用于檢測細胞中亞硝酰氫的近紅外熒光探針及其生物應用

劉萍韓瀟玥,于法標陳令新（中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室,山東省海岸帶環(huán)境工程技術研究中心,中國科學院煙臺海岸帶研究所,煙臺64003）（中國科學院大學,北京00049）

用于檢測細胞中亞硝酰氫的近紅外熒光探針及其生物應用

劉萍1韓瀟玥1,2于法標*1陳令新*11（中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室,山東省海岸帶環(huán)境工程技術研究中心,中國科學院煙臺海岸帶研究所,煙臺264003）
2（中國科學院大學,北京100049）

亞硝酰氫（HNO）是NO的單電子質子化還原產物。在治療心血管疾病中,HNO與NO起不同的藥理活性。針對HNO活性高,難以實時檢測的問題,本實驗設計合成了一種新型不含金屬離子的近紅外熒光探針ER-JN,用于實時檢測模擬生理條件下和活細胞內HNO濃度的變化。此探針由熒光團氮雜氟硼吡咯（Aza-BODIPY）和HNO的識別基團三苯基膦兩部分組成。探針采用硅膠柱層析分離,洗脫劑為二氯甲烷。產品為墨綠色晶體,產率為28％。此探針具有靈敏性高、選擇性強、細胞毒性低等優(yōu)點,可用于定量檢測模擬生理條件下HNO的濃度。檢測前后探針的量子產量從0.01增加到0.35。線性范圍為0～50μmol/L,探針的檢出限（S/N=3）是0.03μmol/L。激光掃描共聚焦顯微鏡成像分析表明,此探針可以用于可視化檢測活細胞內HNO濃度的變化。流式細胞分析的結果顯示ER-JN能定性和定量檢測細胞內HNO的水平。實驗結論表明,探針ER-JN不僅能夠檢測溶液中的HNO,還能定位于細胞內質網,檢測細胞中HNO的變化?？蔀檠芯縼喖毎?、細胞、器官乃及活體中HNO的生理病理功能提供重要的實驗依據(jù)。

熒光探針；亞硝酰氫；細胞分析；近紅外成像

1 引 言

亞硝酰氫（Nitroxyl,HNO）是一氧化氮（NO）的單電子還原并質子化的衍生物。其所具有的生物和藥理作用特征與NO迥然不同。由于其潛在的生物藥理活性,近年來引起了廣泛關注。HNO與心絞痛、急性高血壓、動脈粥樣硬化等眾多心血管疾病有著緊密的關系[1]。有報導證實,在體內外實驗中, Angeli′s鹽（HNO供體）是強效的血管舒張劑,它能引起離體大動脈、小阻力動脈及完整的冠狀動脈舒張[2,3]。另外,在心肌收縮功能方面HNO與NO所起的藥理作用也不同,HNO以心肌肌漿的蘭尼堿受體為靶點增強心肌收縮[4]。該藥理特性為應對心力衰竭提供了一種潛在的治療方案,并可有效避免硝酸甘油耐受性的問題。盡管越來越多的證據(jù)表明了HNO生物藥理作用的重要性,然而由于HNO活性高,在生物體環(huán)境中極易脫水發(fā)生不可逆的二聚化反應生成N2O[1,2,5],使得對細胞內源性HNO作用機制的研究因缺乏有效的檢測手段而無法順利開展。

傳統(tǒng)的檢測HNO的方法主要有電化學法、電子自旋共振波譜法、化學發(fā)光法和比色法等[6,7]。與這些方法相比,熒光探針法不僅具有靈敏度高、操作簡單、選擇性好、非侵入性等特點,還能對檢測對象在原位進行實時監(jiān)控和觀察[8,9]。因此,設計合成能特異性響應HNO的熒光探針凸顯重要。目前,檢測亞硝酰氫的探針較少,且主要基于銅絡合物[10～12]。該類含金屬內核的熒光探針易受到細胞內源性還原物種,例如谷胱甘肽和抗壞血酸等的干擾；而且所報道探針的熒光發(fā)射大多集中在紫外-可見區(qū)域,因為許多生物體及其組織在紫外-可見光的激發(fā)下會發(fā)射生物背景熒光,會嚴重干擾生物樣品的熒光檢測,嚴重影響了熒光分析的靈敏度和精確性。而近紅外熒光探針的最大吸收波長和發(fā)射波長位于650～900 nm光區(qū)。該光區(qū)可有效避免生物背景熒光干擾,使探針能夠獲得較高的信噪比,并降低生物樣品的光損傷[13,14]。本研究組一直致力于開發(fā)用于檢測活性氮物種、活性硫物種和活性氧物種的熒光探針[13～19]。最近報道了用于檢測HNO的熒光探針Lyso-JN和Cyto-JN[20,21],并將其應用于活細胞內HNO水平變化檢測,及小鼠體內HNO的熒光成像分析。在此基礎上,本研究合成了新的ER-JN熒光探針,并用于定性和定量檢測活細胞內的HNO。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

PH-3C型酸度計（上海雷磁公司）；RF-5301PC型熒光分光光度計（島津公司）；NanoDrop 2000/2000C型紫外可見分光光度計（Thermo Scientifisher公司）；XS105型分析天平（Mettler Toledo公司）；Cascade-bio型超純水系統(tǒng)（Pall公司）；AVANCE IIITM 500型核磁共振儀（Bruker公司）；FluoView FV1000型激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司）；流式細胞儀（BD）；小動物活體成像系統(tǒng)（Bruker公司）；RAW264.7細胞（中國科學院細胞庫）；DMEM培養(yǎng)基,胰酶（Gibco公司）；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT,Sigma公司）；實驗用水為二次純水；其它試劑均為市售產品（上海國藥集團）。

2.2 探針ER-JN的合成

探針ER-JN合成路線如圖1所示。Aza-BODIPY熒光團（52.9 mg,0.1 mmol）、2-（二苯基膦）苯甲酸（61.2 mg,0.2 mmol）、4-二甲氨基吡啶DMAP（24.4 mg,0.2 mmol）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDCI,19.2 mg,0.1 mmol）溶于25 mL經過干燥二氯甲烷中,常溫下攪拌24 h,氬氣保護,TLC追蹤反應進程。粗產品由NaBr的飽和溶液洗滌至中性,二氯甲烷萃取,蒸干有機相。殘余物采用硅膠柱層析分離,洗脫劑為二氯甲烷。產品為墨綠色晶體,產率為28％。1H NMR（500 MHz, DMSO-D6）δ（ppm）：8.31～8.01（m,1H）,7.53～7.40（m,6H）,7.25～7.23（m,23H）,7.16（m, 2H）,6.98～6.94（m,2H）,4.05（m,2H）,1.98（m,2H）,1.26～0.98（m,37H）,13C NMR （125 MHz,DMSO-D6）δ（ppm）：165.02,162.82,157.01,152.12,137.63,137.54,134.31,134.14, 133.97,133.63,131.84,131.66,131.00,129.96,129.77,129.63,129.52,125.39,129.31, 129.26,129.21,129.16,122.40,121.27,116.72,60.22,30.01,21.02,14.55.31PNMR（200 MHz, CDCl3-D）δ（ppm）：-4.05.LC-MS（ESI-）：C71H75BF2N3O3P calcd.1097.56 found 1097.57。

圖1 探針分子ER-JN合成路線Fig.1 The synthetic steps for probe ER-JNAzo-BOTIPY：A BF2-chelated tetraarylazadipyrromethane fluorophore.

2.3 探針ER-JN光譜分析

將Tween 80（10％,0.4 mL）加入到10.0 mL比色管中,用HEPES緩沖液（10mmol/L,pH=7.4）稀釋到近10.0 mL,然后加入不同濃度的AS（全文以HNO為代表）。最后加入探針ER-JN。將混合液平衡20min后以待測定。紫外-可見吸收光譜在NanoDrop 2000/2000C紫外-可見分光光度計上進行測定。用熒光分光光度計測定熒光光譜。

2.4 細胞培養(yǎng)

小鼠巨噬細胞株（RAW264.7）細胞購自中國科學院生物化學和細胞生物學研究所細胞庫,并按照說明進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)基為含10％ 胎牛血清的高糖Dulbecco′smodified Eagle′smedium（DMEM）,細胞置于37℃通入5％CO2/95％空氣的MCO-15AC培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）中,細胞達到融合狀態(tài)時,PBS緩沖液洗滌兩遍后,0.25％胰酶消化傳代。

2.5 細胞毒性實驗

RAW264.7細胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清的DMEM中,并置于37℃的通入5％CO2/95％空氣的MCO-15AC培養(yǎng)箱中。密度為8000/孔的RAW264.7細胞接種到96-孔板中并培養(yǎng)24 h。隨后,分別用濃度0.1～100μmol/L的探針孵育RAW264.7細胞24 h。然后在每個孔中分別加入MTT（Sigma公司）溶液（5.0mg/mL,20μL）,在37°C下培養(yǎng)4 h,然后將96-孔板中MTT溶液去除,每個孔加入150μL二甲基亞砜（DMSO）,溶解藍紫色甲瓚（Formazan）晶體。最后將96-孔板放置在微孔板讀數(shù)器上,振蕩10min,用酶聯(lián)免疫檢測儀OD在490 nm處測量各孔的吸光值。

2.6 激光共聚焦顯微鏡成像

細胞培養(yǎng)皿中充滿1 mL新鮮的DMEM培養(yǎng)基,依次加入細胞核染料Hoechst33342（1μg/mL）,細胞內質網定位染料DiOC6（3）（3,3′-Dihexyloxacarbocyanine iodide,0.1μmol/L）,探針ER-JN（DMSO, 1μmol/L）和HNO（200μmol/L）在細胞培養(yǎng)箱中37℃條件下分別孵育相應的時間。在細胞成像之前,除去培養(yǎng)基,然后用DMEM洗滌細胞3次,除去過多探針等。用激光共聚焦顯微鏡進行細胞成像（×60）。

2.7 流式細胞儀檢測

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞,30萬個/孔,種于六孔板,置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育24～48 h,加入5μmol/L ER-JN孵育15min后,分別加入200μmol/L AS,孵育10和20min,將細胞消化收集到流式管中,用DMEM洗滌兩次后,PBS重懸,流式細胞儀（BD Aria）檢測,激發(fā)波長633 nm,收集波長750～810 nm。

3 結果與討論

3.1 探針ER-JN的設計

設計合成了一種用于檢測HNO的近紅外熒光探針ER-JN。該探針可定位于細胞內質網（Endoplasmic reticulum,ER）。如圖2所示,熒光探針ER-JN由3部分組成：熒光團Aza-BODIPY、識別單元三苯基膦基團、內質網定位烷基鏈。熒光團Aza-BODIPY的激發(fā)和發(fā)射區(qū)均位于近紅外區(qū)。作為HNO的識別單元的三苯基膦基團可與HNO反應生成氮葉立德中間體,氮葉立德繼而與分子內合適位置的酯基發(fā)生親核反應形成一個酰胺,脫去后釋放出熒光團Aza-BODIPY,使熒光團恢復發(fā)射熒光[20,21]。長鏈脂溶性烷基則具有典型的內質網定位功能。實驗結果表明,熒光探針ER-JN可以成功用于檢測活細胞內質網的HNO濃度變化。

圖2 探針ER-JN檢測HNO的建議機理Fig.2 Proposed reaction mechanism for HNO detection

3.2 探針光譜特性研究

模擬生理條件下（10mmol/L HEPES緩沖液,pH 7.4,0.5％吐溫80）對探針ER-JN的光譜特性進行考察。如圖3a所示,探針ER-JN（5μmol/L）最大吸收波長為675 nm（ε=5.2×104mol/L·cm）,當加入50μmol/L AS后,675 nm處吸收峰消失,707 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰 （ε=6.9× 104mol/L·cm）,表明探針和AS發(fā)生反應導致酯鍵斷裂,釋放出熒光團Aza-BODIPY。為了評估ER-JN在模擬生理條件下測定HNO濃度的能力,實驗選擇690nm作為熒光激發(fā)波長。向緩沖溶液中添加AS,當HNO的濃度從0增加到50μmol/L時,ER-JN的熒光強度不斷增強,相應的熒光最大值在710nm處,量子產量從0.01增加到0.35。此外,當AS濃度在0～50μmol/L之間時,其與熒光強度之間呈良好的線性關系（見圖4）,線性回歸方程是F710nm=6.3CHNO（μmol/L）+39.7（r=0.9981）。探針的檢出限（S/N=3）是0.03μmol/L,表明ER-JN對HNO具有較高的靈敏度。結果表明,此探針的吸收和發(fā)射波長都在近紅外區(qū)域,表明熒光探針ER-JN適用于細胞和活體內成像。

3.3 探針檢測選擇性研究

圖3 加入50μmol/LHNO后,探針ER-JN吸收光譜的變化（a）；加入0～50μmol/LHNO20min后,探針ER-JN（10μmol/L）的熒光發(fā)射光譜變化（b）Fig.3 a.UV-visabsorptionspectralofprobeER-JN（10μmol/L）beforeandafteradditionof50μmol/L HNO；b.FluorescencespectraofER-JN（10μmol/L）uponadditionofHNO（0-50μmol/L）for20min

為了驗證ER-JN對HNO的特異性響應,針對生理相關活性氧、活性氮以及其它常見生理物種在溶液中對探針進行了測試。結果表明,在0,5,10,15 和20min后,ER-JN對HNO的熒光的響應超過其它生物相關物種,選擇性良好（圖5）。探針對谷胱甘肽、半胱氨酸以及其它還原性物質、活性氧物種、活性氮物種的熒光響應極為微弱。有研究表明,GSNO可與HNO發(fā)生相似反應,生成酰胺。如圖5所示, GSNO能在20min內引發(fā)響應,做出有限的熒光響應。然而,其增加的熒光強度遠弱于HNO所引起的熒光變化。以上實驗結果表明,ER-JN對HNO的選擇性明顯優(yōu)于GSNO。與此同時,作為AS的另一分解產物,探針ER-JN對其的前后熒光響應沒有顯著的差異。因此,在競爭實驗中,探針ER-JN對于HNO的識別幾乎不受其它生物相關物種的干擾,也就是探針ER-JN表現(xiàn)出對HNO良好的專一性。

圖4 HNO濃度（0～50μmol/L）和波長710nm處的熒光強度之間的線性關系Fig.4 Linearrelationshipbetweenfluorescentintensity at710nmandAngeli′ssalt（AS）（0-50μmol/L）in buffersolution

3.4 探針的細胞毒性研究

低細胞毒性是探針能夠應用于活細胞檢測的一個重要標準。因此,MTT實驗選用RAW264.7細胞為細胞模型進行了測試,以便對此探針的細胞毒性做出評價。檢測結果如圖6所示,探針的濃度在（0.1～100μmol/L）遞增,細胞的24h成活率均大于90％。此探針具有良好的生物兼容性,能夠很好地滿足細胞實驗要求,可用于活細胞內HNO的檢測。

3.5 細胞成像

基于探針ER-JN對HNO的檢測具有高選擇性和高靈敏度等特點,將此探針應用于細胞檢測中,利用激光掃描共聚焦顯微鏡對細胞內HNO的變化進行熒光成像分析。細胞用1μmol/LER-JN孵育15min后,DMEM洗滌去掉過量的探針,細胞呈現(xiàn)微弱的熒光（圖7a）。向此細胞體系中加入200μmol/L HNO作用10min后,熒光強度明顯增強（圖7b）,隨著時間的推移,細胞發(fā)出越來越強的熒光（圖7c）。以上結果表明,探針ER-JN能夠用于檢測細胞內HNO濃度的變化。利用細胞內質網染料DiOC6（3）（3,3′-dihexyloxacarbocyanine iodide）和細胞核染料Hoechst 33342研究探針在RAW264.7中的亞細胞定位。通過細胞復染圖可以看出探針與DiOC6（3）的熒光重合度較大,而與細胞核染料Hoechst 33342的熒光幾乎沒有重合。因此,探針ER-JN具有良好的亞細胞定位功能,可用于活細胞中HNO的熒光檢測。探針在細胞中主要定位于細胞內質網。

3.6 流式細胞儀檢測

圖5 10μmol/L ER-JN對HNO和其他相關物種隨時間變化的熒光響應Fig.5 Fluorescence responses of10μmol/L ER-JN to testing species in 4-（2-Hydroxyethyl）-1-piperazineethanesulfonic acid（HEPES）buffer solution（a）1,50μmol/L HNO；2,20μmol/L S-nitrosoglutathione（GSNO）；3,200μmol/L Peroxynitrite（ONOO-）；4,50μmol/L 3-（Aminopropyl）-1-hydroxy-3-isopropyl-2-oxo-1-triazene（NOC-5）；5,500μmol/L；6,200μmol/L H2O2；7,100μmol/L；8,20μmol/L Methyl linoleate hydroperoxide（MeLOOH）；9,200μmol/L ClO-.（b）1,50μmol/L半胱氨酸（L-Cysteine, Cys）；2,100μmol/L谷胱甘肽（Glutathione,GSH）；3,500μmol/L NaHS；4,200μmol/L抗壞血酸（L-Ascorbic acid,Vc）；5,200μmol/L生育酚（Tocopherol,VE）；6,100μmol/L檸檬酸鹽（Citrate）；7,200μmol/L絡氨酸（Tyrosine,Tyr）；8,50μmol/L羥胺（Hydroxylamine,HA）。

圖6 探針ER-JN對RAW264.7細胞的毒性實驗。細胞用0.1～100μmol/L的探針孵育24 h。數(shù)據(jù)代表平均值±標準差,每組設3個平行實驗Fig.6 Cell viabilities of ER-JN against RAW264.7 cells.Cells were treated with 0.1-100μmol/L of ER-JN for 24 h.Data were expressed as the means±SD of data obtained from triplicate experiment

激光掃描共聚焦顯微鏡分析視野中相對少的細胞,而流式細胞儀能夠快速檢測上百萬的細胞,得到更可信的結果。為了進一步驗證圖7中的實驗結果,采用流式細胞技術分析HNO引起的細胞內熒光變化。圖8中X軸代表熒光強度,Y軸代表細胞數(shù)目。細胞分成4組：（a）對照組；（b）加探針對照組；（c）探針加200μmol/L HNO孵育10min組；（d）探針加200μmol/L HNO孵育10min組。如圖8所示,對照組a和b幾乎沒有顯示出熒光。c組熒光有所增強,而d組熒光有了更明顯的增強。上述實驗結果與圖7中熒光成像分析結果的趨勢一致。上述結果表明,探針ER-JN能夠定性和定量地檢測細胞內HNO的濃度變化。

4 結論

本實驗設計合成了一種用于檢測細胞內HNO濃度變化的近紅外熒光探針ER-JN。此探針采用Aza-BODIPY為熒光團,三苯基膦為HNO的響應基團。此探針對HNO具有明顯的熒光“開啟”功能。此探針具有選擇性好、靈敏度高和細胞毒性底等優(yōu)點。除此之外,探針不僅能夠檢測溶液中的HNO,還能定位于細胞內質網,檢測細胞中HNO濃度的變化。此探針對于研究亞細胞、細胞、器官乃及活體中HNO的生理病理功能具有重要的意義和實用價值。

圖7 探針ER-JN檢測RAW264.7細胞中HNO的激光共聚焦成像分析。（a）細胞體系中加入探針ER-JN（1μmol/L）孵育15min；（b）和（c）細胞同上述a處理過后分別加入200μmol/L HNO孵育10和20min后的熒光成像；各組中：細胞內質網染料DiOC6（3）的熒光成像；細胞核染料Hoechst 33342的熒光成像；3個熒光通道ER-JN、DiOC6（3）、Hochest33342的疊加圖像；3個熒光通道場疊加成像。紅色通道：ER-JN激發(fā)波長690 nm,熒光收集波段700～800 nm；綠色通道：DiOC6激發(fā)波長488 nm,熒光收集波段560～600 nm；藍色通道：Hochest33342激發(fā)波長405 nm,收集波長420～480 nmFig.7 Confocal fluorescence images of HNO in RAW 264.7 cells with ER-JN.（a）Cells loaded with 1μmol/L probe for 15min.（b）and（c）Cells treated with 200μmol/L HNO for 10 and 20min, respectively；In each group： ER-JN bioimage from red channel. 3,3′-dihexyloxacarbocyanineiodide （DiOC6）（3）bio-image from green channel.Hochest 33342 bioimage from blue channel.Overlay of red channel,green channel and blue channel,and overlay of red channel,green channel,blue channel and bright field.Red channel：λex=690 nm,λem=700-800 nm；Green channel：λex=488 nm,λem=560-600 nm；Blue channel：λex=405 nm,λem=420-480 nm

圖8 探針ER-JN檢測RAW264.7細胞中HNO變化的流式細胞分析。（a）對照組；（b）加1μmol/L探針孵育15min后,細胞用DMEM洗3次；（c）細胞按照b）處理后,加200μmol/L HNO孵育10min組；（d）細胞按照c）處理后的細胞,再加200μmol/L HNO孵育20minFig.8 Represent data of flow-cytometric analysis：（a）Control；（b）The cellswere incubated with 1μmol/L ER-JN for 15min,then washed with dulbecco′smodified eagle medixm（DMEM）three times to remove the overdose probe；（c）The cells were treated as described in（b）,then incubated with 200μmol/L HNO for 10min；（d）The cellswere treated as described in（c）,then exposed to another dosages of200μmol/LHNO for an additional 20min

References

1 Irvine JC,Ritchie R H,Favaloro JL,Andrews K L,Widdop R E,Kemp-Harper B K.Trends Pharmacol.Sci.,2008, 29（12）：601-608

2 Paolocci N,Jackson M I,Lopez B E,Miranda K,TocchettiCG,Wink D A,Hobbs A J,Fukuto JM.Pharmacol.Ther., 2007,113（2）：442-458

3 Favaloro JL,Kemp-Harper B K.Cardiovasc.Res.,2007,73（3）：587-596

4 Paolocci N,Saavedra W F,Miranda K M,Martignani C,Isoda T,Hare JM,Espey M G,Fukuto JM,Feelisch M,Wink D A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,2001,98（18）：10463-10468

5 Dutton A S,Fukuto JM,Houk K.J.Am.Chem.Soc.,2004,126（12）：3795-3800

6 Malinski T,Taha Z.Nature,1992,358（6388）：676-678

7 Nagano T,Yoshimura T.Chem.Rev.,2002,102（4）：1235-1270

8 Li X,Gao X,ShiW,Ma H.Chem.Rev.,2014,114（1）：590-596

9 Wang R,Yu C,Yu F,Chen L.TrAC.Trends Anal.Chem.,2010,29：1004-1013

10 Wrobel A T,Johnstone T C,Deliz L A,Lippard S J,Rivera-Fuentes P.J.Am.Chem.Soc.,2014,136（12）：4697-4705

11 McQuade L E,Lippard S J.Curr.Opin.Chem.Biol.,2010,14（1）：43-49

12 Zhou Y,Liu K,Li J,Fang Y,Zhao T,Yao C.Org.Lett.,2011,13（6）：1290-1293

13 Wang R,Yu F,Chen L,Chen H,Wang L,Zhang W.Chem.Commun.,2012,48（96）：11757-11759

14 Wang R,Yu F,Liu,Chen L.Chem.Commun.,2012,48（43）：5310-5312

15 JING Xiao-Tong,YU Fa-Biao,CHEN Ling-Xin.Process in Chemistry,2014,26（5）：866-878

景曉彤,于法標,陳令新.化學進展,2014,26（5）：866-878

16 GAO Min,YU Fa-Biao,CHEN Ling-Xin.Process in Chemistry,2014,26（6）：1065-1078

高敏,于法標,陳令新.化學進展,2015,87（7）：3631-3638

17 Wang R,Chen L,Liu P,Zhang Q,Wang Y Q.Chem.Eur.J.,2012,18（36）：11343-11349

18 Gao M,Yu F,Chen H,Chen L.Anal.Chem.,2015,87（7）：3631-3638

19 Gao M,Wang R,Yu F,You J,Chen L.Analyst,2015,140（11）：3766-3772

20 Jing X,Yu F,Chen L.Chem.Commun.,2014,50（91）：14253-14256

21 Liu P,Jing X,Yu F,Lv C,Chen L.Analyst,2015,140（13）：4576-4583

（Received 28 May 2015；accepted 21 August2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（Nos.21405172,21575159,21275158 ）

A Near-Infrared Fluorescent Probe for Detection of Nitroxyl in Living Cells

LIU Ping1,HAN Xiao-Yue1,2,YU Fa-Biao*1,CHEN Ling-Xin*11（Key Laboratory ofCoastal Environmental Processes and Ecological Remediation, The Research Centre for Coastal Environmental Engineering and Technology, Yantai Institute ofCoastal Zone Research,Chinese Academy of Sciences,Yantai264003,China）
2（University ofChinese Academy ofSciences,Beijing 100049,China）

Nitroxyl（HNO）,the one-electron reduced and protonated congener of nitric oxide（NO）,has been demonstrated with excellent bio-pharmacological effects in cardiovascular disorder treatment,which is distinctive from that of NO.The high reactivity of HNO challenges the accurate detection.To resolve this problem,a near-infrared（NIR）metal-free fluorescent probe,ER-JN,was developed for the detection of intracellular HNO concentration in simulated physiological conditions and living cells.The probewas consisted of two moieties,the A BF2-chelated tetraarylazadipyrromethane fluorophore（aza-BODIPY）and the HNO recognition unit,diphenylphosphinobenzoyl group.The probewas purified by column chromatography on silica eluting with CH2Cl2to give the product as a green solid with a yield of 28％.Our probe exhibited highsensitivity,good selectivity,and low cytotoxic effect,and could be applied to the fluorescent bio-imaging of HNO in simulated physiological conditions.When detected HNO,quantum yield increased from 0.01 to 0.35.The linear range located at 0-50μmol/L.The detection limit was 0.03μmol/L（S/N=3）.With confocal laser scanning microscope imaging analysis,the probe could detect HNO concentration changes in living cells.Furthermore,the results of flow cytometry confirmed that our probe could be employed for the qualitative and quantitative detection of intracellular HNO concentration level.In this work,we found that probe ER-JN could not only detect HNO in aqueous and in living cells,but also targets endoplasmic reticulum.We anticipated that ER-JN would provide experimental bases in studying physiological and pathological functions of HNO in cells,in vitro and in vivo.

Fluorescent probe；Nitroxyl；Cell analysis；Near-infrared bioimaging

10.11895/j.issn.0253-3820.150445

2015-05-28收稿；2015-08-21接受
本文系國家自然科學基金資助項目（Nos.21405172,21575159,21275158）和中國科學院青年創(chuàng)新促進會（Grant2015170）

E-mail：fbyu@yic.ac.cn,lxchen@yic.ac.cn