反相-高效液相色譜法同時測定消炎顆粒中綠原酸與秦皮乙素的含量

王俊杰 ，劉 弘，張玲昂，張松亮(解放軍第152 中心醫(yī)院藥學(xué)部，河南 平頂山 467000)

消炎顆粒是由金銀花、紫花地丁、魚腥草、射干、大青葉、半枝蓮等6 味中藥組成的復(fù)方制劑(批準(zhǔn)文號:濟制字(2011)B11049)，具有清肺熱、解毒消炎之功效，常用于呼吸道感染等疾?。?］。多年來，消炎顆粒在解放軍第152 中心醫(yī)院的臨床應(yīng)用中顯示出了確切的療效，且無明顯不良反應(yīng)。為更好地有效控制制劑質(zhì)量，本研究選擇方中君藥金銀花、臣藥紫花地丁中的有效成分綠原酸、秦皮乙素為質(zhì)控指標(biāo)，采用反相-高效液相色譜法(reversed-phase high performance liquid chromato-graphy，RP-HPLC)同時測定制劑中2 種成分的含量，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT 高效液相色譜儀、LC solution 色譜工作站、SPD-M20A 二極管陣列檢測器(日本島津公司)。綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110753-200413，純度≥98%);秦皮乙素對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110741-200506，純度≥98%);消炎顆粒(解放軍第152 中心醫(yī)院，規(guī)格:10 g/袋，批號:140501、140601、140701);甲醇、乙腈、磷酸均為色譜級，水為純化水，其他均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Inertsil ODS-3 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相:乙腈-0.1%磷酸溶液(V ∶V=10 ∶90)，柱溫:30 ℃;檢測波長:327、353 nm;進樣量:10 μl。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品10.26 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為102.6 μg/ml 的綠原酸對照品儲備液。精密稱取秦皮乙素對照品10.67 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為106.7 μg/ml 的秦皮乙素對照品儲備液。精密量取綠原酸對照品儲備液、秦皮乙素對照品儲備液各2 ml，置于同一10 ml 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為20.52、21.34 μg/ml 的綠原酸、秦皮乙素混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取消炎顆粒2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇50 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率320 W，頻率40 KHz)30 min;放冷，再稱定質(zhì)量，補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過;用0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備

按處方比例稱取缺金銀花、紫花地丁的其他藥材，按制備工藝制備缺金銀花、紫花地丁的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.5 陰性干擾試驗

取上述對照品溶液、供試品及陰性對照溶液，按上述色譜條件采用RP-HPLC 法測定，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，供試品與對照品在相同保留時間處有目標(biāo)峰，陰性樣品無干擾，見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取綠原酸、秦皮乙素對照品儲備液各1、2、4、6、8 ml，分別置于10 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，按上述色譜條件進樣10 μl 測定，記錄其峰面積。以對照品進樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，以最小二乘法進行線性回歸擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。綠原酸回歸方程為Y=686 752X+36 739(r=0.999 9)，表明綠原酸進樣量在0.103 ～0.821 μg 范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好;秦皮乙素回歸方程為Y=773 396X+75 261(r=0.999 8)，表明秦皮乙素進樣量在0.107 ～0.854 μg 范圍內(nèi)，其線性關(guān)系良好。

2.7 精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液10 μl，按上述色譜條件重復(fù)進樣5 次，記錄其峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸的RSD為1.38%，秦皮乙素的RSD為1.66%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液10 μl，按上述色譜條件分別于0、1、2、4、8、12、24 h 進樣測定，每次記錄其峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸的RSD為1.52%，秦皮乙素的RSD為1.77%，表明供試品溶液24 h 穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗

取同一批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣測定5 次，每次10 μl，記錄其峰面積。結(jié)果顯示，綠原酸的平均含量為0.38 mg/g、RSD為1.52%，秦皮乙素的平均含量為0.18 mg/g、RSD為1.29%，表明本方法重復(fù)性好。

圖1 HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram

2.10 加樣回收率試驗

取已知綠原酸、秦皮乙素含量的消炎顆粒樣品1 g，精密稱定，按80%、100%、120%分別精密加入綠原酸、秦皮乙素對照品適量，照“2.3”項下方法制備樣品溶液，按上述色譜條件進樣10 μl，測定峰面積，計算綠原酸、秦皮乙素平均回收率，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果Tab 1 Test results of recovery rate

2.11 樣品含量測定

制劑中有效成分含量的高低會影響療效，控制指標(biāo)成分含量可以保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，為制劑質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。取3 批樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件對3 批樣品進行含量測定，結(jié)果見表2。

表2 3 批樣品中綠原酸、秦皮乙素含量測定結(jié)果(mg/g)Tab 2 Determination results of chlorogenic acid and esculetin in three batches samples(mg/g)

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

在本研究預(yù)實驗過程中曾考察以下流動相體系:甲醇-0.4%磷酸溶液梯度(V ∶V =20 ∶80)［2］、乙腈-0.1%磷酸溶液(V ∶V=12 ∶88)［3］、甲醇-冰醋酸(V ∶V =15 ∶85)［4］、乙腈-0.4%磷酸溶液(V ∶V=15 ∶85)［5］。結(jié)果顯示，在乙腈-0.1%磷酸溶液(V ∶V =10 ∶90)流動相體系下，指標(biāo)成分色譜峰峰形好，分離度好，柱效高，陰性無干擾，專屬性強，可以為同類指標(biāo)成分的測定提供參考。

3.2 指標(biāo)成分的選擇

選用消炎顆粒組方君臣藥中的綠原酸、秦皮乙素成分為質(zhì)控指標(biāo)，與該制劑的功能主治相符，符合中醫(yī)藥配伍理論，可客觀反映制劑的質(zhì)量水平。

3.3 樣品制備方法的選擇

本研究分別選擇甲醇［1］、50%甲醇［6］、75%乙醇［7-8］溶液作為溶劑超聲30 min 處理樣品。結(jié)果顯示，在3 種溶劑中經(jīng)超聲后，指標(biāo)成分均分離較好，考慮甲醇毒性較大，故本研究選擇75%乙醇為溶劑超聲30 min 后，取適量超聲液定容后備用。

綜上所述，本法分離度好、回收率高、陰性無干擾，且簡便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于該制劑的質(zhì)量控制。

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