源性分析，結(jié)果(圖2)表明，中華鱘TSHβ與垂體糖蛋白家族中促濾泡激素β亞基(FSHβ)和促黃體激素β亞基(LHβ)的氨基酸序列同源性分別為36%和35%，而與2種GTHα亞基的同源性較低，不超過10%。圖2結(jié)果顯示，所有亞基成熟多肽中5個Cys的位置是一致的，而3個β亞基中12個Cys的位置完全一致；中華鱘TSHβ的第1個N連糖基化位點(diǎn)與FSHβ一致，而與LHβ不同。

圖2 中華鱘糖蛋白激素亞基氨基酸序列的多重比對黑色、灰色分別表示氨基酸序列相同、相對保守。5個保守Cys殘基用數(shù)字標(biāo)出，β亞基保守的7個Cys殘基用“*”標(biāo)出。保守的糖基化位點(diǎn)加下劃線

將中華鱘TSHβ與其他魚類及更高等動物的TSHβ進(jìn)行氨基酸序列多重比對，結(jié)果見圖3。

圖3 中華鱘與其他脊椎動物TSHβ氨基酸序列的多重比對黑色、灰色分別表示氨基酸序列一致、相對保守。12個保守的Cys殘基用數(shù)字標(biāo)出，保守的N連糖基化位點(diǎn)加下劃線，中華鱘TSHβ第2個N連糖基化位點(diǎn)用“*”標(biāo)示。As(中華鱘)、Ab(西伯利亞鱘)、Aj(鰻鱺)、Ss(鮭)、Cc(鯉)、Dr(斑馬魚)、Pp(黑頭呆魚)、Nf(肺魚)、Xt(爪蟾)、Gg(雞)、Rn(大鼠)和Hs(人)
Fig.3 Multiple alignment of amino acid sequences of TSHβ subunits of Chinese sturgeon and other vertebrates Identical residues are in black,conservative substitutions are in gray.12 completely conserved Cys residues are numbered,conserved potential N-glycosylation site is underlined,and the second N-glycosylation site is presented by ‘*’.As(Acipensersinesis),Ab(Acipenserbaerii),Aj(Anguillajaponica),Ss(Salmosalar),Cc(Cyprinuscarpio),Dr(Daniorerio),Pp(Pimephalespromela),Nf(Neoceratodusforsteri),Xt(Xenopustropicalis),Gg(Gallusgallus),Rn(Rattusnorvegicus) andHs(Homosapiens)

圖3顯示，中華鱘TSHβ與西伯利亞鱘TSHβ的序列一致性最高(98%)；與人和鼠的一致性約為60%；與雞和爪蟾的一致性約為55%；但與鰻鱺、鮭魚、鯉魚、斑馬魚等魚類的序列一致性較低，約為44%；脊椎動物TSHβ氨基酸序列中Cys殘基的數(shù)目和位置一致且第1個N連糖基化位點(diǎn)也一致，但中華鱘和西伯利亞鱘具有第2個N連糖基化位點(diǎn)。

基于中華鱘糖蛋白激素亞基的鄰接(NJ)系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)表明，5個亞基分為兩類，TSHβ與FSHβ聚為一支，再與LHβ聚為一支；2種GTHα聚為一支。

圖4 基于中華鱘糖蛋白激素亞基氨基酸序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 中華鱘TSHβ的組織表達(dá)分析

經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，中華鱘TSHβ基因在垂體中大量轉(zhuǎn)錄，其相對表達(dá)量為0.30，而在其他12種組織中沒有檢測到mRNA的存在。

2.4 不同年齡中華鱘垂體中TSHβ的表達(dá)差異

1,3,5齡中華鱘垂體中TSHβ亞基mRNA的表達(dá)差異見圖5。

圖5 1,3和5齡中華鱘垂體中TSHβ亞基mRNA的表達(dá)差異1，3齡為雌、雄各1尾，5齡為2尾雌性

為了研究中華鱘生長生殖發(fā)育過程垂體TSHβ的表達(dá)變化，選取1齡、3齡和5齡中華鱘進(jìn)行研究。經(jīng)組織切片鑒定，1齡和3齡中華鱘為雌雄各1尾，5齡個體均為雌性。如圖5所示，1齡中華鱘垂體中TSHβ的表達(dá)量較低，3齡雄性的表達(dá)量約為1齡的9倍，而3齡和5齡雌性個體的表達(dá)量均約為1齡的5倍，且1齡和3齡雄性個體垂體中TSHβ的表達(dá)量明顯高于雌性。

3 討 論

TSH序列已在多種魚類上有報(bào)道，包括虹鱒[1]、大西洋鮭[2]、日本鰻鱺[25]、歐洲鰻鱺[26]、金魚[27]、鳙[28]、石斑魚[3]、團(tuán)頭魴[29]、異育銀鯽[30]和南方鲇[31]等。本研究通過基因同源克隆和RACE方法，獲得了中華鱘TSHβ亞基基因cDNA全長序列。中華鱘是古老的硬骨魚類，將中華鱘TSHβ亞基與各種脊椎動物類群TSHβ亞基及中華鱘GTHα、FSHβ和LHβ亞基氨基酸序列進(jìn)行一致性比較，結(jié)果表明，中華鱘TSHβ與同屬鱘科的西伯利亞鱘序列一致性達(dá)到98%，與兩棲類、鳥類和哺乳類等更高等動物的序列一致性大于55%，高于與魚類的一致性(44%)及與中華鱘FSHβ和LHβ亞基的一致性(35%)，遠(yuǎn)大于與中華鱘2種GTHα亞基的一致性(不超過10%)，表明垂體糖蛋白激素亞基從其共同的祖先分子中分化出來的時間要早于硬骨魚類從魚類與四足動物共同祖先中分化的時間，與Li等[32]提出的觀點(diǎn)一致。Li等[32]和Querat等[33]認(rèn)為，糖蛋白激素β亞基的祖先基因由于基因倍增，首先形成LHβ基因和TSHβ/FSHβ基因的祖先基因；本研究中，盡管TSHβ與FSHβ和LHβ亞基的一致性較高，但進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，TSHβ與FSHβ先聚為一類，再與LHβ亞基聚為一類，印證了LHβ基因先于TSHβ/FSHβ基因形成的觀點(diǎn)。

對不同脊椎動物TSHβ蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，從低等魚類至高等哺乳類，Cys殘基的數(shù)目和位置都是一致的，可形成6個二硫鍵，這對TSHβ亞基蛋白的正確折疊、特定空間結(jié)構(gòu)維持及生物學(xué)活性的實(shí)現(xiàn)起重要作用。在第3與第4個Cys殘基中間存在1個保守的N連糖基化位點(diǎn)。糖基化在蛋白的合成和分泌過程中起重要的保護(hù)作用，使糖蛋白類激素生物活性得到全面發(fā)揮[34]。中華鱘和西伯利亞鱘均具有第2個N連糖基化位點(diǎn)，顯示了鱘魚TSHβ結(jié)構(gòu)的特殊性。

已有研究表明，魚類TSHβmRNA主要在垂體中表達(dá)，垂體外組織的表達(dá)僅見于石斑魚[3]和南方鲇[31]。石斑魚TSHβ在性腺中有表達(dá)；且隨著人工性逆轉(zhuǎn)過程的推進(jìn)，其在性腺中的表達(dá)量逐漸增加，且主要定位于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞，暗示其在精子發(fā)生過程中的重要作用[3]。在南方鲇上的研究發(fā)現(xiàn)，TSHβmRNA亞基基因在多種組織中有表達(dá)，包括賁門、幽門、前腸、胰、脾、頭腎、鰓、心房、心室、皮膚、端腦、中腦和嗅球等[31]。在兩棲動物中，僅見中國大鯢性腺有TSHβ的微弱表達(dá)[35]。本研究應(yīng)用實(shí)時定量RT-PCR方法，檢測了TSHβmRNA 在中華鱘各種組織中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，TSHβ僅在垂體中大量表達(dá)，在其他組織中沒有表達(dá)，與大多數(shù)魚類的組織表達(dá)特征一致。3齡雄性及3齡和5齡雌性中華鱘垂體TSHβ的表達(dá)量分別為1齡相應(yīng)個體的9倍和5倍，暗示TSHβ在中華鱘個體的生長發(fā)育中起重要作用。另外，1齡和3齡雄性中華鱘個體TSHβ的表達(dá)量明顯高于雌性，但本研究所用樣本數(shù)較少，此結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。目前已知垂體分泌TSH的主要作用是促進(jìn)甲狀腺激素的釋放，其合成分泌分別受到下丘腦釋放的促甲狀腺激素釋放激素的正向調(diào)節(jié)及甲狀腺激素的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，但其具體功能和調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究結(jié)果為中華鱘生長發(fā)育調(diào)控、TSHβ基因結(jié)構(gòu)與功能探討、脊椎動物TSHβ進(jìn)化及進(jìn)一步開發(fā)制備相關(guān)基因工程產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。

[1] Martin A M,Wallner W,Youngson A F.Differential expression ofAtlanticsalmonthyrotropin β subunitm RNA and it DNA sequence [J].Fish Biology,1999(54):756-766.

[2] Ito M,Koide Y,Takamatsu N,et al.cDNA cloning of the β subunit of teleost thyrotropin [J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1993,90(13):6052-6055.

[3] Wang Y,Zhou L,Yao B,et al.Differential expression of thyroid-stimulating hormone β subunit in gonads during sex reversal of orange-spotted and red-spotted groupers [J].Molecular and Cellular Endocrinology,2004,220(1/2):77-88.

[4] Zhang H,Wei Q W,Kyanrd B E,et al.Spatial structure and bottom characteristics of the only remaining spawning area of Chinese sturgeon in the Yangtze River [J].Journal of Applied Ichthyology,2011(27):251-256.

[5] 陶江平，喬 曄，楊 志，等．葛洲壩產(chǎn)卵場中華鱘繁殖群體數(shù)量與繁殖規(guī)模估算及其變動趨勢分析 [J].水生態(tài)學(xué)雜志，2009，30(2)：37-43．

Tao J P,Qiao Y,Yang Z,et al.Estmiation on the spawning population and spawning sizes of Chinese sturgeon (Acipensersinensis) and trend analysis of their change in recent years [J].Journal of Hydroecology,2009,30(2):37-43.(in Chinese)

[6] 張 輝，危起偉，杜 浩，等．中華鱘自然繁殖的水文狀況適合度研究 [J].長江科學(xué)院院報(bào)，2010，27(10):75-81.

Zhang H,Wei Q W,Du H,et al.Relationship between natural spawning activities of Chinese sturgeon and suitability of hydrological conditions [J].Journal of Yangtze River Scientific Research Institute,2010,27(10):75-81.(in Chinese)

[7] 王成友.長江中華鱘生殖洄游和棲息地選擇 [D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

Wang C Y.Migrations for reproduction of Chinese sturgeon (Acipensersinensis) and its habitat selections in the Yangtze River [D].Wuhan:Huazhong Agricultural University,2012.(in Chinese)

[8] 趙 娜.基于微衛(wèi)星標(biāo)記的中華鱘繁殖群體遺傳學(xué)分析與人工繁殖對自然幼鱘群體的貢獻(xiàn)評估 [D].武漢:中國科學(xué)院水生生物研究所,2006.

Zhao N.Genetic analyses of the spawning stock of Chinese sturgeon (Acipensersinensis) and contribution assessment of artificial propagation on natural juvenile population based on microsatellite markers [D].Wuhan:Institute of Hydrobiology,Chinese Academy of Sciences,2006.(in Chinese)

[9] 邵 科，史 方，閆書祥，等．微衛(wèi)星位點(diǎn)AciG-35在中華鱘野生個體中不同等位基因的序列變異研究 [J].水生態(tài)學(xué)雜志，2014，35(1)：1-6.

Shao K,Shi F,Yan S X,et al.Allele variation of a microsatellite locus AciG-35 in individuals of wild Chinese sturgeon [J].Journal of Hydroecology,2014,35(1):1-6.(in Chinese)

[10] 顧孝連，莊 平，章龍珍，等．長江口中華鱘幼魚趨光行為及其對攝食的影響 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2009，33(5)：778-783.

Gu X L,Zhuang P,Zhang L Z,et al.Illumination intensity preference and its effects on feeding efficiency of juvenile Chinese sturgeon,Acipensersinensiscaptured from the Estuary of Yangtze River [J].Journal of Fisheries of China,2009,33(5):778-783.(in Chinese)

[11] 柴 毅，龔進(jìn)玲，杜 浩，等．中華鱘子一代配子質(zhì)量及其子二代生長特征分析 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2014，38(3)：350-355.

Chai Y,Gong J L,Du H,et al.Quality comparison of gamete of F1-generation and analysis of growth characteristics of F2-generation of Chinese sturgeon (Acipensersinensis) [J].Journal of Fisheries of China,2014,38(3):350-355.(in Chinese)

[12] 郭柏福，常劍波，肖 慧，等．中華鱘初次全人工繁殖的特性研究 [J].水生生物學(xué)報(bào)，2011，35(6)：940-945.

Guo B F,Chang J B,Xiao H,et al.The reproductive biology of first filial generation ofAcipensersinensisgrowing up in the freshwater environment [J].Acta Hydrobiology Sinica,2011,35(6):940-945.(in Chinese)

[13] 危起偉，李羅新，杜 浩，等．中華鱘全人工繁殖技術(shù)研究 [J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2013，20(1)：1-11．

Wei Q W,Li L X,Du H,et al.Research on technology for controlled propagation of cultured Chinese sturgeon (Acipensersinensis) [J].Journal of Fishery Sciences of China,2013,20(1):1-11.(in Chinese)

[14] Li C J,Wei Q W,Zhou L,et al.Molecular and expression characterization of two somatostatin genes in the Chinese sturgeon,Acipensersinensis[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular & Integrative Physiology,2009,154(1):127-134.

[15] Yue H M,Ye H,Chen X H,et al.Molecular cloning of cDNA of gonadotropin-releasing hormones in the Chinese sturgeon (Acipensersinensis) and the effect of 17β-estradiol on gene expression [J].Comparative Biochemistry and Physiology Part A:Molecular & Integrative Physiology,2013,166(4):529-537.

[16] Cao H,Zhou R J,Wei Q W,et al.Molecular characterization of the growth hormone in Chinese sturgeon including expression during embryogenesis and early larval stages [J].Journal of Applied Ichthyology,2011,27(2):501-504.

[17] Cao H,Leng X Q,Li C J,et al.EST dataset of pituitary and identification of somatolactin and novel genes in Chinese sturgeon,Acipensersinensis[J].Molecular Biology Report,2012,39(4):4647-4653.

[18] Cao H,Zhou L,Zhang Y Z,et al.Molecular characterization of Chinese sturgeon gonadotropins and cellular distribution in pituitaries of mature and immature individuals [J].Molecular and Cellular Endocrinology,2009,303(1/2):34-42.

[19] 曹 宏，李創(chuàng)舉，危起偉，等.中華鱘阿黑皮素原cDNA序列克隆及其序列分析 [J].水生生物學(xué)報(bào)，2011，35(5)：776-782.

Cao H,Li C J,Wei Q W,et al.cDNA clone and sequence analysis of proopiomelanocortin in Chinese sturgeonAcipensersinensis[J].Acta Hydrobiology Sinica,2011,35(5):776-782.(in Chinese)

[20] Li C J,Gan F,Chen X H,et al.Molecular and expression analysis of apolipoprotein E gene in the Chinese sturgeon,Acipensersinensis[J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2011,158(1):64-70.

[21] Li C J,Wei Q W,Chen X H,et al.Molecular characterization and expression pattern of three zona pellucida 3 genes in the Chinese sturgeon,Acipensersinensis[J].Fish Physiology and Biochemistry,2011,37(3):471-484.

[22] Ye H,Du H,Chen X H,et al.Identification of apou2 ortholog in Chinese sturgeon,Acipensersinensisand its expression patterns in tissues,immature individuals and during embryogenesis [J].Fish Physiology and Biochemistry,2012,38(4):929-942.

[23] Ye H,Chen X H,Wei Q W,et al.Molecular and expression characterization of ananos1 homologue in Chinese sturgeon,Acipensersinensis[J].Gene,2012,511(2):285-292.

[24] 葉 歡.中華鱘幾個生殖細(xì)胞相關(guān)基因的克隆和表達(dá)特征研究 [D].上海：上海海洋大學(xué)，2012.

Ye H.Cloning and expression characterization of several germ cell-related genes in Chinese sturgeon,Acipensersinensis[D].Shanghai:Shanghai Ocean University,2012.(in Chinese)

[25] Han Y S,Liao I C,Tzeng W N,et al.Cloning of the cDNA for thyroid stimulating hormone beta subunit and changes in activity of the pituitary-thyroid axis during silvering of the Japanese eel,Anguillajaponica[J].Journal of Molecular Endocrinology,2004,32(1):179-194.

[26] Salmon C,Marchelidon J,Fontaine Y A,et al.Cloning and sequence of thyrotropin (β)-subunit of a teleost fish,the eel (AnguillaanguillaL.) [J].Comptes Rendus de l’ Academie des Sciences Serie Ⅲ:Sciences de la Vie,1993,316(8):749-753.

[27] Yoshiura Y,Sohn Y C,Munakata A,et al.Molecular cloning of the cDNA encoding the subunit of thyrotropin and regulation of its gene expression by thyroid hormones in the goldfish,Carassiusauratus[J].Fish Physiology and Biochemistry,1999,21:201-210.

[28] Chatterjee A,Hsieh Y L,Yu J Y.Molecular cloning of cDNA encoding thyroid stimulating hormone subunit of bighead carpAristichthysnobilisand regulation of its gene expression [J].Molecular and Cellular Endocrinology,2001,174(1/2):1-9.

[29] 曲憲成，楊艷紅，劉其根，等．團(tuán)頭魴促甲狀腺激素β亞基基因的克隆及序列分析 [J].中國水產(chǎn)科學(xué)，2006，13(1)：128-133.

Qu X C,Yang Y H,Liu Q G,et al.Cloning and sequence analysis of thyrotropin β subunit gene ofMegalobramaamblycephala[J].Journal of Fishery Sciences of China,2006,13(1):128-133.(in Chinese)

[30] 曲憲成，楊艷紅，劉 穎．異育銀鯽促甲狀腺激素β亞基基因的克隆及序列分析 [J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，15(2)：129-135.

Qu X C,Yang Y H,Liu Y.Cloning and characterization of thyrotropin β subunit gene fromCarassiusauratus[J].Journal of Shanghai Fisheries University,2006,15(2):129-135.(in Chinese)

[31] 謝碧文．南方鲇POMC、TSH亞基和SL cDNA克隆及垂體技術(shù)的時空表達(dá)研究 [D].重慶：西南大學(xué)，2008.

Xie B W.Cloning of cDNAs encoding the proopiomelanocortin,thyrotropin β subunit and somatolactin,and spatio-temporal expression of pituitary hormones inSilurusmeridrionalis[D].Chongqing:Southwest University,2008.(in Chinese)

[32] Li M D,Ford J J.A comprehensive evolutionary analysis bas-ed on nucleotide and amino acid sequences of the α- and β-subunits of glycoprotein hormone gene family [J].Journal of Endocrinology,1998,156(3):529-542.

[33] Querat B,Sellouk A,Salrnon C.Phylogenetic analysis of the vertebrate glycoprotein hormone family including new sequences of sturgeon (Acipenserbaeri) beta subunits of the two gonadotropins and the thyroid-stimulating hormone [J].Biology of Reproduction,2000,63(1):222-228.

[34] Hsieh Y L,Chowdhury I,Chien J T,et al.Molecular cloning and sequence analysis of the cDNA encoding thyroid-stimulating hormone β subunit of common duck and mule duck pituitaries:Invitroregulation of steady-state TSH β mRNA level [J].Comparative Biochemistry and Physiology Part B:Biochemistry and Molecular Biology,2007,146(3):307-317.

[35] 楊麗萍，楊慧榮，張 勇，等．中國大鯢腦cDNA文庫構(gòu)建及促甲狀腺激素β亞基基因cDNA的克隆和序列分析 [J].水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2008，32(4)：507-516.

Yang L P,Yang H R,Zhang Y,et al.Construction of cDNA library from the brain of Chinese giant salamanderAndriasdavidianuswith cloning and sequence analysis of the cDNA encoding thyroid-stimulating hormone β subunit [J].Journal of Fisheries of China,2008,32(4):507-516.(in Chinese)

Cloning and expression analysis ofTSHβsubunit gene in Chinese sturgeon,Acipensersinesis

LI Chuang-ju,YUE Hua-mei,YE Huan,YANG Xiao-ge,SHAN Xi-shuang

(KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina,YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan,Hubei430223,China)

【Objective】 The thyroid-stimulating hormone β (TSHβ) gene inAcipensersinesiswas cloned to analyze its sequence characterization,phylogenetic specificity,tissue expression pattern,and differential expression in pituitaries of Chinese sturgeons at different ages.This study would provide basic data for further research on the growth metabolism regulation of Chinese sturgeon.【Method】 The reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and rapid amplification of cDNA ends (RACE) were used for the isolation of the full length cDNA ofTSHβsubunit from pituitary of Chinese sturgeon.Multiple sequence alignment and phylogenetic analysis were conducted on the deduced amino acid ofTSHβ.Then,the distributions ofTSHβmRNA in different tissues (liver,heart,spleen,testis,ovary,kidney,intestine,pituitary,hypothalamus,medulla oblongata,cerebellum,midbrain and endbrain) and in pituitaries at different ages were examined by real-time PCR.【Result】 The full-length cDNA ofTSHβwas 649 bp,containing a 142 bp 5′-untranslated region (UTR), a 75 bp 3′ UTR and a 432 bp open reading frame (ORF) with a peptide of 143 amino acids.The deduced amino acid of TSHβ subunit contained a putative signal peptide of 18 amino acids,with the mature protein encompassing 12 cysteine (Cys) residues and 2 putative N-glycosylation sites.Multiple sequence alignment showed that,in Chinese sturgeon,TSHβ subunit showed 36% and 35% sequence identity to the follicle-stimulating hormone β subunit (FSHβ) and the luteinizing hormone β subunit (LHβ),followed by only 10% sequence identity to the glycoprotein hormone α subunits.Moreover,Chinese sturgeon TSHβ subunit shared the highest sequence identity (98%) with Siberian sturgeon,and showed only 44%,55%,56% and 60% identity to teleosts,amphibians,birds and mammals,respectively.The 12 Cys and 1 putative N-glycosylation site were completely conserved among vertebrates examined. Real-time PCR analysis indicated that theTSHβmRNA was only expressed abundantly in the pituitary and its expression levels in the pituitaries of 3-year old male and 3- and 5-year old females was about 9 and 5 times to that of 1-year old individuals,respectively.【Conclusion】 TheTSHβgene inA.sinesiswas cloned,and it possessed similar sequence structure and expression pattern with its counterparts in other vertebrates.Its mRNA transcription level in males was higher than in females,and showed an increasing trend during the growth of Chinese sturgeons.

Chinese sturgeon;TSHβ;gene cloning;gene expression

時間:2015-10-13 08:46

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.11.001

2014-03-28

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2011AA100401)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31001104)；中國水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(2013A0403)

李創(chuàng)舉(1980-)，男，湖南邵陽人，副研究員，博士，主要從事魚類分子遺傳學(xué)研究。E-mail:lcj@yfi.ac.cn

S965.215

A

1671-9387(2015)11-0001-08

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20151013.0846.002.html