多西他賽、培美曲塞聯(lián)合鹽酸?？颂婺岵煌蜇炗盟帟r(shí)序及選擇合理用藥時(shí)機(jī)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外抑制作用

郭 磊，汪進(jìn)良，錢海利，王海娟，胡 毅（．解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，北京 00853；．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 000）

多西他賽、培美曲塞聯(lián)合鹽酸埃克替尼不同序貫用藥時(shí)序及選擇合理用藥時(shí)機(jī)對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外抑制作用

郭 磊1，汪進(jìn)良1，錢海利2，王海娟2，胡 毅1（1．解放軍總醫(yī)院腫瘤內(nèi)一科，北京 100853；2．中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的：探討鹽酸?？颂婺崧?lián)合化療藥（多西他賽、培美曲塞）以不同次序序貫及選擇合理用藥時(shí)機(jī)用藥對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系GLC-82的作用。方法：運(yùn)用xCELLigence系統(tǒng)檢測(cè)多西他賽、培美曲塞、鹽酸?？颂婺釂嗡幾饔肎LC-82的IC50，及單藥在GLC-82細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間依賴性IC50，并檢測(cè)鹽酸?？颂婺岵煌涡蚵?lián)合多西他賽、培美曲塞對(duì)GLC-82的增殖毒性，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)?？颂婺崤c二者聯(lián)合的不同次序?qū)LC-82細(xì)胞的細(xì)胞周期影響。結(jié)果：多西他賽、培美曲塞在作用36 h后在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到平衡期，而?？颂婺嵩谧饔?0 h后在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到平衡期。多西他賽作用于GLC-82細(xì)胞系36 h的IC50為25 mg·mL-1，培美曲塞作用于GLC-82細(xì)胞系36 h的IC50為560 μmol·L-1，?？颂婺嶙饔糜贕LC-82細(xì)胞系60 h的IC50為10 μmo·L-1。先用多西他賽或培美曲塞后用埃克替尼方案與其他用藥方案相比，細(xì)胞倍增時(shí)間顯著增加：D-I組倍增時(shí)間為（– 829.1±46.9） h；P-I組倍增時(shí)間為（– 342.0±3.4） h，與其他序貫聯(lián)合方式相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）；并可使細(xì)胞阻滯在G2/M期（培美曲塞阻滯在S期），細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果更好（P ＜ 0.05）。結(jié)論：先于埃克替尼使用多西他賽或培美曲塞，并且選擇合理的用藥時(shí)機(jī)為體外抑制NSCLC細(xì)胞增殖的最佳聯(lián)用方案。

埃克替尼；多西他賽；培美曲塞；肺癌；序貫用藥

肺癌是全世界最常見的惡性腫瘤，其惡性程度高，死亡率高，生存期短，是目前發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一[1-3]?；熀歪槍?duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的靶向治療是針對(duì)晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lungcancer，NSCLC）的兩大主要治療手段。然而化療藥物的非選擇性和劑量依賴性的特點(diǎn)，導(dǎo)致其毒副反應(yīng)大，且療效受限，因此研發(fā)高效低毒的新型藥物及有效配方是目前治療晚期肺癌的關(guān)鍵所在[4]。近幾年以EGFR為靶點(diǎn)的分子靶向治療在NSCLC的治療中日漸突出，鹽酸?？颂婺幔╥cotinib hydrochloride，凱美納）是由浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司自主研發(fā)的以EGFR酪氨酸激酶為靶點(diǎn)的小分子靶向抗癌新藥，是一種高效特異性的表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）[5-7]。本研究通過(guò)觀察鹽酸?？颂婺崤c化療藥物（多西他賽、培美曲塞）的單藥、聯(lián)合序貫不同給藥方式對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株GLC-82的增殖抑制作用，探討分子靶向藥物聯(lián)合化療治療晚期肺癌的合理用藥時(shí)機(jī)，為臨床NSCLC的綜合治療提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞系

人肺腺癌細(xì)胞系GLC-82由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院分子腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室凍存提供。

1.2 藥物

鹽酸?？颂婺幔╥ c o t i n i b，凱美納，批號(hào)H20110061）由浙江貝達(dá)藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)；多西他賽（docetaxel，DTX，泰索帝，批號(hào)H20090493）由賽諾菲公司惠贈(zèng)；培美曲塞（pemetrexed，PEM，力比泰，批號(hào)H20100060）由美國(guó)禮來(lái)公司惠贈(zèng)。

1.3 試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；磷酸鹽緩沖液PBS（美國(guó)Hyclone公司）；SCR005 Accutaes酶（Millipore公司）；DAPI染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Triton-X100（上海化學(xué)試劑公司）；miRNaseA（天根生化科技北京有限公司）。

1.4 儀器與設(shè)備

MC0-15AC二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（SANYO公司）；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；E-Plate L8細(xì)胞增殖培養(yǎng)板（瑞士Roche公司）；普通顯微鏡（日本Olympus公司）；Class Ⅱ Type A/B3超凈工作臺(tái)（Baker公司）。

實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（Real-time cell analyzer，RTCA，xCELLigence檢測(cè)系統(tǒng)，瑞士Roche公司）：系統(tǒng)主要由分析檢測(cè)器、裝置工作站和放置細(xì)胞培養(yǎng)板的微電極平臺(tái)三部分組成，其主要通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的阻抗值并計(jì)算細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）來(lái)衡量細(xì)胞數(shù)的多少。CI計(jì)算公式：

（Zi是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每次檢測(cè)細(xì)胞時(shí)的電阻，Z0是開始檢測(cè)的基準(zhǔn)電阻）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺腺癌細(xì)胞GLC-82常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37 ℃飽和濕度的孵育箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，胰酶消化傳代，2 ～ 3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 檢測(cè)細(xì)胞EGFR基因突變情況

抽提基因組DNA；PCR法擴(kuò)增目的基因；瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果，樣品送諾賽基因公司進(jìn)行測(cè)序。

2.3 藥物準(zhǔn)備

將?？颂婺崛苡?00% DMSO中，配制成5×104μmol·L-1的母液；多西他賽原液溶于溶劑中，配制成4 mg·mL-1的母液；稱取一定質(zhì)量的培美曲塞，溶于0.9%氯化鈉溶液中，配制成8×104μmol·L-1的母液，使用時(shí)均用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。

2.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

采用含有微陣列檢測(cè)電極的細(xì)胞增殖培養(yǎng)板E-Plate L8（8孔板）培養(yǎng)細(xì)胞。在8孔板的孔中加入150 μL含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，將8孔板放到RTCA上，RTCA系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)進(jìn)行掃描，檢查其接觸良好后開始檢測(cè)基線。取出8孔板，在孔中加入300 μL混合均勻的GLC-82細(xì)胞懸液；超凈臺(tái)中室溫放置30 min后將8孔板放到培養(yǎng)箱中的RTCA上，進(jìn)行細(xì)胞增殖的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)96 h。每15 min檢測(cè)一次CI，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)情況，根據(jù)CI值繪制曲線。

2.5 分組

根據(jù)藥物在細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間依賴性IC50共分11組：?jiǎn)嗡幇？颂婺?6 h（I組），單藥培美曲塞96 h（P組），單藥多西他賽96 h（D組），埃克替尼、培美曲塞同時(shí)給藥96 h（I+P組），埃克替尼、多西他賽同時(shí)給藥96 h（I+D組），先用埃克替尼60 h后用培美曲塞36 h（I-P組），先用培美曲塞36 h后用?？颂婺?0 h（P-I組），先用埃克替尼60 h后用多西他賽36 h（I-D組），先用多西他賽36 h后用?？颂婺?0 h（D-I組），陰性對(duì)照96 h及空白對(duì)照96 h。

2.6 單藥細(xì)胞毒性檢測(cè)

在8孔板的孔中加入150 μL細(xì)胞懸液，進(jìn)行基線測(cè)量后，每隔15 min檢測(cè)一次CI，根據(jù)CI值選擇最佳加藥時(shí)間。在8孔板中加入不同濃度藥物之后，每隔15 min檢測(cè)一次，根據(jù)CI值繪制曲線。

2.7 聯(lián)合用藥細(xì)胞毒性檢測(cè)

在8孔板的孔中加入150 μL細(xì)胞懸液，進(jìn)行基線測(cè)量后，每隔15 min檢測(cè)一次CI，記錄細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程。按分組要求在同時(shí)或序貫加入兩種固定濃度藥物之后，每隔15 min檢測(cè)一次，觀察藥物作用，根據(jù)CI值繪制曲線。

2.8 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

按不同給藥方式處理后的細(xì)胞培養(yǎng)皿置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組安排，一定時(shí)間后用胰酶消化收集細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次（離心800 r·min-1，3 ～ 5 min），收集皿中細(xì)胞。加入1 mL 70% ～ 75%酒精固定細(xì)胞，于– 20 ℃冰箱中過(guò)夜。上機(jī)檢測(cè)前按照說(shuō)明書加入配制好的300 ～ 500 μL PI染液并混勻，室溫、避光、反應(yīng)10 ～ 15 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)480 nm，吸收波長(zhǎng)630 nm），檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，計(jì)算細(xì)胞凋亡百分比，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s ）表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，組間差異采用單因素方差分析，P ＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 GLC-82細(xì)胞EGFR基因突變情況

對(duì)人肺腺癌GLC-82細(xì)胞系的EGFR基因第18、19、20、21外顯子進(jìn)行突變檢測(cè)，結(jié)果顯示：樣本均與陰性對(duì)照一致，無(wú)突變，GLC-82細(xì)胞EGFR基因?yàn)橐吧汀?/p>

3.2 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，于E-Plate L8每個(gè)孔中加入不同濃度的GLC-82細(xì)胞懸液（8×104個(gè)/孔、6×104個(gè)/孔、4×104個(gè)/孔、2×104個(gè)/孔），xCELLigence系統(tǒng)動(dòng)態(tài)檢測(cè)。結(jié)果顯示正常培養(yǎng)的人肺腺癌GLC-82細(xì)胞第2天進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，CI值呈時(shí)間依賴性增加，細(xì)胞懸液濃度越大，其達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期的時(shí)間就越短。

3.3 單藥細(xì)胞毒性及藥物代謝檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，于E-Plate L8每個(gè)孔中加入8×104個(gè)/孔的GLC-82細(xì)胞懸液，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度化療藥物（如表1所示），利用iCELLigence DA Software 1.0擬合得出每種藥物的IC50，并檢測(cè)各單藥在細(xì)胞體內(nèi)的時(shí)間依賴性IC50。結(jié)果顯示：藥物按不同濃度梯度作用于細(xì)胞后，細(xì)胞存活率與藥物的濃度相關(guān)，隨著藥物濃度的提高，細(xì)胞存活率逐漸降低。多西他賽和培美曲塞在細(xì)胞內(nèi)36 h達(dá)到穩(wěn)定期，埃克替尼在60 h達(dá)到穩(wěn)定期（圖1）。多西他賽作用于GLC-82細(xì)胞系36 h的IC50為25 mg·mL-1，?？颂婺嶙饔糜贕LC-82細(xì)胞系60 h的IC50為10 μmol·L-1，培美曲塞作用于GLC-82細(xì)胞系36 h的IC50為560 μmol·L-1。

表1 不同單藥加藥組濃度設(shè)置Tab 1 Different concentrations of every single drug

圖1 多西他賽、培美曲塞、?？颂婺釂嗡庍_(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間A – 多西他賽，B – 培美曲塞，C – ?？颂婺酕ig 1 The steady state time of docetaxel, pemetrexed and icotinibA – docetaxel, B – pemetrexed, C – icotinib

3.4 聯(lián)合用藥細(xì)胞毒性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，于E-Plate L8每個(gè)孔中加入8×104個(gè)/孔的GLC-82細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，按照分組要求同時(shí)或序貫加入各化療藥物的IC50，后繼續(xù)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CI值，結(jié)果如圖所示（見圖2）。對(duì)各組CI值進(jìn)行分析得出各加藥組GLC-82細(xì)胞的倍增時(shí)間（表2）。在增殖毒性方面，各序貫處理組方差分析顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0．05），D-I序貫方式優(yōu)于I-D和I+D，P-I序貫方式優(yōu)于I-P和I+P；細(xì)胞倍增時(shí)間更長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制作用更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0．05）。

圖2 多西他賽、培美曲塞和?？颂婺釂为?dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)GLC-82細(xì)胞的增殖毒性檢測(cè)A – 多西他賽和?？颂婺釂为?dú)或聯(lián)合應(yīng)用；B – 培美曲塞和?？颂婺釂为?dú)或聯(lián)合應(yīng)用Fig 2 The reproduction toxicity test of GLC-82 cells in different groupsA – icotinib alone or in combination with docetaxel; B – icotinib alone or in combination with pemetrexed

表2 各組處理后GLC-82細(xì)胞的倍增時(shí)間Tab 2 The doubling time of GLC-82 cells in different groups

3.5 聯(lián)合用藥對(duì)GLC-82細(xì)胞周期的影響

D-I給藥方式主要將細(xì)胞阻滯于G2/M期；P-I給藥方式主要將細(xì)胞阻滯于S期；I-D、I-P的給藥方式主要將細(xì)胞阻滯于G0/G1期；I+D組和I+P組G0/G1期細(xì)胞比例較高，各組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。各組細(xì)胞周期細(xì)胞比例詳見表3。

4 討論

本研究結(jié)果顯示，人肺腺癌細(xì)胞株GLC-82為EGFR野生型，多西他賽、培美曲塞和?？颂婺嵩谝欢舛确秶鷥?nèi)均呈濃度依賴性抑制GLC-82細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)選用EGFR野生型GLC-82細(xì)胞來(lái)進(jìn)行研究，主要是考慮到：（1）既往發(fā)現(xiàn)化療序貫EGFR-TKIs具協(xié)同增效作用的基礎(chǔ)研究是來(lái)自EGFR野生型NSCLC細(xì)胞，臨床研究來(lái)自EGFR突變狀態(tài)未篩選的NSCLC患者；（2）EGFR-TKI對(duì)EGFR突變型細(xì)胞具有很強(qiáng)的殺傷效力。楊新杰等[8]分析了?？颂婺嵋痪€治療晚期NSCLC的近期療效和毒副反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)對(duì)于EGFR突變陽(yáng)性患者有效率更高?；熀虴GFR-TKI合理聯(lián)合應(yīng)用對(duì)敏感性較差的EGFR野生型患者意義尤為重要。

表3 聯(lián)合用藥后各組GLC-82細(xì)胞的周期分布.%，x ± sTab 3 The cell cycle of GLC-82 in different groups.%,x± s

本研究結(jié)果顯示，先用多西他賽后序貫應(yīng)用?？颂婺釋?duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用較多西他賽單藥、埃克替尼單藥、二者同時(shí)應(yīng)用或先埃克替尼后序貫多西他賽明顯；先用培美曲塞后序貫應(yīng)用?？颂婺釋?duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用較培美曲塞單藥、?？颂婺釂嗡?、二者同時(shí)應(yīng)用或先埃克替尼后序貫培美曲塞明顯，具協(xié)同增效作用。INTACT1、INTACT2、TRIBUTE和TALENT的多中心隨機(jī)對(duì)照臨床研究[9-10]也證實(shí)：對(duì)于EGFR突變狀態(tài)未知的晚期NSCLC患者，化療與EGFR-TKI同時(shí)應(yīng)用未優(yōu)于單獨(dú)化療。先化療再序貫EGFR-TKI能夠提高有效率，延長(zhǎng)無(wú)進(jìn)展生存期及肺腺癌患者總生存期[11-13]。并且，有研究顯示化療后EGFR-TKIs靶向藥物維持治療可使PFS延長(zhǎng)[11]。本研究結(jié)果顯示，多西他賽或培美曲塞與?？颂婺嵋圆煌瑫r(shí)序聯(lián)合應(yīng)用均可抑制GLC-82細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，作用強(qiáng)度與應(yīng)用次序有關(guān)。多西他賽或培美曲塞先于埃克替尼給藥方案有更長(zhǎng)的倍增時(shí)間和較好的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。

鹽酸?？颂婺崾且环N高效特異性的EGFR-TKI，如果?？颂婺岚邢蛑委熤蠼o予化療或者與化療同時(shí)聯(lián)合，則會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞停滯于G0/G1期，使化療效果大大降低。如果埃克替尼靶向治療之前給予化療，則會(huì)誘導(dǎo)腫瘤EGFR的過(guò)量表達(dá)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)，使后續(xù)靶向治療的靶向性更強(qiáng)，抑制效果更好。由于本實(shí)驗(yàn)是在體外進(jìn)行的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，與體內(nèi)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)存在一定差異，而且NSCLC是一組具有明顯異質(zhì)性的疾病，因此有必要進(jìn)一步探討多種EGFR野生型細(xì)胞體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，以進(jìn)一步明確藥物作用機(jī)制、聯(lián)合用藥時(shí)序。

[1] 陳孝平.外科學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：438

[2] 張?zhí)烀?單克隆抗體藥物的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，24（6）：494-498.

[3] Siegel R, Ma J, Zou Z, et al. Cancer statistics, 2014[J]. CA Cancer J Clin, 2014, 64: 9-29.

[4] 尋琛，王琳，邊勁．EGFR-TKI與化療藥物在晚期非小細(xì)胞肺癌中最佳聯(lián)合方式的探討[J]．臨床腫瘤學(xué)雜志，2012，17（12）：1141-1145.

[5] 譚芬來(lái)，張力，趙瓊，等.國(guó)家一類新藥鹽酸?？颂婺岬乃幚砼c臨床評(píng)價(jià)[J].中國(guó)新藥雜志，2009，18（18）：1691-1694.

[6] 胡毅，陶海濤.晚期非小細(xì)胞肺癌的藥物治療進(jìn)展[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2014，11（6）：329-332.

[7] 郭磊，李愛潔，王鍵瑋．鹽酸埃克替尼治療晚期肺腺癌的回顧性研究[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2015，12（2）：69-72.

[8] 楊新杰，張卉，秦娜，等. 鹽酸?？颂婺嵋痪€治療晚期肺腺癌的臨床療效觀察[J].中國(guó)肺癌雜志，2013，16（7）：364-368.

[9] Herbst RS, Prager D, Hermann R, et al. TRIBUTE: a phaseⅢtrial of erlotinib hydrochloride (OSI-774) combined with carboplatin and paclitaxel chemotherapy in advanced non-smallcell lung cancer[J]. J Clin Oncol, 2005, 23(25): 5892-5899.

[10] Reck M, von Pawel J, Nimmermann C, et al. PhaseⅡtrial of tirapazamine in combination with cisplatin and gemcitabine in patients with advanced non-small-cell-lung-cancer (NSCLC)[J]. J Clin Oncol, 2004, 58(12): 845-849.

[11] Cappuzzo F, Ciuleanu T, Stelmakh L, et al. Erlotinib as maintenance treatment in advanced non-small-cell lung cancer: a multicentre, randomised, placebo-controlled phase 3 study[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(6): 521-529.

[12] 王禮，吳月兵，余偉江，等．酪氨酸激酶抑制劑與化療交替聯(lián)合治療晚期肺腺癌的臨床療效[J]．腫瘤學(xué)雜志，2014，20（6）：464-467.

[13] 蔡麗君，劉詠梅，盧鈾．EGFR-TKIs聯(lián)合化療在晚期非小細(xì)胞肺癌種的應(yīng)用[J]．中國(guó)腫瘤臨床，2014，41（10）：675-678.

Inhibiting effects of icotinib combined with docetaxel or pemetrexed on NSCLC cells in vitro in different sequential therapies and therapy timings

GUO Lei1, WANG Jin-liang1, QIAN Hai-li2, WANG Hai-juan2, HU Yi1(1. Medical Oncology Department Ⅰof PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. State Key Laboratory of Molecular Oncology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China)

Objective:To investigate the effects of icotinib combined with chemotherapy drugs (docetaxel or pemetrexed) in different sequential therapies and therapy timings on non-small-cell lung cancer cell line GLC-82.Methods:The IC50of docetaxel, pemetrexed and icotinib on GLC-82 and time dependence of each agent were analyzed by xCELLigence system. The proliferations of GLC-82 were compared in different sequential therapies of icotinib combined with docetaxel or pemetrexed. Cell cycle distribution of GLC-82 was measured by flow cytometer for evaluating different sequential therapies, and the cell survival was analyzed by xCELLigence system.Results:At the time of 36 h, docetaxel and pemetrexed reached their balance periods in cells, while icotinib reached its balance period at the time of 60 h. The IC50of docetaxel and pemetrexed on GLC-82 cell line for 36 hours were 25 mg·mL-1and 560 μmol·L-1, respectively; the IC50of icotinib on GLC-82 cell line for 60 hours was 10 μmol·L-1. Compared with the other groups, the doubling time of GLC-82 increased significantly in sequential administration of docetaxel or pemetrexed followed by icotinib groups (P ＜ 0.05). The doubling times of GLC-82 in the D-I group and P-I group were (– 829.1 ± 46.9) h and (– 342.0 ± 3.4) h, respectively. D-I group induced G2/M phase arrest and P-I group induced S phase arrest. These two kinds of administrations had better inhibiting effects on cell growth (P ＜ 0.05).Conclusion:Sequential administration of docetaxel or pemetrexed followed by icotinib at a reasonable time is the optimal combination schedule for the antiproliferative effects of NSCLC cells in vitro.

Icotinib; Docetaxel; Pemetrexed; Lung cancer; Sequential therapy

R965

A

1672 – 8157(2015)03 – 0147 – 05

2015-03-01

2015-04-21）

中國(guó)老年學(xué)學(xué)會(huì)課題（CGOS-03-2014-1-1-00500）

胡毅，男，主任醫(yī)師，研究方向：肺癌的綜合及個(gè)體化治療。E-mail：huyi0401@aliyun.com

郭磊，女，碩士研究生，醫(yī)師，研究方向：惡性腫瘤的綜合治療。E-mail：guoxiaobia@126.com