豬博卡病毒的基因分型

周 宇，唐連飛，朱事康，朱中武，佟鐵鑄，禹思宇，林志雄，劉 星，陳燕忠，羅卓軍

（1.惠州出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東惠州 516006；2.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖南長(zhǎng)沙 410004；3.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州 510623）

豬博卡病毒的基因分型

周 宇1，唐連飛2，朱事康1，朱中武2，佟鐵鑄1，禹思宇2，林志雄3，劉 星1，陳燕忠1，羅卓軍1

（1.惠州出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，廣東惠州516006；2.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局，湖南長(zhǎng)沙410004；3.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510623）

為了解豬博卡病毒（PBoV）的遺傳進(jìn)化規(guī)律，研究可行的 PBoV 基因分型方法，本研究利用 GenBank中登錄的 29條 PBoV 和2條本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的全基因組序列信息，采用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行基因組序列分析。結(jié)果顯示，分別以NS1 基因、NP1 基因和 VP1 基因編碼氨基酸構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，PBoV 均被劃分為 3 個(gè)基因群，但三種氨基酸序列繪制的進(jìn)化樹(shù)存在差異；基因群內(nèi)各病毒株的氨基酸序列同源性較高，而各基因群之間病毒株的氨基酸序列同源性非常低，基因組結(jié)構(gòu)差異較大。

豬博卡病毒；遺傳進(jìn)化分析；基因分型

豬博卡病毒（porcine Bocavirus，PBoV）為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科博卡病毒屬成員，基因組為單鏈線狀 DNA，基因組約 5.0 kb，含有 3 個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORFs），編碼 2 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1和 NP1，以及 2個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，即衣殼蛋白 VP1和VP2[1]。其中 VP1/VP2存在部分重疊，是病毒的主要抗原蛋白。目前已經(jīng)在多種動(dòng)物（包括人）體內(nèi)檢測(cè)到博卡病毒[2]，并且PBoV 各株間基因組大小差異較大。2009 年瑞典研究人員首先在患有仔豬斷奶多系統(tǒng)衰竭綜合征的病豬中獲得一段1879 bp的核苷酸序列，該序列與 HBoV 序列相似，包括完整的 NP1 基因和部分 VP1/VP2 基因，因此暫時(shí)將其命名為豬類博卡病毒（Porcine boca-like virus，PBo-likeV）[3]。隨后，各國(guó)在發(fā)病或健康豬的樣品中獲得了 PBoV 的全長(zhǎng)或接近全長(zhǎng)基因組序列，證明了 PBoV 確實(shí)在豬體內(nèi)普遍存在。目前在 PBoV的檢測(cè)方法、流行病學(xué)、全基因擴(kuò)增等方面已經(jīng)取得了較大進(jìn)展[4，5]，但在基因分型、病毒分離、致病性等方面的研究還比較薄弱。最初根據(jù)該病毒發(fā)現(xiàn)的先后將PBoV分為 5個(gè)基因型[6，7]，國(guó)內(nèi)也有學(xué)者將其分為7個(gè)基因表型（PBoV1-5、PBoLV、PPV4）[11]。還有一些研究人員在獲得 PBoV 全基因組序列后，并未進(jìn)行 PBoV 基因分型。目前對(duì)PboV的基因分型方法的建議主要是2013年國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）建議的博卡病毒分類標(biāo)準(zhǔn)，建議以NS1基因編碼的氨基酸同源性為依據(jù)，將氨基酸同源性＞85%劃分為同一種群，氨基酸差異＞15%的劃分為不同種群，將豬博卡病毒分為4個(gè)種群。也有一些學(xué)者認(rèn)為博卡病毒的分型應(yīng)該以VP1基因?yàn)橐罁?jù)，Kapoor等[7]基于對(duì)HBoV中大量VP1基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析提出了新的HBoV分類標(biāo)準(zhǔn)：病毒間VP1氨基酸差異＞8%且核苷酸差異＞10%時(shí)歸為不同種;VP1氨基酸差異＞1.5%且核苷酸差異＞5%時(shí)歸為不同基因型；覃紹敏等[9]通過(guò)基因序列比較和基因進(jìn)化樹(shù)分析，提出將PboV劃分為PBoV1-3三個(gè)基因型。通過(guò)對(duì)以上觀點(diǎn)的綜合考慮，本研究參考 GenBank 中登錄的所有 PBoV 全基因組序列（包括3個(gè)完整 ORFs）和本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的2株P(guān)boV的全基因序列，采用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行各基因編碼的氨基酸序列同源性和遺傳進(jìn)化分析，研究并討論 PboV可行的基因型分類方法。

1 材料和方法

本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的兩株P(guān)BoV 全基因組序列命名為GD4（KJ755665）和GD18（KJ755666），再?gòu)腉enBank上獲取29條PboV的全基因組序列信息，序列包括國(guó)內(nèi)全部毒株，美洲、歐洲、非洲部分不同基因型毒株?；趪?guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）根據(jù)氨基酸序列相似性對(duì)細(xì)小病毒進(jìn)行分類的原則，截取每條序列完整的 ORFs 部分（NS1、NP1、VP1/VP2），采用 DNAStar 生物信息學(xué)軟件翻譯成氨基酸序列并通過(guò) Clustal W算法進(jìn)行同源性分析，采用MEGA5.1繪制系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹(shù)，并引入了一條外群序列HM031134（豬細(xì)小病毒4型），對(duì)得到的可信樹(shù)進(jìn)行分析。引用的基因登錄號(hào)為：HQ223038、HM053693、HM053694、 HM031134、JN831651、HQ291308、HQ291309、JF429834、JF429835、JF429836、JF512472、JF512473、JF713715、JF713714、JX854557、KC473563、KF206165、KF206155、KF206157、KF206167、KF206154、KF206161、KF206162、KF206166、NC-023673、KF025390、KF025394、KF206156、JN681175和JN621325。

2 結(jié)果

2.1 氨基酸遺傳進(jìn)化分析

將 29條 PBoV 的NS1 編碼氨基酸、NP1 編碼氨基酸、VP1/VP2 編碼氨基酸的進(jìn)行序列相似性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1、2、3）。結(jié)果顯示選取NS1 編碼氨基酸、NP1編碼氨基酸 和 VP1編碼氨基酸所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)均分為2個(gè)大分支，參照外群基因發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)平行的大分支集中了較多的毒株序列；次一級(jí)分支均為3個(gè)（除去bootstrap 值小于60%的小分支）較大的分支，將三個(gè)大分支分別命名為G1群、G2群、G3群，但是各分支的位置卻不同，以HQ291308株（“☆”標(biāo)注）為例，以VP1/VP2 編碼氨基酸構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)時(shí)其與其它3個(gè)毒株處于一個(gè)大的獨(dú)立分支上（圖1）；以NS1 編碼氨基酸、NP1編碼氨基酸構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)時(shí)，HQ291308株卻與另一個(gè)分支同處于一個(gè)大分支上，而不是獨(dú)立的分支（圖2、3）。因此，VP1/VP2編碼氨基酸和NS1編碼氨基酸、NP1編碼氨基酸在進(jìn)化關(guān)系上存在很大差異，可能來(lái)自于不同的祖先；G1群和G2群包含的毒株較多，并且存在一些小的分支，這些小分支在 3 個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中存在一定差異性，而且有些bootstrap 值較低，再進(jìn)一步劃分還需要更多數(shù)量的基因序列。覃紹敏等[9]和Yang等[13]經(jīng)過(guò)基因序列和遺傳進(jìn)化分析提出可以考慮將PboV劃分為PBoV1、PBoV2和 PBoV3三個(gè)基因群。本研究認(rèn)為從進(jìn)化關(guān)系觀察分為3個(gè)群也是可行的，但以不同編碼氨基酸為依據(jù)進(jìn)行分類在進(jìn)化關(guān)系上不同；如圖所示，所有序列明顯分為兩個(gè)大分支，根據(jù)NS1和NP1的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)G2群和G3群處于同一分支，而根據(jù)VP1/VP2繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)G1群和G2群處于同一個(gè)分支，因此推測(cè)豬博卡病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VP1/VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，NP1在進(jìn)化關(guān)系上存在差異，尤其是G3群病毒的結(jié)構(gòu)蛋白處于獨(dú)立進(jìn)化分支，而非結(jié)構(gòu)蛋白與G2群病毒關(guān)系密切。

圖1 VP1/VP2 氨基酸進(jìn)化樹(shù)

圖2 NP1氨基酸進(jìn)化樹(shù)

2.2 氨基酸同源性分析

根據(jù)2.1 PBoV的基因分群情況，分別進(jìn)行PBoV 基因群內(nèi)和群間氨基酸序列同源性分析（圖4、5、6）。表 1結(jié)果顯示，以 NS1、NP1、VP1/VP2編碼氨基酸序列進(jìn)行比較，基因群內(nèi)的氨基酸同源性均較高，G1群內(nèi)同源性最高為 98.8%，G2群內(nèi)同源性最高為 98.6 %，G3 群內(nèi)同源性最高為99.5 %；而基因群間的氨基酸同源性非常低，G1 群和G2 群之間最高為 43.6 %，最低為 31.1 %，G1群和G3群之間最高為42.4 %，最低僅為 25.1%，G2群 和G3群之間最高為 48.4 %，最低37.9%。由此表明PBoV 各株之間的氨基酸序列具有多樣性，基因群內(nèi)的病毒株具有較高的保守性，而不同基因群的病毒株間差異較大；G1 群和G2 群病毒株VP1 基因編碼氨基酸序列同源性為 38.2%～41.5 %，G1群和G3 群同源性 為 29.4%～36.8 %，G2 群和G3 群同源性為44.3%～48.4 %，均低于50 %；而各群內(nèi)病毒株的VP1/VP2 基因編碼氨基酸序列同源性最低為73.3%，群間氨基酸序列相似性較低，群內(nèi)氨基酸序列相似性較高，如果以VP1/VP2或NS1 基因編碼氨基酸序列同源性高低為依據(jù)進(jìn)行基因分型是可行的。PBoV 各基因編碼氨基酸序列同源性分析結(jié)果與之前的氨基酸序列進(jìn)化分群結(jié)果相一致。從表中可以看出NS1的群間氨基酸同源性高于其余兩種蛋白，均在36%以上，滿足國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）中關(guān)于病毒分屬的要求。目前G3群只有4條全基因序列，在進(jìn)行氨基酸同源性比對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)一個(gè)特殊的毒株HQ291308，該毒株的NP1，VP1/VP2與其它3個(gè)毒株的的相關(guān)氨基酸序列同源性很高，在97.6～99.5%之間，但是NS1與其它3個(gè)毒株的相關(guān)氨基酸序列同源性最高只有81.0%。按照ICTV的分類方法將其分為一個(gè)獨(dú)立的Ungulate bocaparvovirus 3型，但是在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上，該毒株并不處于一個(gè)獨(dú)立分支（見(jiàn)進(jìn)化樹(shù)“☆”標(biāo)注），還需要更多的序列進(jìn)行研究。

圖3 NS1氨基酸進(jìn)化樹(shù)

表 1 PBoV 編碼氨基酸同源性分析結(jié)果

圖4 NS1氨基酸同源性

圖5 VP1/VP2 氨基酸同源性

圖6 NP1 氨基酸同源性

3 討論

2013年國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）對(duì)博卡病毒的分類進(jìn)行了調(diào)整，之前建議將NS1基因序列同源性＞95%劃分為同一種群，隨著博卡病毒全基因序列的不斷發(fā)布，建議以NS1氨基酸相似性＞85%為同一種群進(jìn)行分類。并將豬博卡病毒分為Ungulate bocaparvovirus 2（包括HM053693、HM053694、HQ291309），Ungulate bocaparvovirus 3（HQ223038），Ungulate bocaparvovirus 4（HQ291308），Ungulate bocaparvovirus 5（JF429834、JF429835、JF429836）4個(gè)種群。本研究通過(guò)對(duì)氨基酸遺傳進(jìn)化和同源性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)同種群豬博卡病毒的同源性較高，在進(jìn)化分支上處于同一分支，對(duì)其進(jìn)行基因分型具有可行性。但G1群和G3群的毒株多樣性顯著，G1群內(nèi)毒株NS1同源性在74.7～98.8%之間，結(jié)合ICTV的以NS1氨基酸相似性＞85%為同一種群的分類方法進(jìn)一步劃分比較合適。目前已經(jīng)有KF206154，JN831651，JF512473，JN621325和 KF025394，JN681175兩個(gè)新的種群，可以命名為Ungulate bocaparvovirus 6和Ungulate bocaparvovirus 7。

一些學(xué)者認(rèn)為VP1/VP2能夠在很大程度上影響病毒的組織嗜性及潛在致病性，應(yīng)該以編碼VP1/VP2的核苷酸序列相似性高低作為分類標(biāo)準(zhǔn)[12]，可以考慮將VP1/VP2作為基因分型的首選基因[9]。觀察3個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和相似性比較發(fā)現(xiàn)以NS1為依據(jù)和以VP1/VP2為依據(jù)進(jìn)行分群在進(jìn)化關(guān)系上存在不同，但是得到的結(jié)果一致，G1和G2群內(nèi)包含的毒株一致；不一致之處在于G3群中的HQ291308株，以NS1為依據(jù)，按照氨基酸序列相似性＞85.0%劃分為同一種群進(jìn)行劃分，它應(yīng)該屬于獨(dú)立種群。但如果以VP1/VP2為依據(jù)，它與HQ223038同源性高達(dá)98.4%，它們應(yīng)該屬于同一個(gè)種群。因此病毒的分類方法還需要不斷的補(bǔ)充完善。但為做到豬博卡病毒基因分型研究的一致性，應(yīng)該按照ICTV的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)NS1氨基酸相似性進(jìn)行分類。

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Studies on Genotyping of Porcine Bocaviruses

Zhou Yu1，Tang Lianfei2，Zhu Shikang1，Zhu Zhongwu2，Tong Tiezhun1，Yu Siyu2，Lin Zhixiong3，Liu Xing1，Chen Yanzhong1，Luo Zhuojun1
（1.Huizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huizhou，Guangdong 516001；2.Hunan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Changsha，Hunan 410004；3. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510623）

To analyze the genomic characteristics and classify the genotypes of porcine Bocavirus（PBoV），the complete genomic sequences of 29 PBoVs available in GenBank and 2 PboVs detected by our laboratory were analyzed for the homology of NS1，NP1，VP1 amino acid sequences by bioinformatics software. The results showed that PBoV could be divided into three groups based on phylogenetic tree established according to PBoV NS1，NP1，VP1 amino acid sequences，but there were also some noticeable differences among them：the viruses in the same group shared higher sequence identity and those in different groups shared lower sequence identity.

porcine Bocavirus（PboV）；phylogenetic analysis；genotyping

S852.651

：A

：1005-944X（2015）02-0063-06

國(guó)家質(zhì)檢總局項(xiàng)目（2014IK243）