綠色魏斯氏菌ORC4的抗氧化、降膽固醇作用

劉長(zhǎng)建， 劉 秋， 姜 波， 閆建芳， 齊小輝

（大連民族學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600）

綠色魏斯氏菌ORC4的抗氧化、降膽固醇作用

劉長(zhǎng)建， 劉 秋*， 姜 波， 閆建芳， 齊小輝

（大連民族學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600）

從風(fēng)干香腸中分離得到一株生長(zhǎng)良好的乳酸菌ORC4，菌株能產(chǎn)乳酸、革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶陰性。經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合菌落形態(tài)、細(xì)胞形態(tài)、生化反應(yīng)試驗(yàn)，確定菌株ORC4為綠色魏斯氏菌。綠色魏斯氏菌ORC4的完整和破碎細(xì)胞對(duì)O2-·、DPPH·和·OH的清除率都與細(xì)胞濃度呈正相關(guān)。在細(xì)胞濃度為5×108CFU/mL時(shí)，菌株ORC4破碎細(xì)胞對(duì)O2-·、DPPH·和·OH的清除率都高于完整細(xì)胞，分別為45.17%、56.17%和54.01%。菌株ORC4還能清除培養(yǎng)基中最多為

風(fēng)干香腸；綠色魏斯氏菌；16S rDNA；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；抗氧化作用；降膽固醇作用

魏斯氏菌屬（Weissella）與乳桿菌屬十分相似，也是兼性厭氧、觸酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性，但呈鏈狀排列的短桿形或類球形。魏斯氏菌作為乳酸菌廣泛存在于肉制品、泡菜等發(fā)酵食品中，通過(guò)16S rRNA序列、23S rRNA序列的研究發(fā)現(xiàn)，與乳桿菌屬、明串珠菌屬相近的這一個(gè)族群應(yīng)放在屬的分類位置，Collin等提出了魏斯氏菌屬（Weissella）[1]，并在1994年得到確認(rèn)[2]。當(dāng)時(shí)共有7個(gè)種都?xì)w到該屬，包括Niven等1957年從熏肉中分離到的新種，最初命名為L(zhǎng)actobacillus viridescens[3]，而現(xiàn)在命名為Weissella viridescens，是這個(gè)屬的第一個(gè)被分離的種，并作為該屬的模式菌株。2013年分別從駝螽的消化道[4]、發(fā)酵可可豆[5]和發(fā)酵的谷物[6]中又分離到3個(gè)新種，到現(xiàn)在魏斯氏菌屬共有18個(gè)種。

食物發(fā)酵的通常乳酸菌屬包括肉食桿菌屬、腸球菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬、四鏈球菌屬、魏斯氏菌屬[7]。而魏斯氏菌屬是植物發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)菌群，能提供了幾種潛在的保健和營(yíng)養(yǎng)作用[8]，包括食物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，控制腸道感染，改善乳糖的消化，控制膽固醇水平，以及多個(gè)癌癥的發(fā)病[9]。因?yàn)槿樗峋陌l(fā)酵產(chǎn)品能吸收血液中的膽固醇，降低血液中的膽固醇濃度，這對(duì)于預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和心腦血管疾病是至關(guān)重要的[10-11]。同時(shí)乳酸菌還顯示了具有非常強(qiáng)的清除氧自由基的能力，能在食用含有抗氧化作用的食物時(shí)，對(duì)其致癌作用的各個(gè)階段起到預(yù)防作用[9]。作者從傳統(tǒng)風(fēng)干香腸中分離出乳酸菌，對(duì)其抗氧化活性等益生特性進(jìn)行了體外評(píng)估，為乳酸菌替代抗氧化劑的應(yīng)用和進(jìn)一步研究打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料發(fā)酵食品風(fēng)干香腸：購(gòu)自大連市場(chǎng)；主要試劑膽固醇、乙酸等：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。鄰苯二甲醛（Sigma），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（Johnson Matthey）；PCR反應(yīng)所用的相關(guān)試劑：購(gòu)于大連寶生物。

1.1.2 主要儀器UV-2450分光光度計(jì)：日本島津；DNP-9052恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏；JY92-IIN超聲破碎儀：寧波新芝；TC-512基因擴(kuò)增儀：Techne。

1.2 培養(yǎng)基

分離用培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基（Merck）和M17培養(yǎng)基（Oxoid）。其它培養(yǎng)基：PY培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、含6.5、18 g/dL NaCl的MRS培養(yǎng)基[12]和含0.10 mg/mL膽固醇的膠束液體培養(yǎng)基[13-14]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的初步分離及純化取1.0 g樣品加入9.0 mL無(wú)菌水室溫浸泡24 h。連續(xù)稀釋后涂布于含碳酸鈣的兩種分離固體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24～48 h。挑取產(chǎn)生溶鈣圈的單菌落，純化兩次。篩選過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性、發(fā)酵產(chǎn)乳酸[15]的菌株進(jìn)行下一步研究。

1.3.2 菌落形態(tài)、菌體細(xì)胞形態(tài)及生理生化特性乳酸菌接種平板后，37℃培養(yǎng)48 h后，記錄菌落邊緣形狀、大小、顏色等菌落特征。同時(shí)高倍顯微觀察菌體革蘭氏染色、個(gè)體形狀、大小等細(xì)胞特征。分別測(cè)定菌株在10℃和45℃的生長(zhǎng)情況、運(yùn)動(dòng)性、耐鹽性、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗(yàn)等生理生化特征[12]。

1.3.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定將純化得到的菌種在37℃條件培養(yǎng)2 d后，離心收集菌體；提取細(xì)菌總DNA。采用通用引物對(duì)其16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序后將序列輸入NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中，與基因庫(kù)核酸序列進(jìn)行比對(duì)。并利用MEGA5.0軟件中鄰接法（Neighbor-Joining），采用Kimura-2參數(shù)模型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建[15]。

1.3.4 乳酸菌的降膽固醇性能測(cè)定鄰苯二甲醛法的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定[16-17]，質(zhì)量濃度范圍為5～25 μg/mL。乳酸菌液體培養(yǎng)活化后，以5%接種體積分?jǐn)?shù)接種于含膽固醇液體培養(yǎng)基，37℃分別培養(yǎng)24、36、48、60 h。搖勻后取菌懸液離心，取沉淀經(jīng)冷凍干燥后稱量干重；另取0.5 mL培養(yǎng)液加3 mL的95%乙醇，再加2 mL氫氧化鉀乙醇溶液（12 g/dL）；充分混勻后60℃水浴加熱20 min；迅速冷卻后，加入5 mL正己烷，充分混勻（20 s～1 min），加3 mL無(wú)菌超純水；取上清液加正己烷2.5 mL于10 mL具塞試管中，60℃氮吹干，加2 mL冰乙酸溶解，加2 mL顯色劑 （1.0 mg/mL鄰苯二甲醛/冰乙酸溶液）、2 mL濃硫酸迅速充分混勻；放置10 min，550 nm條件下測(cè)吸光度值[16-17]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定膽固醇濃度，同時(shí)測(cè)定培養(yǎng)基初始的膽固醇質(zhì)量濃度。

1.3.5 乳酸菌的體外抗氧化試驗(yàn)取10 mL培養(yǎng)液，8 000 r/min離心10 min，無(wú)菌水洗滌3次，制成菌懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至109CFU/mL[15]。所得菌懸液分為兩組，一組作為完整細(xì)胞組；另一組超聲破碎儀280 W，間隔5 s處理5 s，至顯微鏡下檢查沒(méi)有完整菌體為止，大約10 min。采用Fenton體系測(cè)定乳酸菌對(duì)羥自由基 （·OH）的清除活性[15，18]；測(cè)定乳酸菌對(duì)DPPH自由基的清除活性[15，18]；鄰苯三酚自氧化法測(cè)定乳酸菌對(duì)超氧陰離子自由基（O2－）的清除活性[15，18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的初步篩選

共篩選出13株疑似乳酸菌，接觸酶試驗(yàn)篩選出8株陰性菌株。高效液相色譜法對(duì)發(fā)酵液的檢測(cè)結(jié)果表明，8株均產(chǎn)乳酸。選取生長(zhǎng)較好的一株ORC4進(jìn)一步研究。

2.2 菌株的多相鑒定

2.2.1 菌落、細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)特性觀察乳酸菌ORC4菌落呈乳白色、低凸面、表面光滑，直徑小于0.3 mm；細(xì)胞呈近球形或者短桿狀，革蘭氏染色為陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。兼性厭氧，不運(yùn)動(dòng)，不形成芽孢；6.5、18 g/dL NaCl和45℃條件均能生長(zhǎng)，而在10℃不能生長(zhǎng)，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，見(jiàn)表1。

2.2.2 16S rDNA序列分析以菌株 ORC4總的DNA為模板，獲得了1條長(zhǎng)度1 410 bp特異的擴(kuò)增條帶，序列的GenBank登錄號(hào)為KC108670。通過(guò)Blast程序與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ORC4與Weissella viridescens NRIC 1536（T）的相似性為100%。將魏斯氏菌屬現(xiàn)有18個(gè)種[20]的模式菌16S rRNA序列，與菌株ORC4進(jìn)行聚類分析，見(jiàn)圖2。菌株ORC4與W.viridescens NRIC 1536（T）在同一分支上。結(jié)合菌株的形態(tài)特征、生理生化特征，可以確定菌株ORC4屬于魏斯氏菌屬（Weissella）中的綠色魏斯氏菌（W.viridescens）。

圖1 菌株細(xì)胞形態(tài)的顯微觀察（×100）Fig.1 Cells morphology of the strain（×100）

表1 菌株的生長(zhǎng)特性Table 1 Growth characteristics of the strains

圖2 菌株ORC4和參比明串珠菌屬菌株的16S rDNA同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree based 16S rDNA sequences similarity of strain ORC4 and the reference strains

2.3乳酸菌的益生特性研究

2.3.1 乳酸菌降膽固醇能力測(cè)試室溫條件下，測(cè)定膽固醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：Y=6.539 3X+0.002 7，R2=0.998 5，說(shuō)明膽固醇質(zhì)量濃度（X）和吸光值（Y）呈良好的線性關(guān)系，可以用該法測(cè)定培養(yǎng)基中膽固醇的質(zhì)量濃度。

乳酸菌ORC4能降低培養(yǎng)基中的膽固醇，見(jiàn)圖3。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，膽固醇降解量和單位細(xì)胞干重的降膽固醇量均升高；而在36～48 h之間，膽固醇降解速度和單位細(xì)胞干重的降膽固醇速度都有明顯增加的趨勢(shì)；但在60 h，菌株ORC4能清除35.87 μg/mL的膽固醇，而單位細(xì)胞干重的降膽固醇量與48 h時(shí)相比基本不變，為19.87 μg/mg。

圖3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)乳酸菌降膽固醇的影響Fig.3 Cholesterol-lowering ratio of LAB during growth

2.3.2 乳酸菌對(duì)自由基清除活性的測(cè)定由圖4可以看出，乳酸菌ORC4的完整細(xì)胞和破碎細(xì)胞對(duì)O2-·、·OH和DPPH·均有清除能力，且清除率與細(xì)胞濃度（破碎細(xì)胞也以細(xì)胞濃度作為單位）呈正相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞濃度為5×108CFU/mL時(shí)，破碎細(xì)胞對(duì)三個(gè)自由基的清除率都大于45%，對(duì)DPPH的清除率最高，為56.17%；均高于完整細(xì)胞對(duì)自由基的清除（完整細(xì)胞的清除率均低于40%），完整細(xì)胞對(duì)·OH的清除率最低，只有14.73%。細(xì)胞破碎對(duì)·OH的清除率影響最大，達(dá)到54.01%。

3 結(jié)語(yǔ)

乳酸菌在自然界分布廣泛，作者從發(fā)酵香腸中初步分離得到H2O2酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性、發(fā)酵液產(chǎn)乳酸的乳酸菌13株，從中篩選到一株生長(zhǎng)良好的乳酸菌ORC4。根據(jù)菌落、細(xì)胞形態(tài)、生理生化特性、以及16S RrDNA序列比對(duì)，可鑒定ORC4為綠色魏斯氏菌。

圖4 完整細(xì)胞和破碎細(xì)胞對(duì)自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of intact cells and intracellular extract on hydroxyl radical

經(jīng)過(guò)抗氧化測(cè)定試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)綠色魏斯氏菌ORC4對(duì)自由基O2-·、DPPH·和·OH都有一定的清除能力，其細(xì)胞濃度（包括完整細(xì)胞和破碎細(xì)胞）與自由基的清除率均分別呈正相關(guān)。在細(xì)胞濃度為5×108CFU/mL時(shí)，菌株ORC4破碎細(xì)胞對(duì)O2-·、DPPH·和·OH的清除率都大于45%；而完整細(xì)胞對(duì)3種自由基的清除率均低于40%；破碎細(xì)胞對(duì)·OH的清除率變化最大，完整細(xì)胞為14.73%而破碎細(xì)胞為54.01%。體外降膽固醇試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綠色魏斯氏菌ORC4具有降解培養(yǎng)基中膽固醇的能力，降解量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加、菌體量的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，菌株ORC4在36～48 h對(duì)膽固醇的降解量增加明顯；而在48 h后的降解趨勢(shì)進(jìn)入一個(gè)平穩(wěn)期，單位細(xì)胞干重的降膽固醇量為19.89 μg/mg；在60 h時(shí)，膽固醇降解量是35.87 μg/mL。

當(dāng)前對(duì)心血管疾病的藥物治療，因其相對(duì)成本高和相關(guān)聯(lián)的副作用，不被認(rèn)為是長(zhǎng)期的最佳選擇[9]。乳酸菌能通過(guò)改善腸道微生態(tài)平衡清除自由基實(shí)現(xiàn)延緩衰老[8]。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的相關(guān)乳酸菌種類主要集中在乳桿菌屬，如嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌等[21-22]。對(duì)魏斯氏菌屬的抗氧化、降膽固醇能力的研究很少，本實(shí)驗(yàn)篩選出的一株綠色魏斯氏菌，并對(duì)其清除自由基、去除膽固醇的能力進(jìn)行了研究，這樣就可以充分利用乳酸菌開(kāi)發(fā)出功能性發(fā)酵食品、提高發(fā)酵食品的附加值。

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Antioxidative and Cholesterol-Rducing Ability of Weissella viridescens ORC4 from Dry Fermented Sausages

LIU Changjian， LIU Qiu*， JIANG Bo， YAN Jianfang， QI Xiaohui
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China）

A Gram （＋），non-motile，facultatively anaerobic，rod-or coccoid-shaped bacterium，designated strain ORC4，was isolated from the dry fermented sausages.The 16S rRNA gene sequence analysis showed that strain ORC4 belonged to the genus Weissella，with highest sequence similarity to Weissella viridescens NRIC1536（100%）.The intact cells and intracellular extract of strain ORC4 could inhibit O2-·，DPPH·，and·OH.Three free radicals-scavenging ratios of intracellular extract were positively correlated with bacterial density，respectively，the intact cells could do the same.The intracellular extract had higher scavenging ratios on three free radicals than the intact cells.At a concentration of 5×108CFU/mL，scavenging ratios of intracellular extract on O2-·，DPPH·and·OH were 45.17%，56.17%and 54.01%respectively.In addition，strain ORC4 could reduce 35.87 μg/mL cholesterol，and the unit cell dry weight of cholesterol removal rate was 19.89 μg/mg.

dry fermented sausages，Weissella viridescens，16S rDNA，phylogenetic tree，antioxidative effect，cholesterol-reducing ability

TS 201.3

A

1673—1689（2015）05—0512—05

2014-02-11

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31070005）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（DC12010103，DC120101034）。

劉長(zhǎng)建（1975—），男，遼寧普蘭店人，工學(xué)碩士，高級(jí)工程師，主要從事應(yīng)用微生物方面的研究。E-mail：lcj@dlnu.edu.cn

*通信作者：劉 秋（1969—），女，遼寧普蘭店人，農(nóng)學(xué)博士，教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事放線菌應(yīng)用方面的研究。

E-mail：liuqiu@dlnu.edu.cn

35.87 μg/mL的膽固醇，單位細(xì)胞干重的膽固醇清除率為19.89 μg/mg。