宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中LMX1A和PAX1基因甲基化的定量分析

陳蔚，楊慧娟，徐軍，朱昊平

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.復旦大學附屬閔行醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201199；

3.上海市計劃生育科學研究所，上海 200032

宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌中LMX1A和PAX1基因甲基化的定量分析

陳蔚1，楊慧娟1，徐軍2，朱昊平3

1.復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032；

2.復旦大學附屬閔行醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201199；

3.上海市計劃生育科學研究所，上海 200032

背景與目的：DNA甲基化是宮頸上皮癌變過程中常見的表觀遺傳改變。本研究旨在檢測同源盒轉(zhuǎn)錄因子1ɑ(LMX1A)基因和配對盒基因家族PAX1基因在浸潤性宮頸鱗癌(invasive cervical cancers，ICC)組織中的甲基化水平，評估其作為分子標志物用于區(qū)分各級別宮頸病變的潛在臨床價值。方法：在32例低級別宮頸上皮內(nèi)瘤變(low-grade cervical intraepithelial neoplasia，LG-CIN)、34例高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變(high-grade cervical intraepithelial neoplasia，HG-CIN)、27例ICC病變宮頸組織和28例慢性宮頸炎為正常對照組(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NLM)中，采用巢式PCR和焦硫酸測序(pyrosequencing)技術定量分析LMX1A基因的6個位點和PAX1基因的9個位點的甲基化。并通過受試者工作特征曲線下面積(receiver operating characteristic curve，ROC)的計算獲得上述基因的甲基化檢測用于診斷各級別宮頸病變的準確性。結(jié)果：宮頸癌中的LMX1A基因6個位點的甲基化平均水平為14.36%，明顯高于HG-CIN病變的4.70%、LG-CIN病變的5.05%和NLM的4.53% (P<0.01)。宮頸癌中PAX1基因9個位點的甲基化平均水平為41.97%，明顯高于HG-CIN的10.21%(P<0.01)；而后者又明顯高于LG-CIN的5.55%和NLM的4.92%(P<0.01)。檢測LMX1A基因甲基化和PAX1基因甲基化水平鑒別宮頸癌的ROC曲線下面積分別為0.603(P=0.104)和0.883(P<0.001)。經(jīng)ROC曲線下面積計算獲得最佳PAX1基因甲基化水平的界定值為20.50%，其診斷浸潤性宮頸癌的靈敏度為81%、特異度為93%。當PAX1基因甲基化水平界定值為9.58%時，其檢測浸潤性宮頸癌的靈敏度為89%、特異度為84%。結(jié)論：定量分析宮頸組織中的PAX1基因甲基化將有可能作為分子標志物用于浸潤癌的鑒別診斷，而LMX1A基因的甲基化檢測臨床價值有限。

宮頸癌；宮頸上皮內(nèi)瘤變；DNA甲基化；LMX1A基因；PAX1基因

最近的全球流行病學資料表明，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率分別居于女性惡性腫瘤的第3位和第4位［1］。在我國，最新的一項全國流行病學研究提示，如果缺少有效的干預手段，全國各地每年宮頸癌的新發(fā)病率將由2010年的27 000～130 000上升至2050年的42 000～187 000［2］。

高危型人類乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，HR-HPV) (HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56及58等)的持續(xù)性感染是宮頸癌的病因［3-4］。但宮頸上皮的癌變過程還包括許多基因和表觀基因的改變。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳改變，常發(fā)生于腫瘤抑制基因的啟動子區(qū)域，造成該基因的轉(zhuǎn)錄失活，從而促使腫瘤的發(fā)生。綜合文獻報道［5］，70%～100%的宮頸癌中可檢測到DNA甲基化，且可見于30%～80%的宮頸癌前期病變中。已有研究表明，檢測宮頸脫落細胞中特定基因的甲基化可能作為潛在的分子標志物用于宮頸癌的早期檢測。我們以往采用甲基化特異PCR(methylation specific PCR，MSP)的方法發(fā)現(xiàn)CDH1、p16、SOX1、RASSFA1基因在宮頸癌前期病變和浸潤性宮頸癌中的甲基化狀態(tài)存在差異［6-10］。

LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1ɑ(LMX1A)基因是LIM同源盒基因家族的一員，該基因家族編碼LIM同源盒位點蛋白(LIM-homeodomain，LIM-HD)，在人類胚胎干細胞分化為中腦多巴胺神經(jīng)元的過程中起重要作用［11］。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其表達失活和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關［12］。在宮頸癌中，該基因的失活已被證實和基因甲基化有關［13］。PAX1基因是配對盒基因轉(zhuǎn)錄因子家族成員(paired box，PAX)參與生骨節(jié)的分化，和同源盒基因協(xié)同作用在哺乳動物脊柱和胚胎以及細胞增殖控制過程中發(fā)揮重要作用［14］。Lai等［13］研究發(fā)現(xiàn)，該基因在宮頸癌中因啟動子甲基化而表達失活，經(jīng)去甲基化處理后基因重新表達。PAX1基因甲基化?？梢娪趯m頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)Ⅲ級及浸潤性宮頸癌患者的宮頸脫落細胞中［15］。

本研究聯(lián)合巢式PCR技術和焦磷酸測序技術定量(pyrosequencing)分析正常宮頸、宮頸低級別病變，宮頸高級別病變以及宮頸鱗癌組織中PAX1和LMX1A基因的甲基化水平，以期探討PAX1和LMX1A基因的甲基化水平檢測在區(qū)分各級別宮頸病變中的潛在臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2011年1月—2013年4月在復旦大學附屬閔行醫(yī)院因?qū)m頸脫落細胞異常在宮頸?？平邮荜幍犁R下宮頸活檢的患者共121例，經(jīng)組織病理證實為宮頸低級別上皮內(nèi)瘤變(low-grade cervical intraepithelial neoplasia，LG-CIN)患者共32例、高級別上皮內(nèi)瘤變(high-grade cervical intraepithelial neoplasia，HG-CIN)患者共34例、浸潤性宮頸鱗癌(invasive cervical cancers，ICC)患者共27例，另有28例慢性宮頸炎患者作為正常對照(negative for intraepithelial lesion or malignancy，NLM)。所有患者平均年齡39歲(22～73歲)，活檢前均未接受化療、放療等治療并排除妊娠。所有患者同時接受HC-2的方法進行HPV DNA檢測。

1.2 方法

1.2.1 標本采集和保存

陰道鏡下在活檢獲得組織病理同時，于宮頸病變部位活檢獲取組織一塊，并置于-40 ℃冰箱保存。

1.2.2 DNA提取、化學修飾及基因擴增

參照德國Qiagen公司試劑盒QIAamp DNA Mini Kit的說明進行DNA提取，參照Qiagen公司 EpiTect Bisulfite Kit的說明對DNA進行亞硫酸氫鹽處理。LMX1A和PAX1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域的擴增采用巢式PCR。LMX1A基因擴增片段的外側(cè)上游引物為：5’-TTTTTGAAAGTT GATTTGAAATG-3’；外側(cè)下游引物為：5’-ACCCTCACCTACCCCAAATC-3’。PAX1基因擴增片段的外側(cè)上游引物為：5’-AAGTTTATTTTGGGTTTGGGGT-3’；外側(cè)下游引物為：5’-ACCCACCTCATCA ACCCTCCC-3’。用PyroMark Assay Design 2.0軟件進行內(nèi)側(cè)引物設計，LMX1A基因所用上游引物：5’-TTGAAATGTATTTAAGAGTGAG-3’；下游引物R1：5’-AAAAAAACACTATAAAAAAC CC-3’。PAX1基因上游引物：5’-GTGGAGAG T G T T T T G G G A G G G-3’，下游引物：5’-AAATAACCRAAACTAAACCC-3’。對下游引物5’端進行生物素標記。

1.2.3 焦磷酸測序

按照PyroMark Q96 ID焦磷酸測序儀中甲基化分析要求進行測序。首先制備單鏈 DNA模板。然后進行焦磷酸測序反應。LMX1A基因所用測序引物為：5’-GGTTTTTGYGYGTATTTTA ATAGAG-3’，可測得6個CpG島；PAX1基因所用測序引物為：5’-G G Y G G T A G G T T T T G G A G-3’，可測得9個CpG島。在獲得測序結(jié)果后，以每個基因所有檢測位點的甲基化率的平均值來表示每份標本的該基因甲基化水平。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。不同病變中LMX1A和PAX1基因的甲基化水平采用±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，2組間比較采用t檢驗。采用受試者工作特征曲線下面積(receiver operating characteristic curve，ROC)獲得上述基因的甲基化定量分析用于診斷各級別宮頸病變的閾值及準確性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組患者臨床資料的比較

121例患者按照組織病理被分為NLM組、LG-CIN組、HG-CIN組及ICC組。4組患者的平均年齡分別為36.2、38.3、39.7和44.4歲。ICC組患者的年齡明顯高于其它3組患者(P<0.01)。經(jīng)HC-2檢測，4組患者高危型HPV的檢測率分別為35.70%、81.20%、91.20%和92.60%(P<0.01)。

2.2宮頸組織LMX1A和PAX1基因甲基化的定量分析

經(jīng)焦硫酸測序技術，分別針對LMX1A基因的6個位點和PAX1基因的9個位點進行甲基化定量分析。用試劑盒提供的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的通用DNA作為內(nèi)對照，以檢測標本中該位點的甲基化水平與內(nèi)對照中該位點的甲基化水平的比值表示每一位點的甲基化率。某一標本中該基因所有位點的甲基化率的平均值定義為該標本中這一基因的甲基化水平。圖1顯示了1例低級別病變患者中PAX1基因9個位點的甲基化水平。

2.3 各組患者病變組織中LMX1A和PAX1基因甲基化水平的定量分析

表1比較了LMX1A基因和PAX1基因在4組患者中的甲基化水平。宮頸癌組的LMX1A基因甲基化平均水平為14.36%，HG-CIN組為4.70%，LG-CIN組為5.05%，NLM組為4.53%。對4組資料進行單因素方差分析，4組間差異有統(tǒng)計學意義(F=7.36，P<0.001)。4組之間兩兩比較，宮頸癌組與其它3組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而 NLM組、LG-CIN組和HG-CIN組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。PAX1基因的甲基化水平依次分別為41.97%、10.21%、5.55%和4.92%。對4組資料進行單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)4組差異有統(tǒng)計意義(F=46.43， P<0.001)。4組之間兩兩相互比較，除NLM組和LG-CIN組之間差異無統(tǒng)計學意義外(P>0.05)，其它各組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 采用焦磷酸測序技術定量分析1例低級別上皮內(nèi)瘤變中PAX1基因的甲基化Fig. 1 Detection of PAX1 gene methylation using the technique of pyrosequencing in a sample of LG-CIN

表1 不同宮頸病變組織中LMX1A和PAX1基因甲基化水平的比較Tab. 1 Comparison of LMX1A and PAX1 gene methylation in different cervical lesions

2.4LMX1A基因和PAX1基因甲基化水平診斷宮頸鱗癌的準確性分析

采用對宮頸組織中LMXA1基因甲基化水平的定量分析診斷宮頸鱗癌(宮頸鱗癌組及其它各組)的ROC曲線下面積(AUC)為0.603，靈敏度與特異度之和的最大值所對應的界定值為10.66% (靈敏度為37%，特異度為95%)，但與機會參考線下面積差異無統(tǒng)計學意義(P=0.104)。

采用對宮頸組織中PAX1基因甲基化水平的定量分析診斷宮頸鱗癌(宮頸鱗癌組及其它各組)的ROC曲線下面積(AUC)為0.883，顯著大于機會參考線下面積(P<0.01)。靈敏度與特異度之和的最大值所對應的界定值為20.55%(靈敏度為81%，特異度為93%)?？紤]臨床惡性腫瘤篩查對于高靈敏度的要求，調(diào)整甲基化定量的實際界定值為9.58%時，PAX1基因甲基化的定量分析診斷宮頸鱗癌的靈敏度為89%，特異度為84%(圖2)。

圖2 PAX1基因甲基化水平的定量分析在診斷宮頸癌中的ROC曲線Fig. 2 The ROC curve for the diagnosis of invasive cervical cancer by the quantification of PAX1 gene methylation

3 討 論

MSP是經(jīng)典的檢測基因甲基化的技術，該方法雖然簡便有效，但結(jié)果判斷需采用凝膠電泳，因此，如運用于人群篩查，需要投入大量的人力物力。且該方法只能做出甲基化和未甲基化的判斷，無法對甲基化水平進行定量分析。焦硫酸測序技術在同一反應體系中經(jīng)4種酶的協(xié)同作用，通過檢測釋放熒光的強度進行DNA的測序， 其優(yōu)點在于高通量、快速、定量且結(jié)果直觀［16］。該技術越來越多地被運用于基因甲基化的檢測，并能對特定位點進行定量分析。

LMXIA是一種細胞發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，被認為是抑癌基因。LMX1A基因的甲基化可在腫瘤細胞株(HCT-116)檢測到，而在DKO細胞株中去甲基化，這種去甲基化常受DNMT1和DNMT3b阻斷［17］。在宮頸癌的形成過程中，LMX1A的蛋白表達從正常宮頸上皮到LG-CIN再到HG-CIN中的表達是上升的，但在發(fā)展為ICC和出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移后表達明顯下降［18］。啟動子的甲基化是該基因表達失活的重要機制［13］。Lai等［13］采用MSP和亞硫酸測序技術發(fā)現(xiàn)89.9%的宮頸鱗狀細胞癌組織存在LMX1A基因的高甲基化，明顯高于正常組織。其后又采用實時定量甲基化特異PCR的方法發(fā)現(xiàn)ICC中該基因的甲基化比率(percentage of methylation ratio，PMR)明顯高于原位癌、CINⅢ、CINⅡ及CINⅠ病變［19］。本研究采用焦硫酸測序的方法進一步證實了LMX1A基因的甲基化出現(xiàn)在宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化并形成浸潤的階段，而在癌前期病變中較少見。因此，宮頸組織中該基因的甲基化檢測可能在浸潤癌和癌前期病變的鑒別中有價值。為了評估其臨床運用價值，經(jīng)ROC曲線下面積的計算其區(qū)分浸潤癌和癌前期病變的最佳閾值定為10.66%，該閾值下的特異度為95%，但靈敏度較低，為37%， 因此，有必要聯(lián)合其它基因檢測以提高檢測的準確性。

配對盒基因轉(zhuǎn)錄因子家族成員PAX1基因的表達失活見于宮頸癌中，并被認為和啟動子的甲基化相關［13］。且PAX1基因甲基化可在宮頸癌患者的脫落細胞中被檢測到［15］。在單中心研究中，Huang等［20］發(fā)現(xiàn)和HC-2的高危型HPV病毒檢測相比，檢測PAX1基因的甲基化指數(shù)在浸潤性癌的鑒別中更為特異(84.7% vs 52.5%)，而在篩查CINⅢ以上病變中的特異度亦明顯升高(93.3% vs 60.0%)。最近，臺灣地區(qū)的一項包括11個中心的研究發(fā)現(xiàn)，采用多重定量PCR技術檢測PAX1的甲基化指數(shù)篩查CINⅢ及以上病變的靈敏度和特異度分別為64%和91%［21］。Kan等［15］發(fā)現(xiàn)聯(lián)合PAX1甲基化檢測能夠明顯提高脫落細胞檢測的準確性，并能使不必要的陰道鏡檢查和活檢下降60%。以往我們采用MSP的方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PAX1基因的異常甲基化見于87.5%的子宮頸癌組織中，13.3%的 CINⅠ、46.7%的CINⅡ～Ⅲ病變中，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)［7］。本研究進一步采用更為敏感而特異的定量分析方法。結(jié)果證實分析PAX1基因甲基化水平能有效鑒別ICC，ROC曲線下面積達0.883(P<0.001)。且在最佳閾值下，分析PAX1基因甲基化水平檢測ICC的靈敏度達81%，優(yōu)于傳統(tǒng)的宮頸脫落細胞形態(tài)學檢測。為了進一步提高臨床檢測的靈敏度，當PAX1基因甲基化水平界定值為9.58%時，其檢測ICC的靈敏度為89%、但特異度下降至84%。進一步的研究將探討PAX1基因甲基化水平檢測聯(lián)合傳統(tǒng)宮頸脫落細胞學的檢測效率。

綜上所述，本研究結(jié)果表明LMX1A基因的甲基化定量分析的臨床價值有限， 但定量分析宮頸組織中的PAX1基因的甲基化將有可能作為分子標志物用于ICC的鑒別中。

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Quantitative analysis of LMX1A and PAX1 gene methylation in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia

CHEN Wei1, YANG Huijuan1, XU Jun2, ZHU Haoping3(1.Department of Gynecologic Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, Minhang Hospital, Fudan University, Shanghai 201199, China; 3.Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China)

XU Jun E-mail: xujun1958@hotmail.com

Background and purpose:DNA methylation is a common epigenetic alteration in cervical carcinogenesis. The aim of this study was to measure the levels of LMX1A and PAX1 gene methylation in cervical cancer and precursors and to identify their potential in clinical application.Methods:Cervical specimens were collected from 121 female patients including 27 cases with invasive cervical cancers (ICC), 34 cases with high-grade cervical intraepithelial neoplasia (HG-CIN), 32 cases with low-grade cervical intraepithelial neoplasia (LG-CIN) and 28 cases with chronic cervicitis as normal controls (NLM). DNA methylations of the LMX1A and PAX1 gene were quantified using the techniques of nest PCR and pyrosequencing. The mean methylation values of the 6 gene loci on the LMX1A gene and the 9 gene loci on the PAX1 gene were respectively calculated for a given sample. Receiver operating characteristic (ROC) curve was used to evaluatethe accuracy of gene methylation analysis to discriminate the cervical diseases.Results:The mean methylation value of the LMX1A gene in ICC was 14.36%, which was significantly higher than those in HG-CIN (4.70%), LG-CIN (5.05%) and NLM (4.53%) (P<0.01). The mean methylation value of the PAX1 gene in ICC was 41.97%, which was significantly higher than those in HG-CIN (10.21%), LG-CIN (5.55%) and NLM (4.92%) (P<0.01). The area under the ROC curve (AUC) was 0.603 for LMX1A gene methylation, and was 0.883 for PAX1 gene methylation, to discriminate ICC from HG-CIN, LGCIN, and NLM (P=0.104 and <0.001, respectively). The optimal cut-off value for PAX1 gene methylation was set at 20.50% with the sensitivity of 81% and with the specificity of 93%. If the cut-off value was set at 9.58%, the sensitivity and the specificity of PAX1 gene methylation were 89% and 84% respectively.Conclusion:Quantitative analysis of the PAX1 gene methylation in cervical tissue might be helpful to differentiate invasive cancers from precursors, while the clinical application of the LMX1A gene methylation was limited.

Cervical cancer; Cervical intraepithelial neoplasia; DNA methylation; LMX1A gene; PAX1 gene

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.01.004

R737.33

A

1007-3639(2015)01-0019-06

2014-10-09

2014-11-20）

上海市衛(wèi)生局科研課題計劃(20114152)。

徐軍 E-mail:xujun1958@hotmail.com