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      血管緊張素Ⅱ和坎地沙坦對小鼠骨骼肌細胞C2C12胰島素敏感性的影響

      2015-01-06 11:10:43英明中
      中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2015年7期
      關(guān)鍵詞:坎地沙坦骨骼肌

      李 凡 謝 靜 英明中 曾 強

      解放軍總醫(yī)院國際醫(yī)學(xué)中心,北京100853

      血管緊張素Ⅱ和坎地沙坦對小鼠骨骼肌細胞C2C12胰島素敏感性的影響

      李 凡 謝 靜 英明中 曾 強▲

      解放軍總醫(yī)院國際醫(yī)學(xué)中心,北京100853

      目的研究血管緊張素Ⅱ和坎地沙坦對小鼠骨骼肌細胞(C2C12)胰島素敏感性的影響及其機制。方法C2C12誘導(dǎo)分化成熟后,分為對照組(C組)、模型組(M組,AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦低劑量組(Can1組,坎地沙坦0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦中劑量組(Can2組,坎地沙坦1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)、坎地沙坦高劑量組(Can3組,坎地沙坦10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)。各組細胞給予相應(yīng)藥物及胰島素處理后,使用二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成水平,使用2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)檢測細胞對胰島素的敏感性,并用RT-PCR法和Western印跡法分別檢測各組細胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子-2(Nrf2)的mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果與C組比較,M組ROS生成水平顯著升高(P<0.01),攝取2-NBDG量顯著降低(P<0.01);與M組比較,Can3組ROS生成水平顯著減少(P<0.05),攝取2-NBDG量則顯著增加(P<0.05)。M組Nrf2的mRNA及蛋白表達較C組顯著降低(P<0.01),Can2組及Can3組Nrf2的mRNA及蛋白表達較M組顯著升高(P<0.01或P<0.05)。結(jié)論AngⅡ通過下調(diào)C2C12中Nrf2的mRNA及蛋白表達,抑制Nrf2的抗氧化效應(yīng),增加ROS生成,引起骨骼肌細胞胰島素抵抗;而坎地沙坦通過抑制AngⅡ的這種作用改善骨骼肌胰島素抵抗。

      坎地沙坦;血管緊張素Ⅱ;胰島素抵抗;核轉(zhuǎn)錄因子-2;活性氧

      胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是指機體對胰島素的敏感性下降,導(dǎo)致細胞攝取和利用葡萄糖的效率降低,為了維持血糖穩(wěn)定,機體代償性分泌過多胰島素造成高胰島素血癥的狀態(tài)。IR是高血壓與2型糖尿病的共同病理生理基礎(chǔ),是兩者之間關(guān)聯(lián)性的重要指標[1]。目前,已有多項臨床試驗結(jié)果證實,血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(angiotensinⅡ receptor blocker, ARB)類降壓藥可改善高血壓患者的IR,從而降低該人群的2型糖尿病發(fā)病率[2-3]。本研究組之前的研究結(jié)果也顯示,ARB類藥物中的坎地沙坦可以改善高血壓動物模型的胰島素抵抗[4]。ARB的這種作用部分來源于對于細胞內(nèi)活性氧(ROS)的抑制[5,11],但是其具體分子機制尚不清楚。由于骨骼肌是機體進行葡萄糖代謝的主要器官,因此本研究以小鼠成肌細胞(C2C12)為研究對象,通過檢測血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)和坎地沙坦對細胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)元件的關(guān)鍵調(diào)控因子——Nrf2的影響,進一步探討坎地沙坦改善骨骼肌細胞胰島素抵抗的分子機制。現(xiàn)報道如下:

      1 材料與方法

      1.1 實驗材料

      小鼠C2C12由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細胞資源中心提供??驳厣程?、AngⅡ和2-脫氧葡萄糖(2-NBDG)購自Sigma公司,活性氧檢測試劑盒購自南京碧云天公司,M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司,Real-time PCR擴增試劑盒購自北京中原公司,Nrf2多克隆抗體購自Santa Cruz公司,HPR標記的羊抗兔及羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

      1.2 方法

      1.2.1 C2C12的培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及分組細胞加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),隔日換液,待細胞生長至70%~80%融合時按1∶4傳代。C2C12細胞達80%左右融合時,移除DMEM 10%胎牛血清生長培養(yǎng)基,換用含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化,每24小時換液1次,7 d后分化成為成熟骨骼肌細胞。細胞鑒定后進行如下分組:對照組(C組,DMEM);模型組(M組,AngⅡ0.1μmol/L+DMEM);坎地沙坦低劑量組(Can1組),坎地沙坦0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L+DMEM);坎地沙坦中劑量組(Can2組,坎地沙坦1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L+DMEM);坎地沙坦高劑量組(Can3組,坎地沙坦10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L+DMEM)。

      1.2.2 2-NBDG法檢測葡萄糖吸收率C2C12培養(yǎng)第8天,細胞換液為無血清DMEM培養(yǎng)基100μL。按實驗分組依次加入坎地沙坦、AngⅡ和胰島素(10 nmol/L),并使坎地沙坦終濃度符合分組要求。每一種藥物干預(yù)間隔時間為30min,并置于孵箱中。每組6個重復(fù),無細胞為背景組。每孔細胞加入終濃度為150μg/mL 2-NBDG,孵育1h。室溫下,400 r/min離心培養(yǎng)板5min。小心吸去上清后每孔加入200μL的Cell based assay buffer細胞緩沖液。室溫下,400 r/min離心培養(yǎng)板5min,再每孔加入100μL的Cell based assay buffer細胞緩沖液。立即使用熒光分光光度計讀板分析,讀出細胞攝取的2-NBDG熒光值。激發(fā)光波長485 nm,發(fā)射光波長535 nm。以C組的熒光值為基準,各組與C組的比值為2-NBDG的攝取量,代表了細胞對胰島素的敏感性。

      1.2.3 二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)法檢測ROS水平對數(shù)生長期的C2C12細胞接種于6孔板,DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。去除細胞培養(yǎng)液后,每孔加入1mL稀釋好的DCFH-DA,37℃孵育30 min后,加入AngⅡ并使其終濃度為0.1μmol/L。30 min后按實驗分組加入不同濃度坎地沙坦,并使坎地沙坦終濃度符合分組要求,37℃孵育24 h后胰酶消化細胞并收集,1200 r/min離心3min,棄掉上清液。細胞溶于300μL的無血清DMEM培養(yǎng)基,吹打成細胞懸液。每100μL加入到1個96孔板中,使用488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長進行讀板,檢測熒光值,以C組的熒光值為基準,各組與C組的比值為ROS產(chǎn)生量。

      1.2.4 Rea l-t ime PCR實驗誘導(dǎo)成熟的C2C12換無血清DMEM,坎地沙坦、AngⅡ和胰島素按分組加入,每一種藥物干預(yù)間隔30 min,24 h后去除培養(yǎng)液,提取各組細胞總RNA,RT-PCR法反轉(zhuǎn)錄為cDNA。Nrf2引物由生工生物工程有限公司合成。引物設(shè)計如下:上游5'-CAGCAGGACATGGATTTGAT-3',下游5'-GCCTTCTCCTGTTCCTTCTG-3'。于PCR反應(yīng)管內(nèi)加入,反應(yīng)總體積為20μL,其中上游及下游引物各0.5μL,cDNA1.5μL,SYBR Premix TaqTMⅡ10μL。于PCR儀(BIO-RAD,Inc)上進行擴增。反應(yīng)參數(shù):94℃2 min預(yù)變性;94℃15 s,60℃1 min,50個循環(huán)。獲取各組樣本的標準曲線,計算機分析Ct值,以C組為基準,與C組的比值為各組樣本Nrf2 mRNA的表達量。

      1.2.5 Wes tern b l ot實驗各組細胞的干預(yù)處理步驟同Real-time PCR實驗。24 h后倒掉細胞培養(yǎng)液,從待測樣本中提取蛋白質(zhì),使用Bradford法測定蛋白含量。各組取相同質(zhì)量的蛋白,變性后在聚丙烯酰胺凝膠上樣進行電泳,電泳完畢后,將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,5%脫脂奶粉封閉,先后加入Nrf2及內(nèi)參GAPDH的一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗孵育,化學(xué)發(fā)光法(ECL法)顯色,X線片記錄結(jié)果,掃描蛋白條帶的密度并使用IPP軟件分析目的條帶灰度,以內(nèi)參GAPDH灰度為基準,與GAPDH的比值即為各組樣本Nrf2蛋白的表達量。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

      采用統(tǒng)計軟件SPSS 12.0對數(shù)據(jù)進行分析,正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差()表示多組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 AngⅡ和坎地沙坦對C2C12細胞攝取2-NBDG的影響

      與C組比較,M組C2C12攝取2-NBDG水平顯著下降(P<0.01),提示AngⅡ能降低C2C12細胞對胰島素的敏感性;而給予坎地沙坦干預(yù)后,C2C12攝取2-NBDG水平升高,其中Can3組的2-NBDG攝取量較M組增加(P<0.05),提示高劑量坎地沙坦能改善AngⅡ?qū)2C12細胞攝取2-NBDG的抑制作用。見圖1。

      圖1 AngⅡ和坎地沙坦對C2C12攝取2-NBDG的影響

      2.2 AngⅡ和坎地沙坦對C2C12產(chǎn)生ROS的影響

      與C組相比,M組C2C12內(nèi)ROS含量顯著升高(P<0.01)。而給予坎地沙坦干預(yù)后,ROS生成有下降趨勢,其中Can3組的ROS含量顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),提示高劑量坎地沙坦能抑制AngⅡ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。見圖2。

      圖2 AngⅡ和坎地沙坦對C2C12產(chǎn)生ROS的影響

      2.3 AngⅡ和坎地沙坦對N rf2mRNA表達的影響

      Real-time PCR結(jié)果顯示,與C組比較,M組的Nrf2 mRNA的表達顯著降低(P<0.01);與M組比較,坎地沙坦各組的Nrf2 mRNA表達均呈上升趨勢。其中,Can2組及Can3組與M組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

      圖3 AngⅡ和坎地沙坦對Nrf2m RNA表達的影響

      2.4 AngⅡ和坎地沙坦對N rf2蛋白表達的影響

      Western-blot實驗結(jié)果顯示,與C組比較,M組的Nrf2蛋白表達量顯著降低(P<0.01);與M組比較,3個坎地沙坦組的Nrf2蛋白表達量有升高趨勢。其中,Can2組及Can3組與M組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖4~5。

      圖4 AngⅡ和坎地沙坦對Nrf2蛋白表達的影響

      圖5 AngⅡ和坎地沙坦對Nrf2蛋白表達的影響

      3 討論

      近年來,隨著對ROS族研究的深入,證實了大量ROS的產(chǎn)生是導(dǎo)致細胞氧化應(yīng)激損傷的重要機制之一,而氧化應(yīng)激損害在形成胰島素抵抗的病理生理過程中起重要作用[6,7]。有研究表明,正常個體發(fā)生氧化應(yīng)激時,細胞會通過活化抗氧化系統(tǒng)分子信號通道來增加抗氧化酶類的生成,以應(yīng)對ROS生成的增加。而對于高血壓的個體,細胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的分子信號反應(yīng)能力下降,則只會加重ROS介導(dǎo)的胰島素信號通路損害,加重IR[12]。本研究中,通過給予C2C12一定濃度的AngⅡ,觀察到M組C2C12內(nèi)ROS表達顯著增加,而該組細胞的2-NBDG攝取顯著下降,出現(xiàn)了IR。因此,本研究組認為高血壓個體中腎素-血管緊張素系統(tǒng)過度激活提高了AngⅡ的水平,這在一定程度上影響了骨骼肌細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激平衡,這與Xin等[8]研究結(jié)果一致,其原因可能與AngⅡ增加細胞內(nèi)NAD(P)H氧化酶表達有關(guān)。

      目前研究認為,Nrf2是細胞抗內(nèi)源性氧化應(yīng)激的重要中樞調(diào)節(jié)者,在細胞介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激防御反應(yīng)中具有重要的作用[13]。因此,高血壓狀態(tài)下細胞抗氧化能力下降,以及由此產(chǎn)生的胰島素信號通路損害,很可能與Nrf2的功能異常有關(guān)。結(jié)合研究組之前的研究,本研究組認為高血壓狀態(tài)下AngⅡ的過度表達會造成ROS在骨骼肌的過度表達[9]。但是,ARB類藥物改善糖代謝、降低骨骼肌胰島素抵抗的效應(yīng)是否與Nrf2在骨骼肌內(nèi)表達的改變有關(guān)尚未見研究報道。

      在正常情況下,內(nèi)源性抗氧化物酶[如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等]是防止氧化應(yīng)激產(chǎn)生細胞損傷的第一道防線,這些內(nèi)源性抗氧化物酶通過清除過量ROS來平衡機體內(nèi)的氧化過程[10],而產(chǎn)生這一生物抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的防御機制主要是通過抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)。ARE是許多抗氧化基因上游中的順式作用增強元件,而Nrf2正是通過介導(dǎo)ARE參與調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白而發(fā)揮作用[14]。在正常情況下,Nrf2與Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Keap1)偶聯(lián),并與肌動蛋白細胞骨架結(jié)合錨定于質(zhì);當受到ROS或其他親核劑信號攻擊后,Nrf2與Keapl解偶聯(lián)后被激活轉(zhuǎn)位進人細胞核中,與Maf蛋白結(jié)合成異二聚體,異二聚體與基因中的ARE結(jié)合后激活了Nrf2/ARE信號通路以及其下游的抗氧化蛋白,有效清除體內(nèi)產(chǎn)生的自由基,發(fā)揮細胞保護作用[15]。因此,當細胞內(nèi)Nrf2表達下調(diào)時,無法正常介導(dǎo)ARE的抗過氧化調(diào)控作用,使得細胞內(nèi)ROS表達增加。

      本研究表明,在AngⅡ存在的狀況下,M組C2C12細胞內(nèi)的Nrf2的表達受到抑制,ROS生成增加,胰島素敏感性減低。給予坎地沙坦處理可以有效對抗這種抑制作用,顯著增加Nrt2的表達,同時ROS的水平下降,IR得到改善。以上結(jié)果提示坎地沙坦通過對AngⅡ的抑制上調(diào)了Nrf2的表達,繼而通過Nrf2/ARE途徑發(fā)揮對抗氧化應(yīng)激的作用,使細胞內(nèi)ROS有所降低,減輕了ROS對胰島素分子信號傳導(dǎo)通路的影響,恢復(fù)和改善由于ROS過度增加而損害的PI3K、Akt等胰島素信號傳導(dǎo)分子的磷酸化功能,從而使胰島素能發(fā)揮正常的促進細胞攝取葡萄糖的功能。

      綜合上所述,坎地沙坦對骨骼肌細胞胰島素敏感性的保護機制部分來源于減少AngⅡ?qū)rf2表達的抑制作用。但是Nrf/ARE的抗氧化機制比較復(fù)雜,還有待于進一步研究以得到更多的證據(jù)支持。

      [1]Lastra G,Dhuper S,Johnson MS,et al.Salt,aldosterone,and insulin resistance:impact on the cardiovascular system[J]. Nat Rev Cardiol,2010,7(10):577-584.

      [2]Ogihara T,Nakao K,F(xiàn)ukui T,et al.Candesartan antihypertensive survival evaluation in Japan trial group.Effects of candesartan compared with amlodipine in hypertensive patients with high cardiovascular risks:candesartan antihypertensive survival evaluation in Japan trial[J].Hypertension,2008,51(2):393-398.

      [3]Julius S,WeberMA,Kjeldsen SE,etal.The valsartan antihypertensive long-term use evaluation(VALUE)trial: outcomes in patients receivingmonotherapy[J].Hypertension,2006,48(3):385-391.

      [4]李凡,葉蘭,孟劍湃,等.坎地沙坦對自發(fā)性高血壓大鼠胰島素敏感性及炎性因子的影響[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,37(3):263-266.

      [5]Zhou MS,Schulman IH,Raij L.Role ofangiotensinⅡand oxidative stress in vascular insulin resistance linked to hypertension[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol,2009,296 (3):H833-H839.

      [6]Wei Y,Chen K,Whaley-Connell AT,et al.Skeletalmuscle insulin resistance:role of inflammatory cytokines and reactive oxygen species[J].Am JPhysiol,2008,294(3):R673-R680.

      [7]Zhang J,Wu W,Li D,et al.Overactivation of NF-κB impairs insulin sensitivity and mediates palmitate-induced insulin resistance in C2C12 skeletalmuscle cells[J].Endocrine,2010,37(1):157-166.

      [8]Xin Y,Niu T,Wang W,et al.Triterpenoid dihydro-CDDO-trifluoroethyl amide protects againstmaladaptive cardiac remodeling and dysfunction in mice:a critical role of Nrf2[J].PLoSOne,2012,7(9):e44899.

      [9]Nguyen T,Nioi P,Picket CB.The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress[J].J Biol Chem,2009,284(20):13291-13295.

      [10]HeH,Xu J,Xu Y,eta1.Cardioprotective effects of saponins from Panax japonicus on acute myocardial ischemia against oxidative stresstriggered damage and cardiac cell death in rats[J].J Ethnopharmacol,2012,140(1):73-82.

      [11]Ogawa S,Matsushima M,Mori T,et al.Identification of the stages of diabetic nephropathy at which angiotensin Ⅱ receptor blockers most effectively suppress albuminuria[J]. Am J Hypertens,2013,26(9):1064-1069.

      [12]Matsuda M,Shimomura I.Increased oxidative stress in obesity:implications for metabolic syndrome,diabetes,hypertension,dyslipidemia,atherosclerosis,and cancer[J]. Obes Res Clin Pract,2013,7(5):e330-e341.

      [13]Olagnier D,Peri S,Steel C,etal.Cellular oxidative stress response controls the antiviral and apoptotic programs in dengue virus-infected dendritic cells[J].PloS Pathog,2014,10(12):e1004566.

      [14]Wu Q,Zhang XS,Wang HD,et al.Astaxanthin activates nuclear factor erythroid-related factor 2 and the antioxidant responsive element(Nrf2-ARE)pathway in the brain after subarachonid hemorrhage in rats and attenuates early brain injury[J].MarDrugs,2014,12(12):6125-6141.

      [15]Saso L,F(xiàn)iruzi O.Pharmacological applications of antioxidants:lights and shadows[J].Curr Drug Targets,2014,15(13):1177-1199.

      Effects of Angiotensin Ⅱ and Candesartan on insulin sensitivity of mouse C2C12 myotubes

      LI Fan XIE Jing YING Mingzhong ZENG Qiang▲
      International Medical Center,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China

      Objective To investigate the effects of Candesartan and Angiotensin Ⅱ (AngⅡ)on insulin sensitivity of mouse C2C12 myotubes,and discuss the possible mechanism.MethodsMature C2C12 myotubes were divided into 4 groups:control group(group C),model group(group M,AngⅡ0.1μmol/L),low dose Candesartan group(Can1 group, Candesartan 0.1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L),mild dose Candesartan group(Can2 group,Candesartan 1μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L)and high dose Candesartan group(Can3 group,Candesartan 10μmol/L+AngⅡ0.1μmol/L).After the intervention of angiotensinⅡand insulin,the uptake of 2-deoxyglucose(2-NBDG)by C2C12 myotubes was measured in each group as well as the level of reactive oxygen species(ROS).The mRNA and protein expression of Nrf2 were measured by RT-PCR and Western blotting assay.ResultsCompared with the group C,the uptake of 2-NBDG in the group M was significantly decreased(P<0.01),the mRNA and protein expression of Nrf2 in group M was significantly decreased(P<0.01),at the same time,the level of ROS was increased significantly(P<0.01).Compared with group M,the uptake of 2-NBGD was increased obviously in Can3 group(P<0.05).The mRNA and protein expression of Nrf2 in group M were decreased than those in group C(P<0.01),the mRNA and protein expression of Nrf2 in the Can2 group and Can3 group were significantly increased than those in group M(P<0.01 or P<0.05).ConclusionAngiotensin Ⅱ can cause the insulin resistance of the skeletal muscle cells by reducing the mRNA and protein expression of Nrf2,controling Nrf2 oxidation effect,increasing ROS produce;Candesartan can improve skeletal muscle cells insulin resistance by reverse the effect of Ang Ⅱ on Nrf2 and improve the overload of ROS in the cells.

      Candesartan;AngiotensionⅡ,Insulin resistance;Nrf2;Reactive oxygen species

      R544.1

      A

      1673-7210(2015)03(a)-0014-05

      2014-11-10本文編輯:蘇暢)

      北京市自然科學(xué)基金項目(編號7122171)。

      ▲通訊作者

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