A型核纖層蛋白在腰椎退行性疾病中的表達及其意義

歐定強 吳承志 劉鈺瑜 戎利民 徐義春 王其友

基礎(chǔ)研究論著

A型核纖層蛋白在腰椎退行性疾病中的表達及其意義

歐定強 吳承志 劉鈺瑜 戎利民 徐義春 王其友

目的初步探討A型核纖層蛋白（Lamin A）在腰椎退行性疾病中的表達特點及意義。方法將74例腰椎退行性疾病患者分為腰椎間盤突出組（32例）及腰椎管狹窄組（42例），另設(shè)腰椎正常組（12例）作為對照。采用免疫組織化學檢查（免疫組化）及蛋白免疫印跡法檢測Lamin A 在3組腰椎間盤組織標本中的表達情況。結(jié)果免疫組化顯示Lamin A在3組的椎間盤細胞中均有表達，腰椎管狹窄組的Lamin A在椎間盤細胞中的表達較腰椎正常組及腰椎間盤突出組明顯；蛋白免疫印跡法檢測3組椎間盤的纖維環(huán)組織均有Lamin A的表達，腰椎管狹窄組Lamin A條帶灰度值為3.55 ±0.16，腰椎間盤突出組為1.02±0.13，腰椎正常組為0.78±0.14，3組比較差異有統(tǒng)計學意義（F ＝14.326，P＜0.01），腰椎管狹窄組與腰椎間盤突出組及腰椎正常組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001），腰椎間盤突出組與腰椎正常組比較差異尚未有統(tǒng)計學意義（P＝0.134）。結(jié)論隨著腰椎退行性疾病病程的發(fā)展，Lamin A的表達逐漸升高，其可能與腰椎退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系。

A型核纖層蛋白；腰椎間盤突出；腰椎管狹窄；表達

腰椎退行性疾病是腰腿痛的重要原因之一。分子機制的調(diào)控與腰椎疾病密切相關(guān)，有研究顯示，A型核纖層蛋白（Lamin A）在細胞的發(fā)育過程及細胞應力改變過程中起重要作用，其基因表達的異常及突變是促進退行性疾病發(fā)展的因素之一［1-3］。本研究旨在分析該蛋白在腰椎退行性疾病中的表達情況及其意義，為臨床提供數(shù)據(jù)參考。

材料與方法

一、標本采集

選擇性獲取2014年9月至2015年4月在中山大學附屬第三醫(yī)院行后路腰椎間盤切除術(shù)74例患者的腰椎間盤標本。所有患者術(shù)前均行常規(guī)的腰椎MRI檢查，以明確腰椎間盤突出癥或腰椎管狹窄癥的診斷。74例中腰椎間盤突出32例（腰椎間盤突出組），男17例、女15例，年齡22～46歲，病程6～12個月，其中5例標本用于行免疫組織化學檢查（免疫組化），27例標本用于蛋白免疫印跡法檢測；腰椎管狹窄42例（腰椎管狹窄組），男24例、女18例，年齡48～68歲，病程6～24個月，7例標本用于行免疫組化，35例標本用于蛋白免疫印跡法檢測。腰椎正常組的椎間盤組織來自同期因脊柱骨折損傷在我院就診而且需行腰椎間盤切除術(shù)并椎間融合術(shù)的12例患者，其中男7例、女5例，年齡48～68歲，均于脊柱骨折損傷8 h內(nèi)到我院治療，其標本均用于行免疫組化。

二、方 法

1.實驗試劑及器械

免疫組化：乙二胺四乙酸（EDTA）修復液；5%牛血清白蛋白封閉液；3%的實驗用過氧化氫溶液；辣根過氧化物酶（DAB）顯色液；蘇木素染液；常規(guī)的二甲苯、乙醇溶液、磷酸鹽緩沖液（PBS）及中性樹膠；萊卡病理切片機及倒置顯微鏡。其所使用抗體與下文的蛋白免疫印跡法檢測所用的抗體相同。

蛋白免疫印跡法檢測：谷歌生物全蛋白提取試劑盒；凱基生物蛋白濃度測定試劑盒；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠及5%的濃縮膠；5%脫脂奶粉；目的蛋白一抗抗體（Lamin A）；內(nèi)參蛋白抗體（組蛋白3）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；電化學發(fā)光（ECL）液；伯樂電泳及轉(zhuǎn)膜儀；手動曝光板。

2.免疫組化分析Lamin A表達情況

常規(guī)在萊卡切片機切取5 μm的椎間盤組織病理切片，于65℃烘箱烘干1.5 h。脫蠟至水后，切片置于EDTA緩沖液中微波修復，加入3%過氧化氫溶液室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。常規(guī)用5%牛血清白蛋白封閉20 min后，于每張切片加入50 μl約1∶200倍稀釋的一抗覆蓋組織，置于4℃過夜。經(jīng)PBS清洗后，每張切片加入50～100 μl的二抗，室溫孵育2 h。滴加100 μl新鮮配制的DAB，觀察到細胞核周出現(xiàn)棕黃色顆粒則為Lamin A陽性表達。用蘇木素染液復染切片后，行梯度乙醇（70%～100%，10 min 1個梯度）脫水干燥，經(jīng)二甲苯透明后行中性樹膠封固。通過著色強度判斷其表達情況的高低（0～＋4級）［4］。

3.蛋白免疫印跡法檢測組織Lamin A的表達

加入體積為纖維環(huán)組織體積10倍的裂解液（使用前加入Cooktail蛋白酶抑制劑、苯甲基磺酰氟和磷酸化蛋白酶抑制劑）并使用勻漿器充分碎裂組織，使用凱基生物蛋白濃度測定試劑盒測定所提組織提取液蛋白的濃度。提取液蛋白經(jīng)過95℃變性后，于10%（或者15%）的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠及5%的濃縮膠上電泳至蛋白分離。電泳后提取凝膠放置在冰上轉(zhuǎn)至0.45 μm PVDF膜上（250 mA，1 h），常規(guī)用5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗（1∶1 000）單克隆抗體過夜，于4℃孵育及進行常溫下二抗的雜交（組蛋白3作為內(nèi)參蛋白）。再用ECL液浸潤后，放入X光片夾中曝光、定影及進行掃描存檔。采用Image J軟件分析蛋白質(zhì)的灰度值。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示Lamin A在椎間盤細胞中均有表達，且主要表達在細胞核的周圍。Lamin A在腰椎間盤突出組的表達強度為＋2級（圖1B），而在腰椎管狹窄組中的表達較強，為＋4（圖1C），在腰椎正常組中的表達強度為＋1（圖1A）。

二、蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果

3組椎間盤的纖維環(huán)組織均有Lamin A的表達，腰椎管狹窄組Lamin A的表達較腰椎間盤突出組明顯（圖2）。使用Image J軟件分析獲取腰椎管狹窄組Lamin A條帶灰度值為3.55±0.16，腰椎間盤突出組為1.02±0.13，腰椎正常組為0.78± 0.14，3組比較差異有統(tǒng)計學意義（F＝14.326，P ＜0.01），腰椎管狹窄組與腰椎間盤突出組及腰椎正常組比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001），腰椎間盤突出組與腰椎正常組比較差異尚未有統(tǒng)計學意義（P＝0.134）。

圖1 免疫組化分析Lamin A表達情況

圖2 蛋白免疫印跡電泳圖

討 論

腰椎間盤退行性改變是引起腰椎一系列退行性疾病發(fā)生的基礎(chǔ)，如腰椎管狹窄、腰椎間盤突出、腰椎滑脫及退行性側(cè)彎等，有研究顯示其發(fā)展與基因的多態(tài)性密切相關(guān)［5-6］。其中，腰椎間盤突出是腰椎常見疾病之一，其重要的發(fā)病機制之一即為椎間盤纖維環(huán)受到外界的應力而產(chǎn)生退變及髓核的突出，這表明應力的改變會引起椎間盤纖維環(huán)基質(zhì)的合成與代謝的改變［7］。

Lamin A在細胞生長過程中及應力環(huán)境下起重要作用，已有研究表明隨著年齡的增長該蛋白在骨骼系統(tǒng)中會不斷地減少，而在基因敲除小鼠的研究中也證實了該蛋白表達的減少會引起一系列骨代謝改變［8-11］。因此，探討Lamin A在腰椎間盤突出癥中纖維環(huán)組織的表達情況尤為重要，可為椎間盤突出修復提供分子研究的基礎(chǔ)。

腰椎間盤突出與腰椎管狹窄有著密切的聯(lián)系，隨著年齡的增長腰椎間盤突出的進展會引起繼發(fā)性的腰椎管狹窄［12］。在本研究中，腰椎管狹窄組的Lamin A明顯高表達，其次為腰椎間盤突出組，腰椎正常組Lamin A表達最低。Lamin A表達的增加使得腰椎組織抗阻及抗壓能力下降，加速了纖維環(huán)的退變破裂，這種持續(xù)性的積累最終使得髓核組織從纖維環(huán)處突出引發(fā)神經(jīng)壓迫癥狀。因此，本研究結(jié)果提示Lamin A與腰椎間盤疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，我們推測在人的生命進程中，Lamin A可能隨著椎間盤壓力負荷的增加而增加，從而使疾病進入終末期（腰椎管狹窄組）。

但本研究并未從基因水平上比較腰椎間盤突出、腰椎管狹窄患者及腰椎正常者的Lamin A基因表達的情況，并且未能進行椎間盤髓核細胞的體外實驗進一步證實Lamin A在椎間盤退行性疾病中所扮演的角色［13］。有學者利用LaminA／C缺陷的斑馬魚模型證實了胚胎發(fā)育過程中LaminA／C缺陷會引發(fā)骨骼系統(tǒng)發(fā)育的缺陷［14］。另有研究數(shù)據(jù)也說明了鋅基質(zhì)金屬蛋白酶24（Zmpste24）的缺乏會引起LaminA／C基因的缺陷，從而導致干細胞的數(shù)量和增殖能力的下降［15］。因此，我們今后需要進行更多的有關(guān)Lamin A的基因?qū)W研究，以期從基因?qū)W方面探討Lamin A與腰椎間盤退行性疾病發(fā)生的關(guān)系及相關(guān)機制。

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Expression and significance of type A lamin in lumbar spinal degenerative disease

Ou Dingqiang，Wu Chengzhi，Liu Yuyu，Rong Limin，Xu Yichun，Wang Qiyou.Department of Spine Surgery，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China
Correspondtng author，Wang Qiyou，E-mail：wang＿qiyou＠yeah.net

ObjectiveTo preliminarily explore the expression levels and clinical significance of type A lamin（lamin A）in lumbar spinal degenerative disease.MethodsSeventy four patients diagnosed with lumbar spinal degenerative disease were divided into the lumbar disc herniation（n＝32）and lumbar spinal stenosis groups（n＝42）and healthy subjects were recruited into the control group（n＝12）.The expression of lamin A in the lumbar tissue samples from three groups was assessed by immunohistochemical examination and western blotting.ResultsImmunohistochemical analysis revealed that lamin A was expressed in the intervertebral disk cells from all three groups.The staining of lamin A in the tissue from lumbar spinal stenosis group was stronger than those from the other two groups.Western blot demonstrated that lamin A was expressed in the fibrous ring tissue of intervertebral disk from all three groups.In the lumbar spinal stenosis group，the expression level of lamin A was 3.55±0.16（gray level），1.02±0.13 in the lumbar disc herniation group and 0.78± 0.14 in the control group with statistical significance among three groups（F＝14.326，P＜0.01）.Statistical significance was noted between the lumbar spinal stenosis and lumbar disc herniation group／the control group （both P＜0.001）.There was no statistically significant difference between the lumbar disc herniation and control groups（P＝0.134）.ConclusionsOver the progression of degenerative lumbar spinal disease，the expression level of lamin A is gradually up-regulated，which is probably associated with the incidence and development of degenerative lumbar spinal disease.

Type A lamin；Lumbar disc herniation；Lumbar spinal stenosis；Expression

2015-06-07）

（本文編輯：洪悅民）

10.3969／j.issn.0253-9802.2015.11.003

廣東省科技計劃項目（2012B040304006）；2012年廣東省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（1057112012）

510630廣州，中山大學附屬第三醫(yī)院脊柱外科（歐定強，吳承志，戎利民，徐義春，王其友）；524000湛江，廣東醫(yī)學院藥理教研室（劉鈺瑜）

，王其友，E-mail：wang＿qiyou＠yeah.net

并列第一作者，吳承志