超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析煙葉中的18種多酚

孔光輝 李勇逄濤 師君麗（云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,玉溪653100）

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量分析煙葉中的18種多酚

孔光輝 李勇*E-mail：liyong189108@163.com逄濤 師君麗
（云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,玉溪653100）

多酚是煙草重要的次生代謝物和香氣物質(zhì)前體。本研究建立了一種煙葉中多酚的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜定量分析方法,方法相對于現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YC/T 202-2006,僅3個(gè)多酚指標(biāo)）增加了15個(gè)新的分析指標(biāo)。比較了不同比例的甲醇-水體系以及甲醇-水-氯仿體系（5∶2∶2,V/V）對煙葉中多酚的提取效果,發(fā)現(xiàn)甲醇-水-氯仿體系（5∶2∶2,V/V）的效果最佳。方法對所有被測多酚的線性相關(guān)系數(shù)（R2）均在0.99以上,檢出限在1～150μg/L之間,定量限在6～350μg/L之間,日內(nèi)重復(fù)性在2.4％ ～6.5％之間,日間重復(fù)性在4.5％～10.1％之間,回收率在89.5％～103.7％之間,符合定量分析的要求。應(yīng)用本方法檢測經(jīng)不同溫度處理的煙草的多酚含量,發(fā)現(xiàn)在給定的實(shí)驗(yàn)條件下,多酚對環(huán)境溫度變化的應(yīng)答可分為隨溫度升高而降低、隨溫度升高而升高、無論溫度升高和降低,含量均降低、以及與溫度變化無顯著相關(guān)4種模式。

煙草；多酚；超高效液相色譜；串聯(lián)質(zhì)譜

1 引 言

多酚是煙草重要的次生代謝物和香氣物質(zhì)前體[1,2]。煙草多酚類化合物不僅直接影響煙葉顏色,而且對煙氣質(zhì)量和香味也有間接影響,其降解產(chǎn)物還可以改善煙草制品的吸味,是衡量煙葉品質(zhì)的重要指標(biāo)[3]。煙草中多酚化合物的含量還可能與煙草的品質(zhì)呈正相關(guān)關(guān)系[4]。

煙草中多酚類化合物主要包括單寧類（如綠原酸、咖啡酸）、香豆素類（如莨菪亭、七葉亭）和類黃酮（如蕓香苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷）,其中每類都有多個(gè)化合物[5～7]。而煙葉中多酚檢測的現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法（YC/T 202-2006）涉及的多酚檢測指標(biāo)僅包括綠原酸、蕓香苷和莨菪亭。部分新建立的分析方法逐步將新綠原酸、隱綠原酸、七葉亭、咖啡酸、山奈酚-3-蕓香糖等物質(zhì)納入煙葉多酚分析指標(biāo)[3,8～20]。2014年,本研究組建立了煙葉中類黃酮物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定方法,并從煙葉中鑒定出12種類黃酮物質(zhì)[21]。2015年,本研究組建立了煙葉中12種類黃酮物質(zhì)的定量分析方法[22]。而將12種類黃酮物質(zhì)與其它6種多酚合并,建立起一種全面的多酚定量分析方法的報(bào)道尚未出現(xiàn)。

在前期工作基礎(chǔ)上,本研究建立了煙葉中18種多酚的定量分析方法。本方法對于開展多酚含量與煙草品質(zhì)的相關(guān)研究以及多酚作為煙草次生代謝物對煙草抗蟲、抗病等相關(guān)研究具有重要意義。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀（UPLC,美國Waters公司）,配AB SCIEX 5500三重四極桿質(zhì)譜儀。SB-50D超聲波提取儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Waters BEH C18（15 cm×2.1 mm,1.7μm）反相色譜柱（美國Waters公司）；LD5-2A離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；CP2245分析天平（感量0.0001 g,德國Sartorious公司）。

甲醇和乙腈（色譜純,德國Merck公司）；超純水由Millipore純化系統(tǒng)制備；綠原酸（Chlorogenic acid,CLRGN acid）、隱綠原酸（Cryptochlorogenic acid,CCLRGN acid）、新綠原酸（Neochlorogenic acid, NCLRGN acid）、莨菪亭（Scopoletin）、七葉亭（Esculetin）、咖啡酸（Caffeic acid）、二氫山奈酚（Aromadendrin）、二氫槲皮素（Taxifolin）、槲皮素（Quercetin）、蕓香苷（Rutin）、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（Kaempferol-3-O-Rutinoside,kaem-3-O-rut）、異鼠李素（Isorhamnetin）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Quercetin-3-O-Glucoside, quer-3-O-glu）、木犀草素（Luteolin）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（Isorhamnetin-3-O-Glucoside,isor-3-O-glu）、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（Isorhamnetin-3-O-Rutinoside,isor-3-O-rut）、山奈酚-3-O-葡萄糖苷（Kaempferol-3-O-Glucoside,kaem-3-O-glu）、柚皮素-7-O-葡萄糖苷（Naringenin-7-O-Glucoside,nari-7-O-glu）等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),以及黃豆苷元（Daidzein）、染料木苷（Genistin,葡萄糖基）、橙皮苷（Hesperidin,蕓香糖基）等內(nèi)標(biāo)物質(zhì),購于Sigma-Aldrich公司、Alfa Aesar公司和百靈威公司。

2.2 樣品前處理

樣品制備：將新鮮的煙葉樣品放入研缽,加液氮冷凍,并迅速研磨粉碎。磨好樣品迅速轉(zhuǎn)入凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥,除去水分,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

樣品提?。簻?zhǔn)確稱取10.0 mg凍干煙葉樣本,加入1 mL提取劑和200μL內(nèi)標(biāo)溶液,超聲30 min,離心,取上清液轉(zhuǎn)入液相色譜進(jìn)樣小瓶分析。

2.3 色譜-質(zhì)譜分析條件

色譜分離條件和質(zhì)譜離子源參數(shù)參照文獻(xiàn)[21],具體為（1）色譜分析條件 Waters BEH C18色譜柱（15 cm×2.1 mm,1.7μm）；流動相A為水,B為乙腈,兩相均添加0.1％ 甲酸和0.2mmol/L醋酸銨；流動相梯度：0～1 min,10％B；1～9 min,10％～90％B；9～11 min,90％～100％B；11～11.1 min, 100％～10％B；11.1～13 min,10％B；柱溫30℃,進(jìn)樣量2μL,流速0.25 mL/min。（2）質(zhì)譜分析條件

離子源,電噴霧電離離子源；噴霧電壓,-4000 V；簾氣壓力,0.276 MPa；離子源溫度,700℃；輔助氣1, 413685 Pa；輔助氣2,344738 Pa；去簇電壓,-100 V。

2.4 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

初步估計(jì),咖啡酸、七葉亭、二氫山奈酚、二氫槲皮素、槲皮素、異鼠李素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、木犀草素、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、柚皮素-7-O-葡萄糖苷等物質(zhì)（以下稱“低濃度多酚”）的濃度梯度在1～10000μg/L之間,綠原酸、隱綠原酸、新綠原酸、莨菪亭、蕓香苷和山奈酚-3-O-蕓香糖苷（以下稱“高濃度多酚”）的濃度梯度在0.1～100 mg/L之間。因此先配制所有標(biāo)準(zhǔn)化合物的1 g/L的單標(biāo)溶液（甲醇為溶劑）。分別移取100μL 1 g/L的低濃度多酚單標(biāo)溶液以及10 mL 1 g/L的高濃度多酚單標(biāo)溶液于100 mL容量瓶,以樣品提取溶液（甲醇-氯仿-水,5∶2∶2, V/V）定容,制成標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。以樣品提取溶液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,制成低濃度多酚濃度為1000, 600,400,100,60,40,10,6,4和1μg/L,體積為1 mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度。此梯度對應(yīng)的高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液梯度為100,60,40,10,6,4,1,0.6,0.4和0.1 mg/L。在所有濃度梯度的溶液中加入200μL內(nèi)標(biāo)混合溶液。內(nèi)標(biāo)混合液為黃豆苷元、染料木苷、橙皮苷的水溶液,濃度為0.1 mg/L。黃豆苷元、染料木苷、橙皮苷分別用于校正無糖基多酚、葡萄糖基取代多酚和蕓香糖基取代多酚。

圖1 不同萃取溶劑對多酚的萃取效果比較Fig.1 Comparison of extraction yield using different extraction solutionsM,W and C stand formethanol,water and chloroform,respectively.

3 結(jié)果與分析

3.1 煙葉多酚萃取條件的優(yōu)化

多酚含有多個(gè)酚羥基,具有一定的極性,文獻(xiàn)報(bào)道的多酚提取方法多采用不同比例的甲醇-水體系作為萃取劑[1,9,23,24]。作者曾考察不同萃取溶劑對類黃酮物質(zhì)的萃取效果,結(jié)果表明,甲醇-氯仿-水（5∶2∶2,V/V）的萃取效果和色素去除效果均較好[20]。本實(shí)驗(yàn)對比分析了不同比例的甲醇-水體系和甲醇-氯仿-水（5∶2∶2）,V/V）的萃取效果。結(jié)果表明,采用甲醇-水體系進(jìn)行提取時(shí),80％甲醇-水體系萃取的效果較好。但甲醇-氯仿-水（5∶2∶2,V/V）體系萃取效果明顯優(yōu)于80％甲醇-水體系（圖1）。這可能是由于甲醇-氯仿-水（5∶2∶2,V/V）離心分層時(shí)剔除了色素物質(zhì),減少了質(zhì)譜分析時(shí)色素等基質(zhì)對多酚的電離抑制作用；另一方面,由于多酚不易溶于氯仿,離心分層后,氯仿層幾乎不含多酚,在萃取液總體積相同的情況下,氯仿層的分離相當(dāng)于增加了多酚在上層中的濃度。本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-氯仿-水（5∶2∶2,V/V）體系進(jìn)行多酚萃取。

3.2 多酚質(zhì)譜分析方法的確定

采用流動注射的方法對質(zhì)譜離子源參數(shù)和具體化合物的定量離子、碰撞能量等進(jìn)行優(yōu)化。其中質(zhì)譜定量離子的選定方法為從標(biāo)準(zhǔn)化合物的二級質(zhì)譜中初步選取4個(gè)較強(qiáng)的碎片離子,優(yōu)化碰撞能,選取碰撞能最優(yōu)時(shí)信噪比最大的兩個(gè)離子作為定量離子。最終得到定量分析的離子源參數(shù)見2.3節(jié)。化合物的定量離子及碰撞能量參數(shù)見表1。

表1 多酚分析質(zhì)譜定量離子及碰撞能量Table 1 Quantitative ions and their related collision energies for polyphenols quantitation

1.NCLRGN acid：新綠原酸（Neochlorogenic acid）；2.CLRGN acid：綠原酸（Chlorogenic acid）；3.CCLRGN acid：隱綠原酸（Cryptochlorogenic acid）；7.Quer-3-O-glu：槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Quercetin-3-O-Glucoside）；8.Kaem-3-O-rut：山奈酚-3-O-蕓香糖苷（Kaempferol-3-O-Rutinoside）；9.Isor-3-O-rut：異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（isorhamnetin-3-O-Rutinoside）；10.Kaem-3-O-glu：山奈酚-3-O-葡萄糖苷（Kaempferol-3-O-Glucoside）；11.Isor-3-O-glu：異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（Isorhamnetin-3-O-Glucoside）；14.Nari-7-O-glu：柚皮素-7-O-葡萄糖苷（Naringenin-7-O-Glucoside）.

3.3 多酚定量分析方法驗(yàn)證

多酚的色譜分離效果見圖2。按照2.4節(jié)所述的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,發(fā)現(xiàn)所有化合物的線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99,說明本方法適合定量分析。對這些化合物進(jìn)行定量限和檢出限評估,發(fā)現(xiàn)不同化合物的檢出限和定量限相差較大,其中咖啡酸、莨菪亭、七葉亭、異鼠李素-3-葡萄糖苷、二氫槲皮素、柚皮素-7-葡萄糖、二氫山奈酚、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷的定量限可達(dá)到6～9μg/L；而綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、蕓香苷、山奈酚-3-O-蕓香苷以、木犀草素、槲皮素、異鼠李素等的定量限在0.08～0.35 mg/L之間（表2）。對多酚進(jìn)行重復(fù)性考察,發(fā)現(xiàn)所考察的多酚的日內(nèi)重復(fù)性在2.4％～6.5％之間,日間重復(fù)性在4.5％～10.1％之間（表3）。根據(jù)多酚在本實(shí)驗(yàn)所測定的11種煙草中的平均濃度,添加平均濃度約50％和100％的標(biāo)準(zhǔn)樣品至實(shí)際樣品中,測得本方法回收率,在89.5％～103.7％之間（表3）。

表2 多酚化合物的校準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限Table 2 Linear regression curves,limits of detection and limits of quantitation of the determined polyphenols

表3 多酚化合物的重復(fù)性和回收率Table 3 Reproducibility and recovery of the determined polyphenols

3.4 不同環(huán)境溫度處理煙草的多酚差異研究

利用所建立的多酚定量分析方法,對不同環(huán)境溫度（低溫18.5℃、常溫23.5℃、高溫28.5℃）生長的煙草進(jìn)行多酚主成分分析（圖3）,結(jié)果表明,高溫和低溫處理的煙草多酚整體輪廓相對常溫對照發(fā)生了明顯變化。而這些變化的主要來源為綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、莨菪亭、蕓香苷、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷等（圖4）。其中,綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸等多酚隨著溫度的降低而升高,且低溫對綠原酸及其異構(gòu)體的影響比高溫明顯。低溫和高溫處理煙草的綠原酸及其異構(gòu)體的含量總和分別是常溫對照的2.93倍和0.62倍。溫度對莨菪亭的影響與綠原酸及其異構(gòu)體不同。高溫和低溫均會降低莨菪亭的含量。其中高溫和低溫處理煙草中莨菪亭含量分別為為常溫的0.22倍和0.47倍。煙草中蕓香苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量與溫度的關(guān)系與綠原酸相反,隨著溫度的降低而減少,只是其變化的幅度沒有綠原酸大。其余多酚在不同溫度處理煙草間含量分布未見顯著性差異。不同多酚的變化趨勢差異說明煙草中多酚在應(yīng)對環(huán)境溫度改變時(shí)所采取的策略各不相同。其應(yīng)對策略可歸納為4類：隨溫度的升高而升高、隨溫度的升高而降低、溫度升高或降低時(shí)均降低、以及與溫度變化無顯著變化關(guān)系。

圖2 多酚的色譜分離圖Fig.2 Chromatogram of polyphenols圖中數(shù)字編號對應(yīng)的多酚名稱見表1中多酚編號對應(yīng)的名稱。Names of the numbered polyphenols can be found in Table 1.

圖3 不同溫度生長煙草多酚的主成分分析得分圖Fig.3 Principal components analysis of tobacco planted at differentenvironment temperatures using the polyphenol data

圖4 差異性多酚的含量分布圖Fig.4 Concentration distribution of differential polyphenols注：圖中“**”和“*”分別表示組間差異p值小于0.01和0.05。“**”and“*”stand for the p value of significance less than 0.01 and 0.05,respectively.H,N and L stand for High temperature,normal temperature and low temperature,respectively.

4 結(jié)論

本研究建立LC-MS/MS定量分析煙葉中18種多酚的方法。本方法將現(xiàn)有多酚分析方法的分析指標(biāo)擴(kuò)展到18個(gè)。方法簡單、快速、準(zhǔn)確、覆蓋面廣。將本方法用于不同環(huán)境溫度處理煙草的研究發(fā)現(xiàn),不同類型多酚對外界環(huán)境變化的應(yīng)對方式各不相同。本方法的建立對從事煙草多酚相關(guān)研究具有參考意義。

1 LIU Fang,YANG Liu,SUN Lin,ZHANG Xia,MIAOMing-Ming,DING Zhong-Tao.Acta Tabac.Sin.,2008,14（6）：1-5

劉芳,楊柳,孫林,張霞,繆明明,丁中濤.中國煙草學(xué)報(bào),2008,14（6）：1-5

2 PAN Rui-Zhi.Plant Physiology（4th ed.）,Beijing：Higher Education Press,2001：112-113

潘瑞熾.植物生理學(xué)（第4版）,北京：高等教育出版社,2001：112-113

3 XU Zi-Cheng,QIN Lu,SHAO Hui-Fang,DAI Ya,LI Dong-Liang,TANG Shi-Jun.J.Henan Agric.Univ.,2010, 44（4）：383-389

許自成,秦璐,邵惠芳,戴亞,李東亮,唐士軍.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,44（4）：383-389

4 YU Jian-Jun,LI Lin,PANG Tian-He,REN Xiao-Hong,SHAO Hui-Fang.J.Henan Agric.Univ.,2006,40（1）：108-112

于建軍,李琳,龐天河,任曉紅,邵惠芳.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,40（1）：108-112

5 YANG Zhi-Xiao,WANG Yi,REN Xue-Liang,LIU Hong-Feng,HAN Hui-Jie,ZHAO Jie-Hong.J.Henan Agric.Sci., 2012,41（10）：1-5

楊志曉,王軼,任學(xué)良,劉紅峰,韓慧杰,趙杰宏.河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,41（10）：1-5

6 LENG Hong-Qiong,GUO Ya-Dong,LIU Wei,ZHANG Tao,DENG Liang,SHEN Zhi-Qiang.Spectroscopy and Spectral Analysis,2013,33（7）：1801-1804

冷紅瓊,郭亞東,劉巍,張濤,鄧亮,沈志強(qiáng).光譜學(xué)與光譜分析,2013,33（7）：1801-1804

7 LüJing.Chinese.Tobac.Sci.,2014,35（5）：109-111

呂婧.中國煙草科學(xué),2014,35（5）：109-111

8 Li Z,Wang L,Yang G,Shi H,Jiang C,Liu W,Zhang Y.J.Chromatogr.Sci.,2003,41（1）：36-40

9 Wang J,Lu D,Zhao H,Jiang B,Wang J,Ling X,Chai H,Ouyang P.J.Serb.Chem.Soc.,2010,75（7）：875-891

10 Xie F,Yu A,Hou D,Liu H,Ding L,Zhang S.Am.J.Anal.Chem.,2011,2（8）：929-933

11 CHEN Jian-Ming,FENG Hong-TAO,XIA Qi-DONG,ZHOU Gui-Yuan,LIU Jing,DONG Sheng-Qiang,YANG Shi-Hua.

Anhui Agric.Sci.,2013,41（13）：5929-5930

陳劍明,馮洪濤,夏啟東,周桂園,劉靜,董勝強(qiáng),楊式華.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,41（13）：5929-5930

12 CHEN Yan-Wu,XIAO Kun,YIN Du-Lin,LIAN Shi-Xun.J.Shunde Polytech.,2006,4（1）：27-30

陳燕舞,肖坤,尹篤林,廉世勛.順德職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,4（1）：27-30

13 LIYing-Jin,LIU Yan-Hong,WU Yu-Ping,SHI Jun-Li,PANG Tao,KONG Guang-Hui.Chinese.J.Spectrosc.Lab., 2010,27（6）：2396-2401

李應(yīng)金,劉彥紅,吳玉萍,師君麗,逄濤,孔光輝.光譜實(shí)驗(yàn)室,2010,27（6）：2396-2401

14 SU Qiang,LIU Yang,GUOWei-Min,LIXu-Tao.Anhui Agric.Sci.,2010,38（24）：13083-13085

蘇強(qiáng),劉陽,過為民,李許濤.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38（24）：13083-13085

15 WU De-Xi,HE Jie,XIANG Li-Hong,WANG Chao,WUWen-Dou,YANG Ying-Ming,LIFan.AnhuiAgric.Sci.,2014, 42（22）：7561-7562

吳德喜,何潔,向麗紅,王超,吳文斗,楊應(yīng)明,李凡.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42（22）：7561-7562

16 YANG Hong-Qi,WANG Yong,ZHOU Ji-Heng,ZHONG Ke-Jun,YUE Qian.Acta Tabac.Sin.,2007,13（3）：21-24

楊虹琦,王勇,周冀衡,鐘科軍,岳騫.中國煙草學(xué)報(bào),2007,13（3）：21-24

17 ZHUANG Ya-Dong,ZHU Huai-Yuan,CAO Yi,LIU Xian-Jun,SHEN Xiao-Chen.Tob.Sci.Technol.,2014,（6）：38-41

莊亞東,朱懷遠(yuǎn),曹毅,劉獻(xiàn)軍,沈曉晨.煙草科技,2014,（6）：38-41

18 Gu J,Zeng X,Kong B,Mao Y,Liu W,WeiW.Chromatogr.,2010,71（9-10）：769-774

19 Zhao R,Li F,Hu J.Anal.Methods,2011,3（10）：2421-2424

20 Ji X,Wei Y,Liu G,Che H.J.Food Agric.Environ.,2013,11（1）：868-870

21 Li Y,Pang T,Shi J,Lu X,Deng J,Lin Q.J.Sep.Sci.,2014,37（21）：3067-3073

22 LIYong,LIN Qian,PANG Tao,SHI Jun-Li.Chinese Journal ofChromatography,2015,33（7）：746-752

李勇,林茜,逄濤,師君麗.色譜,2015,33（7）：746-752

23 BAIChang-Min,ZHONG Ke-Jun,HUANG Jian-Guo,CAO Guo-Jun,XU Guo-Wang.Chinese J.Anal.Chem.,2006, 34（11）：1619-162白長敏,鐘科軍,黃建國,曹國軍,許國旺.分析化學(xué),2006,34（11）：1619-1621

24 ZHANG Tian,DONG Xue-Chang,WU Fang-Ping,YANG Guang-Yu,QIAO Yong-Feng.Chinese J.Anal.Chem.,2005, 33（3）：359-362張?zhí)?董學(xué)暢,吳方評,楊光宇,喬永峰.分析化學(xué),2005,33（3）：359-362

（Received 6 September 2015；accepted 21 October 2015）

Quantitation of 18 Polyphenols in Tobacco Leaf Using Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem M ass Spectrometry

KONG Guang-Hui,LIYong*,PANG Tao,SHIJun-Li
（Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science,Yuxi653100,China）

Polyphenols are very important secondary metabolites for tobacco plants.They are also considered as the important flavor precursors for cigarette industry.A liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）-based method was established for the simultaneous determination of 18 polyphenols in tobacco leaf.The developed method can be used to determine 15 more polyphenols compared to the standard method for industry（YC/T 202-2006）.Different kinds of extraction solution were compared and a solution of methanol-water-chloroform（5∶2∶2,V/V）was selected for the extraction because of its highest yield.Method validation was performed and the result showed that all the 18 polyphenols have their linear correlation coefficients（R2）more than 0.99.The low limit of determination and the low limit of quantitation were in the range of 1-150μg/L and 6-350μg/L,respectively.Intra-day and Inter-day reproducibility were in the range of2.4％-6.5％and 4.5％-10.1％,respectively.Recoverieswere in the range of 89.5％-103.7％.The established method was then successfully used to analyze polyphenols of tobacco leaves planted under different environment temperatures.The polyphenols can be classified in four groups based on their response to the temperature changing：the concentration increase with the increasing environment temperature,the concentration decrease with the increasing environment temperature,the concentration decrease with the environment temperature changes from the normal set point,and the concentration does not change significantly with the changing environment temperature.

Tobacco；Polyphenols；Ultra performance liquid chromatography；Tandem mass spectrometry

10.11895/j.issn.0253-3820.150706

2015-09-06收稿；2015-10-21接受

本文系云南省煙草專賣局基金資助項(xiàng)目（No.2014YN11）