內(nèi)切葡聚糖酶與木聚糖酶在畢赤酵母中的共分泌表達(dá)

劉高磊， 胡 蝶， 鄔敏辰， 殷 欣， 汪俊卿

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

內(nèi)切葡聚糖酶與木聚糖酶在畢赤酵母中的共分泌表達(dá)

劉高磊1， 胡 蝶2， 鄔敏辰*3， 殷 欣2， 汪俊卿2

（1.江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214122）

為實(shí)現(xiàn)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶在畢赤酵母中的共分泌表達(dá)，進(jìn)而降低酶制劑的生產(chǎn)成本，構(gòu)建含木聚糖酶基因的重組表達(dá)載體pPICZαA-Aoxyn11A，經(jīng)Sac I線性化后，電轉(zhuǎn)化至含內(nèi)切葡聚糖酶基因Aucel12A的重組畢赤酵母GSC7中，獲得雙重重組畢赤酵母GSCX8。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)后，GSCX8發(fā)酵上清液中內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的活性分別為47.77 IU/mL和192.71 IU/mL，為單獨(dú)表達(dá)菌株GSC7和GSX5的85%和80%。酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，內(nèi)切葡聚糖酶的最適pH為4.0，在pH 3.0～8.5穩(wěn)定；最適溫度為50℃，在60℃以下穩(wěn)定。木聚糖酶的最適pH為5.5，在pH 3.0～10.0穩(wěn)定；最適溫度為55℃，在50℃以下穩(wěn)定。GSCX8遺傳穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明，內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定的共表達(dá)。

內(nèi)切葡聚糖酶；木聚糖酶；畢赤酵母；共分泌表達(dá)

內(nèi)切-1，4-β-D-葡聚糖酶 （EG，endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4）是纖維素酶系的重要組成部分，它可在纖維素鏈上隨機(jī)切割β-D-1，4-葡糖苷鍵生成較小相對(duì)分子質(zhì)量的纖維寡糖[1]。內(nèi)切-β-1，4-D-木聚糖酶（β-1，4-endoxylanase，EC 3.2.1.8）通過作用于木聚糖主鏈內(nèi)部的β-D-1，4-木糖苷鍵，將半纖維素的主要成分之一木聚糖降解為低聚木糖[2]。兩種酶在食品加工、釀酒、飼料加工，以及生物能源等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用價(jià)值[3-4]。

在植物細(xì)胞壁中，木聚糖和甘露聚糖等半纖維素的主要成分在纖維素周圍形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在酶催化水解過程中，阻礙了酶分子與底物的有效結(jié)合。然而，在纖維素酶與半纖維素酶的聯(lián)合作用下，可在一定程度上打破空間位阻，從而提高纖維素和半纖維素的水解率。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，來源于GH11和GH10家族的2種耐熱木聚糖酶在水解麥麩時(shí)均可與纖維素酶發(fā)生協(xié)同作用。Anikó Várnai等[6]發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶、甘露聚糖酶和纖維素酶聯(lián)合催化預(yù)處理的軟木時(shí)，多糖的總水解率遠(yuǎn)大于3種酶單獨(dú)作用時(shí)的水解率之和。目前，國內(nèi)外已有關(guān)于構(gòu)建功能相關(guān)蛋白質(zhì)共表達(dá)菌株的報(bào)道，通過將多個(gè)外源基因在同一宿主中共表達(dá)，降低外源蛋白質(zhì)的生產(chǎn)成本。黃生平等[7]構(gòu)建了一個(gè)雙基因表達(dá)分泌質(zhì)粒pHBM907-phyA-man，在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了植酸酶和甘露聚糖酶的分泌表達(dá)。高秋芳等[8]將pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中，獲得了一株高效表達(dá)木聚糖酶和果膠酶的畢赤酵母菌株P(guān)X6。

作者所在研究室前期克隆了一種來源于宇佐美曲霉 （Aspergillus usamii）E001的內(nèi)切葡聚糖酶基因Aucel12A（GenBank登錄號(hào)：JN128871）和一種來源于米曲霉（Aspergillus.oryzae）CICC41086的木聚糖酶基因 Aoxyn11A （GenBank登錄號(hào)：XM_001823746）。本課題研究過程中將Aoxyn11A基因連接到pPICZαA表達(dá)質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化至含有pPIC9K-Aucel12A的重組畢赤酵母中，構(gòu)建雙重重組畢赤酵母，成功實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的共分泌表達(dá)，該研究進(jìn)展國內(nèi)尚未見報(bào)道。同時(shí)，對(duì)重組表達(dá)的這兩種酶的酶學(xué)性質(zhì)及雙重重組畢赤酵母的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。本研究中構(gòu)建了雙酶表達(dá)，降低了生產(chǎn)成本，可為多個(gè)功能相關(guān)的外源蛋白質(zhì)在畢赤酵母中的共表達(dá)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

克隆宿主菌E.coli DH5α，購自上海Sangon公司；表達(dá)宿主菌 P.pastoris GS115、表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA，購自 Invitrogen公司；重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-Aucel12A、 含 木 聚 糖 酶 基 因（Aoxyn11A）的重組克隆質(zhì)粒pUCm-T-Aoxyn11A，由作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。大腸桿菌生長培養(yǎng)基LB和篩選培養(yǎng)基低鹽LB（+Zeocin）、畢赤酵母生長培養(yǎng)基YPD、轉(zhuǎn)化及篩選培養(yǎng)基MD、YPDS（+ Zeocin）及誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY、BMMY，均由作者依據(jù)Invitrogen公司操作手冊(cè)配制。

1.2 主要試劑

DNA Maker、低蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、各種限制性內(nèi)切酶 （EcoR I、Not I、Sac I）、T4 DNA連接酶、rTaq DNA聚合酶等，購自大連TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠電泳膠回收試劑盒，購自BBI公司；Zeocin，購自Invitrogen公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、櫸木木聚糖（Beechwood xylan），購自Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Aoxyn11A的構(gòu)建

以堿裂解法大量提取pUCm-T-Aoxyn11A和pPICZαA質(zhì)粒，分別用EcoR I和Not I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳后，割膠回收約600 bp的Aoxyn11A基因片段和約3.6 kb的pPICZαA載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過夜，然后轉(zhuǎn)化至 DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用含25 μg/mL Zeocin的低鹽LB平板篩選陽性克隆。篩選的陽性克隆用通用引物 5′-AOX1（GACTGGTTCCAATTGACAAGC） 和 3′-AOX1（GCAAATGGCATTCTGACATCC）進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，并送上海Sangon公司測(cè)序，測(cè)序正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPICZαA-Aoxyn11A。

1.4 畢赤酵母細(xì)胞的電擊轉(zhuǎn)化及篩選

重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Aoxyn11A和表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA經(jīng)Sac I單酶切使之線性化后，分別用電穿孔法轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115和重組畢赤酵母GS115/pPIC9K-Aucel12A（命名為GSC7）中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含200 μg/mL Zeocin的YPDS平板上，30℃條件下培養(yǎng)2～3 d至出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子。電轉(zhuǎn)化及篩選方法參見Invitrogen公司操作手冊(cè)。篩選到的重組畢赤酵母菌株分別命名為GS115/pPICZαA-Aoxyn11A和GS115/pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A。

1.5 目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)

從YPDS（+Zeocin）篩選平板上隨機(jī)挑取若干重組畢赤酵母單菌落，接種于裝有30 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為2～4，室溫下4 000 r/min離心5 min收集菌體，并重懸于30 mL BMMY培養(yǎng)基中，30℃、220 r/min條件下誘導(dǎo)96 h，每隔24 h補(bǔ)加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為2.0%。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃、8 000 r/min離心10 min，收集發(fā)酵上清液進(jìn)行酶活性測(cè)定和SDS-PAGE分析。

1.6 重組畢赤酵母的基因組提取及PCR擴(kuò)增

挑取畢赤酵母重組子單菌落接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃條件下培養(yǎng)至適當(dāng)濃度后，離心收集菌體，參照文獻(xiàn) [11]的方法抽提酵母基因組DNA。以提取的不同重組畢赤酵母（GS115/pPIC9KAucel12A、GS115/pPICZαA-Aoxyn11A 和 GS115/ pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A）基因組DNA作為模板，分別利用引物celF、celR和xynF、xynR擴(kuò)增內(nèi)切葡聚糖酶基因Aucel12A和木聚糖酶基因Aoxyn11A，PCR所用引物見表1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，檢測(cè)目的基因在畢赤酵母染色體上的整合情況。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

取20 μL誘導(dǎo)表達(dá)96 h的發(fā)酵上清液，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的濃縮膠與質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE梯度電泳，電泳后的蛋白膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色液脫色至蛋白質(zhì)條帶清晰可見，分析重組酶的分泌表達(dá)情況，并進(jìn)行表觀分子量的測(cè)定。

1.8 重組表達(dá)酶的活力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9-10]的DNS定糖法并略做改進(jìn)，測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的活力。2.4 mL最適pH的底物溶液中，加入100 μL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液，于最適反應(yīng)溫度條件下孵育15 min，反應(yīng)通過加入2.5 mL的DNS試劑并煮沸7 min進(jìn)行終止和顯色，并用分光光度計(jì)測(cè)定540 nm處的吸光值。內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的測(cè)定底物分別為1 g/dL的CMC-Na溶液 （用0.1 mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制，pH 4.0）和0.5 g/dL的櫸木木聚糖溶液（用0.1 mol/L的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液配制，pH 5.5）。在上述最適反應(yīng)條件下，每分鐘水解底物生成相當(dāng)于1 μmol還原糖所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（IU），其中內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶活計(jì)算分別以D-葡萄糖、D-木糖為標(biāo)準(zhǔn)單糖。

1.9 重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.9.1 酶的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性分別以Na2HPO4-檸檬酸緩沖液 （pH 3.0～7.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 7.5～8.5）、甘氨酸-NaOH緩沖液（pH 9.0～10.0）配制底物溶液，在最適反應(yīng)溫度下測(cè)定不同pH值時(shí)的酶活性，以某一pH值下的最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活，確定酶的最適反應(yīng)pH。將酶液分別用不同pH值 （pH 3.0～10.0）的緩沖液稀釋，40℃保溫1 h，冷卻后在最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘余酶活性，以未經(jīng)pH處理的最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活，分析酶的pH穩(wěn)定性。

1.9.2 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性選取最適pH的底物溶液，分別在不同溫度（30～80℃）測(cè)定酶活性，以某一溫度下的最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活，確定酶的最適反應(yīng)溫度。將酶液置于不同溫度（30～80℃）保溫30 min后，立即冰浴冷卻，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定殘余酶活性，以未經(jīng)熱處理的最高酶活為100%計(jì)算相對(duì)酶活，分析酶的熱穩(wěn)定性。

1.10 雙重重組畢赤酵母的遺傳穩(wěn)定性測(cè)試

選取篩選到的雙重重組畢赤酵母 GS115/ pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A高產(chǎn)菌株，在YPD平板上連續(xù)劃線傳代培養(yǎng)10次后，分別將各代菌株以高密度搖瓶方式在體積分?jǐn)?shù)2.0%甲醇流加量條件下誘導(dǎo)產(chǎn)酶，30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)96 h后，測(cè)定發(fā)酵上清液中內(nèi)切葡聚糖酶與木聚糖酶表達(dá)量，進(jìn)而評(píng)價(jià)共表達(dá)畢赤酵母工程菌株的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母重組表達(dá)載體的鑒定

從低鹽LB（+Zeocin）篩選平板上挑取若干轉(zhuǎn)化子，以通用引物5′-AOX1/3′-AOX1進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳分析顯示，陰性對(duì)照DH5α/pPICZαA的菌液PCR產(chǎn)物可見約600 bp的載體片段，而DH5α/pPICZαA-Aoxyn11A的菌液PCR產(chǎn)物可見約1 200 bp（含載體片段約600 bp，Aoxyn11A基因片段約600 bp）的DNA片段，見圖1。說明目的基因Aoxyn11A已插入到pPICZαA載體的5′-AOX1與3′-AOX1之間。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符，表明酵母重組表達(dá)載體pPICZαA-Aoxyn11A構(gòu)建正確。

圖1 重組大腸桿菌DH5α/pPICZαA-Aoxyn11A的菌液PCR鑒定Fig.1 Identification ofrecombinantE.coliDH5α/ pPICZαA-Aoxyn11A by bacterium liquid PCR

2.2 雙重重組畢赤酵母的表達(dá)與產(chǎn)物分析

隨機(jī)挑取 10個(gè) GS115/pPIC9K-Aucel12A/ pPICZαA-Aoxyn11A菌落 （分別命名為GSCX1—10）和 1個(gè) GS115/pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA陰性對(duì)照菌落（命名為GSCZ），30℃、體積分?jǐn)?shù)2%甲醇流加量條件下誘導(dǎo)96 h后，分別在最適反應(yīng)條件下測(cè)定上清液中的內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶活。由表2可知，GSCZ的表達(dá)產(chǎn)物只具有內(nèi)切葡聚糖酶活性，而GS115/pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A可同時(shí)表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶；其中GSCX8的產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，上清液中的內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶活力分別達(dá)到47.77 IU/mL和192.71 IU/mL。GSCX8成功實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶在畢赤酵母中的共表達(dá)，但兩種酶的表達(dá)水平比單獨(dú)表達(dá)時(shí)有所降低，其中木聚糖酶的表達(dá)量約相當(dāng)于重組酵母表達(dá)菌株GS115/pPICZαA-Aoxyn11A（命名為GSX5，酶活力為233.38 IU/mL）的80%，而內(nèi)切葡聚糖酶的表達(dá)量約相當(dāng)于陰性對(duì)照GSCZ和前期研究中構(gòu)建的GS115/pPIC9K-Aucel12A表達(dá)量最高的菌株的85%，這可能與畢赤酵母有限的分泌表達(dá)外源蛋白質(zhì)的能力有關(guān)[13]。選取表達(dá)量最高的GSC7、GSX5和GSCX8菌株用于后續(xù)研究。

2.3 重組畢赤酵母的PCR檢測(cè)

為檢測(cè)目的基因是否已整合到畢赤酵母染色體上，以重組畢赤酵母GSC7、GSX5及GSCX8的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

表2 GS115/pPIC9K-Aucel12A/pPICZαA-Aoxyn11A的表達(dá)分析Table 2 Expression analysis GS115/pPIC9K-Aucel12A/ pPICZαA-Aoxyn11A

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示以GSC7基因組為模板，利用引物celF/celR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可擴(kuò)增出一條約700 bp的條帶（圖2，泳道1），大小與Aucel12A基因片段一致，而利用引物xynF/xynR進(jìn)行擴(kuò)增未出現(xiàn)任何條帶 （圖2，泳道2）；以GSX5基因組為模板，利用引物celF/celR進(jìn)行擴(kuò)增未出現(xiàn)任何條帶（圖2，泳道3），而利用引物xynF/xynR可擴(kuò)增出一條約600 bp的條帶（圖2，泳道4），大小與Aoxyn11A基因片段一致；以GSCX8基因組為模板，利用celF/celR和xynF/xynR兩對(duì)引物可分別擴(kuò)增出約700 bp（圖2，泳道5）和600 bp（圖2，泳道6）的條帶，表明木聚糖酶基因Aoxyn11A已整合到畢赤酵母基因組中，而原有的內(nèi)切葡聚糖酶基因Aucel12A沒有丟失。

2.4 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

取重組畢赤酵母GSK（GS115/pPIC9K）、GSC7、GSZ（GS115/pPICZαA）、GSX5、GSCZ、GSCX8的發(fā)酵上清液，用SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，GSC7的表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量約27.0 kDa處出現(xiàn)了一條特異性條帶，大于內(nèi)切葡聚糖酶的理論分子質(zhì)量24.3 kDa，內(nèi)切葡聚糖酶含有一個(gè)潛在的N糖基化位點(diǎn)（N–W–T），在畢赤酵母中表達(dá)時(shí)可能會(huì)發(fā)生翻譯后的糖基化修飾，因此推斷該蛋白質(zhì)條帶為重組表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶；GSX5的表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量約24.6 kDa處出現(xiàn)了一條特異性的蛋白質(zhì)條帶，與前期測(cè)得的木聚糖酶的表觀分子量相符[12]；GSCX8的表達(dá)產(chǎn)物在相對(duì)分子質(zhì)量約27.0、24.6 kDa處均可見目的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，而陰性對(duì)照GSCZ僅可見相對(duì)分子質(zhì)量約27.0 kDa的特異性條帶，見圖3，這與酶活測(cè)定的結(jié)果一致。

圖2 重組畢赤酵母的PCR檢測(cè)Fig.2 Verification of recombinant Pichia pastoris by PCR

圖3 重組畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed products by recombinant Pichia pastoris

2.5 酶學(xué)性質(zhì)分析

用雙重重組畢赤酵母GSCX8分泌表達(dá)的混合酶，分別對(duì)重組內(nèi)切葡聚糖酶和重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。

2.5.1 最適pH及其穩(wěn)定性內(nèi)切葡聚糖酶的適宜作用pH為pH 3.5～4.5，其相對(duì)酶活在80%以上，其中最適作用pH為4.0；木聚糖酶酶在pH 4.5～6.5的適宜作用pH條件下酶活較高（＞80%），其中最適作用pH為5.5，見圖4。

圖4 內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的最適作用pHFig.4 Optimal pH profile of endoglucanase and xylanase

內(nèi)切葡聚糖酶在pH 3.0～8.5范圍內(nèi)穩(wěn)定，殘余酶活保持在80%以上，而木聚糖酶在pH 3.0～10.0內(nèi)酶活均能保持穩(wěn)定（＞80%），見圖5。

圖5 內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of endoglucanase and xylanase

2.5.2 最適反應(yīng)溫度及其穩(wěn)定性內(nèi)切葡聚糖酶在40～60℃之間酶活較高（＞80%），其中最適作用溫度為50℃；木聚糖酶在45～60℃之間活性較高（＞80%），其中最適作用溫度為55℃，見圖6。

圖6 內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的最適作用溫度Fig.6 Optimal temperature of endoglucanase and xylanase

內(nèi)切葡聚糖酶在60℃以下酶活較穩(wěn)定（＞80%），65℃保溫30 min后，酶活下降到39.3%；木聚糖酶在50℃以下酶活較穩(wěn)定（＞80%），55℃保溫30 min后，酶活下降到20.7%，見圖7。

圖7 內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermostability of endoglucanase and xylanase

2.6 雙重重組畢赤酵母的遺傳穩(wěn)定性

雙重重組畢赤酵母GSCX8經(jīng)傳代培養(yǎng)10次后，分別將各代菌株以搖瓶發(fā)酵方式誘導(dǎo)產(chǎn)酶96 h，檢測(cè)發(fā)酵上清液的酶活性。其中內(nèi)切葡聚糖酶酶活在 43.85～49.14 IU/mL，木聚糖酶酶活 178.94～201.82 IU/mL，表明GSCX8在連續(xù)傳代培養(yǎng)10次后，內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的表達(dá)量在各代中基本保持穩(wěn)定，顯示具有良好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結(jié)語

巴斯德畢赤酵母作為近年來發(fā)展迅速的真核表達(dá)系統(tǒng)，具有表達(dá)水平高、可分泌表達(dá)及遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，將功能相關(guān)的酶基因在畢赤酵母中共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)多種酶分泌表達(dá)，且重組表達(dá)的蛋白質(zhì)純度較高[12]。在本研究中，通過雙質(zhì)粒體系構(gòu)建了整合有Aucel12A基因和Aoxyn11A基因的雙重重組畢赤酵母GSCX8，其發(fā)酵上清液中內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶的酶活性分別為47.77、192.71 IU/mL，為單獨(dú)表達(dá)菌株GSC7和GSX5酶活性的85%和80%。GSCX8經(jīng)傳代培養(yǎng)10次后，仍具有良好的遺傳穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶與木聚糖酶在畢赤酵母中的穩(wěn)定共表達(dá)。

GSCX8分泌表達(dá)的重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析顯示：內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶具有相近的最適催化條件，從而可以在同一反應(yīng)體系以復(fù)合酶的形式聯(lián)合催化，從而發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。本研究通過雙質(zhì)粒表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶和木聚糖酶在畢赤酵母中的共表達(dá)，并對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，為新型復(fù)合酶的制備提供了有益借鑒，為進(jìn)一步研究協(xié)同作用奠定了基礎(chǔ)。

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Co-Expression of Endoglucanase and Xylanase in Pichia pastoris

LIU Gaolei1， HU Die2， WU Minchen*3， YIN Xin2， WANG Junqing2
（1.School of Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.Wuxi Medical School，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Both endoglucanase and xylanase are additives in feed for mono-gastric animal.Coexpression of endoglucanase and xylanase in P.pastoris is a useful way to reduce the production cost in feedstuff industry.An endoglucanase-encoding gene（Aucel12A）from Aspergillus usamii was expressed in P.pastoris，and the engineering strain with the highest endoglucanase activity was labeled GSC7.Then，a recombinant vector，pPICZαA-Aoxyn11A，was constructed and linearized by Sac I，followed by transforming it into GSC7.Ultimately，the endoglucanase and xylanase genes were successfully co-expressed in P.pastoris.One strain harbored genes Aoxyn11A and Aucel12A，with the highest xylanase and endoglucanase activities，was labeled GSCX8.The enzymatic properties of the recombinant AuCel12A and AoXyn11A，expressed in GSCX8，were characterized.Meanwhile，to analyze the genetic stability of GSCX8，the xylanase and endoglucanase activities of different strainsafter passing 10 generations were also measured.After strain GSCX8 was induced for 96 h，the activities of recombinant AuCel12A and AoXyn11A in the cultured supernatant were 47.77 IU/mL and 192.71 IU/mL，respectively，which were about 85%and 80%of that of enzymes expressed by the single gene engineering strains GSCZ and GSX5.The recombinant AuCel12A displayed the optimal activity at pH 4.0 and 50℃，and was stable over a pH range of 3.0～8.5 and at 60℃or below.Besides，the recombinant AoXyn11A displayed the optimal activity at pH 5.5 and 55℃，and was stable over a pH range of 3.0～10.0 and at 50℃or below.Additionally，the activities of the two enzymes were well maintained after the GSCX8 passing 10 generations.

endoglucanase，xylanase，Pichia pastoris，co-expression

Q 814

A

1673—1689（2015）03—0253—07

2014-04-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101229；31271811）。

*通信作者：鄔敏辰（1962—），男，江蘇無錫人，理學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事酶工程與基因工程研究。

E-mail：biowmc@126.com