人肌球蛋白輕鏈9在前列腺癌的表達(dá)水平及其對(duì)生化復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

張?jiān)鰪?qiáng) 葉永康 黃亞強(qiáng) 吳永定 李牧 何慧嬋

臨床研究論著

人肌球蛋白輕鏈9在前列腺癌的表達(dá)水平及其對(duì)生化復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

張?jiān)鰪?qiáng) 葉永康 黃亞強(qiáng) 吳永定 李牧 何慧嬋

目的研究人肌球蛋白輕鏈9（MYL9）在前列腺癌中的表達(dá)水平及其對(duì)臨床生化復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)前列腺癌及癌旁良性前列腺組織MYL9的表達(dá)水平，再通過(guò)蛋白免疫印跡法驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，最后使用Taylor的數(shù)據(jù)對(duì)MYL9進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析不同年齡、血清PSA水平、Gleason評(píng)分、病理分期、轉(zhuǎn)移與否及生存與否的前列腺癌患者間MYL9水平的差異。結(jié)果蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示，MYL9在前列腺癌組織中的表達(dá)水平比癌旁良性前列腺組織下調(diào)5.67倍（P＜0.01）；蛋白免疫印跡法結(jié)果也顯示，前列腺癌組織中MYL9表達(dá)水平比癌旁良性前列腺組織明顯下調(diào)（0.23±0.08 vs.0.73±0.06，P＜0.001）；前列腺癌患者中，年齡＜66歲、Gleason評(píng)分＜8分、病理分期＜T3A、腫瘤無(wú)轉(zhuǎn)移、存活者的MYL9表達(dá)水平明顯高于年齡≥66歲、Gleason評(píng)分≥8分、病理分期≥T3A、腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移、死亡者（P均＜0.001），血清PSA水平是否＜4 μg／L對(duì)MYL9表達(dá)無(wú)影響（P＞0.05）。MYL9低表達(dá)組前列腺癌患者的無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率明顯低于MLY9高表達(dá)組（χ2＝11.575，P＜0.001）。結(jié)論MYL9在前列腺癌中比癌旁前列腺組織表達(dá)下調(diào)，且MYL9表達(dá)水平較低者的臨床預(yù)后較差。

前列腺癌；肌球蛋白輕鏈；蛋白質(zhì)組學(xué)；臨床預(yù)后

前列腺癌是男性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］。高?；颊吲c低?；颊咚枰邮艿闹委煼桨竿耆煌?］。但是，每年仍有20%被診斷為低危的患者因?yàn)楸Ｊ丿煼o(wú)效而致病情惡化甚至死亡［3］。所以，尋找新的前列腺腫瘤標(biāo)志物以提高患者病情的預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度并協(xié)助確定最佳治療方案已成當(dāng)務(wù)之急。癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜多變的過(guò)程，主要由細(xì)胞表面受體、腫瘤微環(huán)境和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的運(yùn)動(dòng)性之間的相互作用引導(dǎo)［4］。腫瘤細(xì)胞的可塑性使得其能夠高度適應(yīng)腫瘤微環(huán)境，逃避侵入性治療［5］。肌動(dòng)球蛋白的收縮性使腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生對(duì)抗所處微環(huán)境的運(yùn)動(dòng)力而發(fā)生遷移［6］。人肌球蛋白輕鏈（MYL9）屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白質(zhì)的一種，能輔助調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分裂和黏附等過(guò)程［7-8］。目前，用于界定前列腺癌高危和低危程度的重要指標(biāo)主要有腫瘤臨床分期、腫瘤病理分級(jí)、Gleason評(píng)分以及前列腺特異性抗原（PSA）。本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析前列腺癌與癌旁組織的MYL9蛋白表達(dá)差異，并探討MYL9在前列腺癌組織中表達(dá)下調(diào)對(duì)患者臨床預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

用于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)的4例新鮮前列腺癌組織及4例配對(duì)癌旁組織、用于蛋白免疫印跡法檢測(cè)的20對(duì)前列腺癌及癌旁前列腺組織均來(lái)源于2007年1月至2011年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)V州市第一人民醫(yī)院行根治性前列腺癌切除術(shù)的前列腺癌患者。本研究經(jīng)廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并征得所有入組患者的知情同意，所有標(biāo)本均根據(jù)倫理和法律標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行匿名處理和制作。

二、主要試劑

硝酸纖維素薄膜購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；ECL發(fā)光液體購(gòu)于美國(guó)ECL Thermo公司；單抗購(gòu)于北京博奧森公司；IgG抗體購(gòu)于武漢博士德公司。

三、方法

1.蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)

經(jīng)蘇木素-伊紅染色鑒定前列腺癌組織塊，利用顯微切割獲得較純凈的癌及癌旁組織，再進(jìn)行雙向熒光差異凝膠電泳及質(zhì)譜分析，比較MYL9在前列腺癌和癌旁組織的蛋白表達(dá)水平。

2.蛋白免疫印跡法

前列腺癌及癌旁組織經(jīng)蛋白裂解液裂解后離心取上清，用二喹啉甲酸（BCA）法對(duì)上清進(jìn)行蛋白定量后取適量蛋白樣品進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后孵一抗，反復(fù)洗膜后，加入二抗繼續(xù)孵育，再反復(fù)洗膜后，與ECL發(fā)光液體充分反應(yīng)，根據(jù)蛋白條帶發(fā)光強(qiáng)弱，于暗室中以不同時(shí)間分別曝光，將膠片放入顯影液中顯影后用定影液定影，用水沖洗后晾干。結(jié)果掃描后用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，β-actin用作內(nèi)參對(duì)照。

3.基于表達(dá)譜芯片的臨床大樣本分析

為了能從更大樣本量上研究MYL9與前列腺癌臨床指標(biāo)的相關(guān)性，筆者從GEO網(wǎng)站下載了Taylor等的前列腺癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集（http：／／www. ncbi.nlm.nih.gov／geo／accessionnumber GSE21032）。該數(shù)據(jù)集含有218例腫瘤樣本和149例配對(duì)癌旁邊正常樣本［6］。本研究重點(diǎn)分析含有MYL9 mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)的149例腫瘤樣本的MYL9基因表達(dá)與臨床及病理指標(biāo)的關(guān)系，并進(jìn)行生存分析。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、前列腺癌及癌旁組織的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果比較

4例新鮮前列腺癌組織及4例配對(duì)癌旁組織，應(yīng)用蛋白組學(xué)檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)MYL9在前列腺癌組織的表達(dá)水平比癌旁組織下調(diào)5.67倍（t＝6.668，P＝0.007），見(jiàn)圖1。

二、前列腺癌及癌旁組織的蛋白印跡法結(jié)果比較

蛋白印跡法檢測(cè)了20對(duì)前列腺癌及癌旁前列腺組織，結(jié)果顯示前列腺癌組織中MYL9蛋白比癌旁邊前列腺組織明顯下調(diào)（0.23±0.08 vs.0.73± 0.06，t＝3.946，P＜0.001），見(jiàn)圖2。

三、MYL9表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床及病理指標(biāo)的關(guān)系

Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)的149例前列腺癌患者中，年齡≥66歲、Gleson評(píng)分≥8分、病理分期≥T3A、有轉(zhuǎn)移、死亡患者的MYL9表達(dá)水平相應(yīng)高于年齡＜66歲、Gleson評(píng)分＜8分、病理分期＜T3A、無(wú)轉(zhuǎn)移、存活的患者（P均＜0.05），前列腺癌患者的MLY9表達(dá)水平與血清PSA水平無(wú)關(guān)（P＞0.05），見(jiàn)表1。

圖1 前列腺癌和癌旁前列腺組織的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果

圖2 前列腺癌及癌旁組織的蛋白印跡結(jié)果比較

表1 Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)中MYL9的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（n＝149，±s）

表1 Taylor數(shù)據(jù)庫(kù)中MYL9的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系（n＝149，±s）

臨床及病理指標(biāo)例數(shù)MYL9表達(dá)水平t值P值年齡＜66歲12411.2±0.92.540 0.012 ≥66歲2510.6±1.1血清PSA＜4 μg／L2411.3±0.81.233 0.220 ≥4 μg／L12511.0±1.0 Gleason評(píng)分＜8分10911.4±0.66.111＜0.001 ≥8分4010.2±1.2病理分期＜T3A8811.4±0.63.436 0.001 ≥T3A6110.9±1.2轉(zhuǎn)移有12211.4±0.67.479＜0.001 無(wú)279.7±1.2存活是13111.2±0.85.719＜0.001 否189.9±1.2

四、前列腺癌患者M(jìn)YL9表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)MYL9的表達(dá)水平，以中位數(shù)11.34將其分為低表達(dá)組及高表達(dá)組，進(jìn)一步采用Kaplan-Meier生存曲線分析MYL9與臨床預(yù)后的關(guān)系。MYL9低表達(dá)組前列腺癌患者的無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率明顯低于MLY9高表達(dá)組（χ2＝11.575，P＜0.001），見(jiàn)圖3。

討 論

根據(jù)腫瘤臨床分期和Gleason評(píng)分等指標(biāo)的不同，前列腺癌患者的臨床過(guò)程呈明顯個(gè)體差異，即使病理分期和Gleason評(píng)分相同的患者接受相同的臨床治療，也有可能會(huì)出現(xiàn)不同的治療效果，說(shuō)明現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法和診斷模式也有其不足之處。因此，對(duì)前列腺癌患者的臨床預(yù)后顯得十分重要，近期，前列腺癌研究的熱點(diǎn)主要集中在尋找和評(píng)估新的對(duì)臨床預(yù)后有指導(dǎo)作用的分子因素，希望它們能有助于對(duì)患者病情做出更準(zhǔn)確的評(píng)估，為前列腺癌患者制定出更個(gè)性化的治療方案。

MYL9在不同器官惡性腫瘤中的表達(dá)及磷酸化模式不盡相同。據(jù)報(bào)道，MYL9在膀胱癌和結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)［9-10］。在肺癌、乳腺癌細(xì)胞中，MYL9表達(dá)上調(diào)并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖，且肺癌的轉(zhuǎn)移潛能受肺癌細(xì)胞中MYL9的磷酸化水平的調(diào)控［11-12］。但也有報(bào)道說(shuō)在乳腺癌中srGAP3 和miR-145過(guò)度表達(dá)的同時(shí)，MYL9磷酸化水平升高，并抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和增長(zhǎng)［13-14］。

在有關(guān)前列腺癌的研究中，間質(zhì)因素與前列腺癌進(jìn)展的相關(guān)性也被大量報(bào)道，認(rèn)為腫瘤間質(zhì)比例、生物分子在間質(zhì)中表達(dá)水平變化與前列腺癌的惡性程度相關(guān)并可作為預(yù)測(cè)前列腺癌預(yù)后的潛在指標(biāo)［15-18］。然而上述研究均未提及腫瘤細(xì)胞中MYL9的表達(dá)變化與腫瘤預(yù)后的關(guān)系。筆者團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，MYL9主要在前列腺間質(zhì)區(qū)域表達(dá)，在前列腺癌標(biāo)本中MYL9表達(dá)下調(diào)的同時(shí)腫瘤間質(zhì)成分明顯減少，并且腫瘤間質(zhì)容積越少，前列腺癌的預(yù)后越差，表明MYL9表達(dá)的變化在前列腺癌進(jìn)展中可能發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道，MYL9的活化能調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏著能力，細(xì)胞間黏著連接的解聚有利于腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲。Ayala等［19］認(rèn)為前列腺癌標(biāo)本中間質(zhì)體積的變化可以預(yù)測(cè)前列腺癌的生化復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，間質(zhì)容積小的前列腺癌預(yù)后較差。Sturge等［20］認(rèn)為由MYL9誘導(dǎo)的細(xì)胞收縮性不僅參與細(xì)胞-間質(zhì)黏附的解聚而且還參與破壞細(xì)胞-細(xì)胞間黏著連接的穩(wěn)定性。結(jié)合本研究結(jié)果，MYL9表達(dá)下調(diào)越明顯，前列腺癌的轉(zhuǎn)移及生化復(fù)發(fā)可能性越大。由此推測(cè)，前列腺癌中MYL9表達(dá)下調(diào)可以降低腫瘤細(xì)胞間的黏著連接，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲力。因此，前列腺癌MYL9的表達(dá)下調(diào)可能對(duì)前列腺癌不良預(yù)后的預(yù)測(cè)具有重要指導(dǎo)作用。

圖3 前列腺癌患者M(jìn)YL9表達(dá)水平與無(wú)生化復(fù)發(fā)生存率的關(guān)系

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Expression level and predictive value of myosin light chain 9 in biochemical recurrence of prostate cancer

Zhang Zengqiang，Ye Yongkang，Huang Yaqiang，Wu Yongding，Li Mu，He Huichan.Department of Urology，Guangdong Key Laboratory of Clinical Molecular Medicine and Diagnostics，Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，China
Corresponding autor，He Huichan，E-mail：xiaohejian＠21cn.com

ObjectiveTo investigate the expression level and predictive value of myosin light chain 9 （MYL9）in the biochemical recurrence of prostate cancer.MethodsThe expression levels of MYL9 in the prostate cancer and adjacent benign prostate tissues were assessed by proteomics technique and the results were further validated by western blot.Eventually，the bioinformatics analysis of MYL9 was performed using Taylor data to analyze the difference in the expression of MYL9 among prostate cancer patients with different ages，serum PSA levels，Gleason scores，pathological stages，whether metastasis or not and whether survived or not.ResultsProteomics results revealed that the expression level of MYL9 in the prostate cancer tissue was downregulated by 5.67 times compared with that in the adjacent benign prostate tissue（P＜0.01）；Western blot analysis indicated that the expression level of MYL9 in the prostate cancer tissue was 0.23±0.08，significantly lower compared with 0.73±0.06 in the adjacent benign prostate tissue（P＜0.001）；The expression of MYL9 in prostate cancer patients aged＜66 years，with Gleason score＜8，pathological staging＜T3A，no tumor metastasis and the survived was significantly higher than that in their counterparts aged≥66 years，Gleason score ≥8，with pathological staging≥T3A，tumor metastasis and the dead（all P＜0.001）.Whether serum PSA level＜4 μg／L exerted no effect on the expression of MYL9（P＞0.05）.The biochemical recurrence-free survival rate in prostate cancer patients with low expression of MYL9 was significantly lower compared with that in their counterparts highly expressing MLY9（χ2＝11.575，P＜0.001）.ConclusionsMYL9 expression in theprostate cancer tissue was down-regulated compared with that in adjacent normal prostate tissue.Patients with lower expression level of MYL9 yielded worse clinical prognosis.

Prostate cancer；Myosin light chain；Proteomics；Clinical prognosis

2015-05-16）

（本文編輯：林燕薇）

10.3969／j.issn.0253-9802.2015.11.005

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B021800055）

523059東莞，東莞市人民醫(yī)院泌尿外科（張?jiān)鰪?qiáng)，葉永康，李牧）；510180廣州，廣州醫(yī)科大學(xué)廣州市第一人民醫(yī)院泌尿外科（黃亞強(qiáng)，吳永定，何慧嬋）

，何慧嬋，E-mail：xiaohejian＠21cn.com