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      藍(lán)莓葉總黃酮的體外抗炎功效評(píng)價(jià)

      2015-01-03 01:15:06鄭洪艷王昌濤
      食品科學(xué) 2015年17期
      關(guān)鍵詞:葉總藍(lán)莓抗炎

      趙 丹,蘇 寧,楊 麗,鄭洪艷,霍 彤,王昌濤,*

      藍(lán)莓葉總黃酮的體外抗炎功效評(píng)價(jià)

      趙 丹1,蘇 寧2,楊 麗2,鄭洪艷2,霍 彤1,王昌濤1,*

      (1.北京工商大學(xué)理學(xué)院,北京 100048;2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院,北京 100176)

      目的:通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)方法從分子水平對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮的抗炎功效進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法:建立人永生化表皮細(xì)胞HaCaT與藍(lán)莓葉總黃酮的共培養(yǎng)體系,利用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)在不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)(0、15、30、60、120 min)白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(interferon-inducible prot ein-10,IP-10)等炎癥細(xì)胞因子相關(guān)基因表達(dá)情況,觀察藍(lán)莓葉總黃酮的添加對(duì)這些基因表達(dá)的影響,并探討藍(lán)莓葉總黃酮在分子水平上的抗炎機(jī)理。結(jié)果:藍(lán)莓葉總黃酮的添加能夠提高抗炎因子IL-6、CXCR-2基因的表達(dá)量(P<0.05),降低促炎因子IL-8、IP-10基因的表達(dá)量(P<0.05),對(duì)CXCR-1基因的表達(dá)呈復(fù)雜型調(diào)節(jié)。結(jié)論:藍(lán)莓葉總黃酮通過(guò)對(duì)炎癥相關(guān)因子表達(dá)量產(chǎn)生影響,從而減弱促炎癥反應(yīng),增強(qiáng)抗炎癥反應(yīng),最終發(fā)揮抗炎功效。

      藍(lán)莓葉總黃酮;炎癥因子;反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);抗炎

      由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所存在的倫理問(wèn)題以及國(guó)際上對(duì)動(dòng)物福利的日益關(guān)注,發(fā)展新的體外實(shí)驗(yàn)方法用以減少、優(yōu)化和替代(reduction, refinement, replacement,3R理論)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技術(shù)因其具有特異性強(qiáng)、靈敏度高以及重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì),在動(dòng)物替代實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域發(fā)揮了日益重要的作用。此技術(shù)不僅避免了PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)生的假陽(yáng)性結(jié)果和非特異性擴(kuò)增問(wèn)題,同時(shí)還能夠?qū)?biāo)本模板進(jìn)行精確定量[1-2]。

      皮膚在受到外界藥物刺激后會(huì)發(fā)生炎癥反應(yīng)。 在這個(gè)過(guò)程中,白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-8、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(interferon-inducible protein-10,IP-10)等炎癥因子和趨化因子的相關(guān)基因表達(dá)會(huì)受到影響。IL-6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞增殖、分化并提高其功能活性;IL-8是巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子,與其受體CXCR-1和CXCR-2結(jié)合而對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞趨化作用,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[3-5]。

      本實(shí)驗(yàn)利用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),檢測(cè)在人類永生化表皮細(xì)胞HaCaT培養(yǎng)體系中藍(lán)莓葉總黃酮的添加對(duì)這些細(xì)胞因子表達(dá)量的影響,從而進(jìn)一步對(duì)這些細(xì)胞因子的表達(dá)與皮膚炎癥反應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行研究。

      1 材料與方法

      1.1材料與試劑

      HaCaT細(xì)胞,購(gòu)自上海斯信生物科技有限公司。

      DMEM低糖培養(yǎng)基、二甲基亞砜 德國(guó)Sigma公司;胎牛血清 美國(guó)Gibco公司;青霉素-鏈霉素雙抗(100×) 美國(guó)Corning公司。

      1.2儀器與設(shè)備

      WJ-80A-ⅡCO2培養(yǎng)箱 上海圣科儀器設(shè)備有限公司;ABI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、GeneAmp PCR System 9700美國(guó)ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;Enduro水平電泳儀 美國(guó)Labnet公司;3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、1-14微型離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司;SW-CJ-1D超凈工作臺(tái) 上海啟前電子科技有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)瓶板、細(xì)胞凍存管 美國(guó)Corning/Costar公司。1.3方法

      1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理

      從-80℃冰箱中取出待用凍存的HaCaT細(xì)胞,迅速置于37℃水浴中解凍,在1~2 min內(nèi)輕微振動(dòng)使其融化。1 000 r/min離心10 min,棄去上清液,在沉淀中加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí),用2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)輕柔清洗兩次,加入200μL0.25%胰酶后放入CO2培養(yǎng)箱中消化5 min,放到顯微鏡下觀察,當(dāng)確認(rèn)細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落后,加入2 mL DMEM完全培養(yǎng)液終止消化,800 r/min離心10 min,棄去上清液,加入4 mL培養(yǎng)液,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后,以5×105個(gè)/cm2的密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中。

      將消化后的HaCaT細(xì)胞以2×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi),以60μg/mL質(zhì)量濃度藍(lán)莓葉總黃酮處理細(xì)胞0、15、30、60、120 min。

      1.3.2細(xì)胞總RNA提取與檢測(cè)

      待細(xì)胞密度長(zhǎng)至80%時(shí),冰浴條件下,依次加入1 mL Trizol、0.2 mL氯仿,手搖振蕩2 min;4℃、8 000 r/min離心15 min,取上層水相,加入等體積異丙醇(約700μL),振蕩,靜置15 min;12 000 r/min離心10 min,棄去上清液,向沉淀中加入1 mL 70%乙醇洗滌,8 000 r/min離心10 min;重復(fù)進(jìn)行1次乙醇洗滌;室溫條件下干燥15 min,加入40μL經(jīng)焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)處理的ddH2O,溶解10 min后于-80℃保存[6-7]。

      瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA:將樣品和Marker加至凝膠上樣孔,180 V電壓電泳10 min。

      1.3.3 cDNA第一鏈合成

      使用TINAGEN FastQuantRTKit(含gDNase)FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)進(jìn)行cDNA第一條鏈合成反應(yīng)。

      1.3.4反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

      1.3.4.1引物設(shè)計(jì)

      根據(jù)NCBI中發(fā)布的IL-6、IL-8、IP-10等基因的序列,通過(guò)Primer Express軟件設(shè)計(jì)特異性引物,同時(shí)設(shè)計(jì)管家基因β-actin的特異性引物,各基因的引物序列見(jiàn)表1。

      表1 qRT-PCR引物序列Table1 Primer sequences for qRT-PCR

      1.3.4.2 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

      以cDNA為模板,按照表2配制RT-qPCR反應(yīng)體系(使用前,在1 mL PrimeScriptRTEnzyme MIX中加入40μL的ROX Reference Dye),用ddH2O將反應(yīng)體系補(bǔ)足到20μL,分析IL-6、IL-8、IP-10等基因的表達(dá)量。

      表2 反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系Table2 Real time fluorescence quantitative reverse transcription PCRTable2 Real time f reaction system stem

      2 結(jié)果與分析

      2.1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)

      圖1為HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)貼壁前后形態(tài)比較,貼壁前HaCaT細(xì)胞為規(guī)則的圓球體狀,透明飽滿,且可隨培養(yǎng)液流動(dòng)。當(dāng)培養(yǎng)2~4 h以后,HaCaT細(xì)胞開始呈現(xiàn)出片層狀態(tài)貼壁生長(zhǎng),單個(gè)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,其形態(tài)會(huì)因其所處培養(yǎng)空間大小的具體情況不同而變化;另一方面,隨著培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和HaCaT細(xì)胞自身生長(zhǎng)過(guò)程中代謝物的產(chǎn)生,培養(yǎng)液的顏色(隨pH值變化)和細(xì)胞中內(nèi)容物的顏色也與貼壁前的HaCaT細(xì)胞有了顯著的差別。這就決定了一定時(shí)間內(nèi)需要根據(jù)培養(yǎng)瓶或者培養(yǎng)板中HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)的具體情況,而定期換新鮮培養(yǎng)液或者進(jìn)行傳代培養(yǎng),才能保證HaCaT細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。

      圖1 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)貼壁前(a)后(b)的形態(tài)(20×)Fig.1 HaCaT cells before (a) and after (b) attached culture (20 ×)

      HaCaT細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的要求相對(duì)其他動(dòng)物細(xì)胞較為寬泛。HaCaT細(xì)胞增殖速率快,培養(yǎng)2~4 h即可貼壁,36 h左右需要進(jìn)行傳代。細(xì)胞快速地增殖會(huì)引起培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在短時(shí)間內(nèi)被大量消耗,限制了細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)。因此,在考察藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞的影響時(shí),培養(yǎng)時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)中選取培養(yǎng)時(shí)間分別為0、15、30、60、90、120 min,在以上6個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)添加藍(lán)莓葉總黃酮的HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行考察。

      2.2 HaCaT細(xì)胞總RNA的提取

      圖2 HaCaT細(xì)胞總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of total RNA from HaCaT cells

      采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的HaCaT細(xì)胞RNA進(jìn)行完整性檢測(cè)。如圖2所示,28S rRNA與18S rRNA帶型清晰。另經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定,所提取HaCaT細(xì)胞RNA的A260nm/A280nm介于1.8~2.0之間,RNA質(zhì)量高,完整性好,適于反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究[8]。

      嚴(yán)格來(lái)說(shuō),以拉斐爾前派畫家之名而為人所熟知的羅塞蒂的拉斐爾前派創(chuàng)作期,至此已經(jīng)結(jié)束了。人們應(yīng)該看到,在拉斐爾前派那原本就模糊不清的理想幻滅之后,羅塞蒂繪畫中的逃亡意識(shí)開始明確:他在相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間里都使用古老的水彩作畫,并專注于但丁與比阿特麗絲等中世紀(jì)題材。

      2.3 RT-qPCR炎癥因子特異性引物的檢測(cè)

      利用設(shè)計(jì)的β-actin、IL-6和IL-8的引物對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如圖3所示。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,通過(guò)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增,得到的產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn),得到條帶單一的、片段大小與預(yù)期目的條帶大小一致的特異性引物,可進(jìn)行下一步RT-qPCR的實(shí)驗(yàn)。

      圖3 炎癥因子IL-6、IL-8特異性引物檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of PCR amplified products with specific primers for β-actin, IL-6 and IL-8

      2.4 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      以HaCaT細(xì)胞為研究對(duì)象,考慮到其炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)量變化的時(shí)間大多在2 h以內(nèi)[9],并且綜合HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)情況,本實(shí)驗(yàn)選擇2 h以內(nèi)作為藍(lán)莓葉總黃酮處理HaCaT細(xì)胞的考察時(shí)間。

      2.4.1藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞炎癥因子類基因表達(dá)的影響

      2.4.1.1藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-6表達(dá)的影響

      圖4 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞IL--66表達(dá)量的影響Fig.4 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on IL-6 expression

      2.4.1.2藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-8表達(dá)的影響

      圖5 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞IL--88表達(dá)量的影響Fig.5 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on IL-8 expression

      藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-8表達(dá)量的影響如圖5所示,培養(yǎng)時(shí)間在15 min內(nèi),HaCaT細(xì)胞IL-8表達(dá)量迅速下降,并在30 min內(nèi)保持緩慢下降的趨勢(shì),在30~90 min內(nèi)又緩慢上升,但遠(yuǎn)小于空白組,而在90~120 min的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi),IL-8表達(dá)量又有下降趨勢(shì)。整體來(lái)看,藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)IL-8基因表達(dá)的影響主要體現(xiàn)在培養(yǎng)0~15 min內(nèi)迅速抑制其表達(dá),并在120 min的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)總體保持抑制其表達(dá)的作用。對(duì)不同時(shí)間段IL-8表達(dá)量進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與空白組相比,培養(yǎng)至15、30 min時(shí),HaCaT細(xì)胞IL-8表達(dá)量極顯著降低(P<0.01),而培養(yǎng)至60~120 min時(shí),IL-8表達(dá)量稍有回升,但仍顯著低于空白組(P<0.05),這表明藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-8的表達(dá)具有抑制作用。IL-8在許多炎癥中具有聚集和激活T淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能,局部產(chǎn)生的IL-8可以直接作用于表皮細(xì)胞,促進(jìn)慢性炎癥的發(fā)展[11]。IL-8表達(dá)量的升高會(huì)使大量中性粒細(xì)胞向炎癥區(qū)域聚集,釋放炎癥介質(zhì)而加重炎癥反應(yīng)[12-13]。藍(lán)莓葉總黃酮抑制了IL-8的表達(dá),從而間接地抑制了炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

      2.4.2藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞趨化因子相關(guān)基因表達(dá)的影響

      2.4.2.1藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR-1和CXCR-2表達(dá)的影響

      CXCR-1和CXCR-2是CXCR家族中的兩個(gè)重要成員,屬G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員。CXCR-1和CXCR-2會(huì)表達(dá)在正常的人內(nèi)皮細(xì)胞表面,在急性炎癥反應(yīng)過(guò)程中,趨化因子能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞釋放大量促炎細(xì)胞因子[14]。

      圖6 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR--11表達(dá)量的影響Fig.6 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on CXCR-1 expression

      如圖6所示,添加藍(lán)莓葉總黃酮后,HaCaT細(xì)胞CXCR-1的表達(dá)量在培養(yǎng)15 min內(nèi)有明顯升高的趨勢(shì),隨后的培養(yǎng)過(guò)程中,CXCR-1的表達(dá)量被間隔性地促進(jìn)和抑制,但總體水平都是高于空白組。對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間段HaCaT細(xì)胞CXCR-1表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)與空白組相比,在培養(yǎng)的120 min內(nèi),HaCaT細(xì)胞CXCR-1表達(dá)量的變化均不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明,藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR-1的表達(dá)有一定促進(jìn)作用,但在促進(jìn)和抑制間存在一定的動(dòng)態(tài)平衡。

      圖7 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR--22表達(dá)量的影響Fig.7 Influence of treatment time with blueberry leaf extracts on CXCR-2 expression

      如圖7所示,添加藍(lán)莓葉總黃酮后,HaCaT細(xì)胞CXCR-2的表達(dá)量在培養(yǎng)15 min內(nèi)有平緩的升高,在隨后培養(yǎng)的15~90 min內(nèi),保持在較高的水平,而在培養(yǎng)的90~120 min內(nèi),CXCR-2的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明,藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞CXCR-2的表達(dá)是起促進(jìn)作用的。

      2.4.2.2藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)的影響

      圖8 藍(lán)莓葉總黃酮處理不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)量的影響Fig.8 Influence of treatment time by blueberry leaf extracts on IP-10 expression

      如圖8所示,添加藍(lán)莓葉總黃酮后,HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)量在培養(yǎng)15 min內(nèi)迅速下降,并且在90 min的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)保持在一個(gè)相當(dāng)?shù)偷乃健km然在培養(yǎng)至90~120 min內(nèi),HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)量有一定的升高,但是與空白組相比仍是受到抑制的。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn),與空白組相比,培養(yǎng)至15、30 min時(shí),HaCaT細(xì)胞IP-10表達(dá)量顯著降低(P<0.05),而培養(yǎng)至60、90 min時(shí),IP-10表達(dá)量極顯著降低(P<0.01),到培養(yǎng)120 min時(shí),IP-10表達(dá)量稍有回升,但仍顯著低于空白組(P<0.05)。以上結(jié)果表明,藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)IP-10基因的表達(dá)具有抑制作用。

      3 結(jié) 論

      炎癥因子(IL-6、IL-8)和趨化因子(CXCR-1和CXCR-2、IP-10)是反映炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo),在機(jī)體抗感染、抑病毒過(guò)程中起重要作用[15-16]。本實(shí)驗(yàn)將藍(lán)莓葉總黃酮與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)特定時(shí)間后,利用RT-qPCR檢測(cè)相關(guān)炎癥因子和趨化因子的表達(dá)情況。結(jié)果表明,藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)IL-6和CXCR-2基因的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)的作用,二者的表達(dá)量顯著增加。其中,IL-6通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)花生四烯酸的代謝而起到抗炎作用,CXCR-2通過(guò)與配體IL-8結(jié)合,啟動(dòng)中性粒細(xì)胞趨化反應(yīng),募集中性粒細(xì)胞,引起炎癥反應(yīng),對(duì)入侵的病原體發(fā)揮吞噬殺傷和清除作用。IL-8和IP-10基因的表達(dá)受到了明顯抑制,表達(dá)量大幅度降低,進(jìn)而抑制了炎癥的發(fā)生和發(fā)展。IP-10及其受體CXCR-3具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞能力,可促進(jìn)多種細(xì)胞因子的分泌,作為趨化因子介導(dǎo)Thl型炎癥反應(yīng)[17-18],藍(lán)莓葉總黃酮的添加抑制了HaCaT細(xì)胞中IP-10的表達(dá),從而降低了炎癥反應(yīng)發(fā)生的概率。而藍(lán)莓葉總黃酮對(duì)趨化因子CXCR-1的表達(dá)則呈現(xiàn)出復(fù)雜型調(diào)節(jié)的作用,表現(xiàn)為間歇性地促進(jìn)和抑制,因此,藍(lán)莓葉總黃酮具體的抗炎作用效果還有待研究。

      綜合來(lái)看,在炎癥反應(yīng)中有諸多的炎癥因子和趨化因子參與到其中,這些因子之間相互作用,聯(lián)系緊密,網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)復(fù)雜多樣,所以其表達(dá)量的變化必然會(huì)相互影響[19-21]。整體來(lái)看,藍(lán)莓葉總黃酮的添加會(huì)促進(jìn)抗炎因子的表達(dá),抑制促炎因子的表達(dá),從而發(fā)揮其抗炎作用。但是藍(lán)莓葉總黃酮的具體抗炎機(jī)理到目前為止還不是很清楚,有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)利用RT-qPCR法對(duì)藍(lán)莓葉總黃酮的抗炎功效進(jìn)行了初步評(píng)價(jià),為保健品或藥食同源物質(zhì)的體外抗炎評(píng)價(jià)提供了新思路。

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      In vitro Anti-inflammatory Effect of Total Flavonoids from Blueberry Leaves

      ZHAO Dan1, SU Ning2, YANG Li2, ZHENG Hongyan2, HUO Tong1, WANG Changtao1,*
      (1. School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China; 2. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China)

      Purpose∶ To evaluate thein vitroanti-inflammatory potential of total flavonoids from blueberry leaves. Methods∶a co-culture system of HaCaT cell and flavonoids were constructed. To examine the effect of flavonoids on the expression of inflammatory cytokines including interleukin 6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), and interferon induced protein 10 (IP-10), realtime reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression of the related genes after co-culture for different periods of time(0, 15, 30, 60, and 120 min). The anti-inflammatory mechanism of flavonoids from blueberry leaves was analyzed at the molecular level. Results∶ The total flavonoids from blueberry leaves significantly enhanced the expression of anti-inflammatory cytokines (IL-6andCXCR-2) (P< 0.05) and significantly inhibited the expression of pro-inflammatory cytokines (IL-8,IP-10) (P< 0.05) to achieve the anti-inflammatory activity. Chemotactic factor receptorCXCR-1was regulated complicatedly. Conclusions∶ The total flavonoids from blueberry leaves could decrease inflammation by regulating the function of several gene loci via several steps.

      total flavonoids from blueberry leaves; inflammatory cytokines; real-time reverse transcription PCR; anti-inflammatory

      R966

      1002-6630(2015)17-0231-05

      10.7506/spkx1002-6630-201517043

      2014-11-05

      國(guó)家質(zhì)檢總局質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310132;201410019)

      趙丹(1988—),女,助理實(shí)驗(yàn)師,碩士,研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)。E-mail:zhaodanustb@126.com

      *通信作者:王昌濤(1975—),男,教授,博士,研究方向?yàn)橹参锕πС煞珠_發(fā)應(yīng)用。E-mail:wangct@th.btbu.edu.cn

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