內(nèi)毒素耐受對細胞因子的影響

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院風濕免疫科，沈陽 110032）

內(nèi)毒素耐受對細胞因子的影響

趙欣欣，閔睿，張麗麗

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院風濕免疫科，沈陽 110032）

目的進一步明確內(nèi)毒素耐受時炎性相關(guān)細胞因子的變化。方法昆明鼠分組處置。建立內(nèi)毒素（LPS）耐受鼠模型。ELISA方法測定血清腫瘤壞死因子α（TNF-α），白細胞介素10（IL-10）和白細胞介素17（IL-17）濃度。結(jié)果LPS對照組血清TNF-α、IL-10和IL-17濃度分別為（2 261.49±1 090.28）pg/mL，（7 780.42±2 320.04）pg/mL，（27.28±13.76）pg/mL，較健康對照組顯著增高。而內(nèi)毒素耐受組相應(yīng)細胞因子血清濃度分別為（1 174.19±450.91）pg/mL，（1 293.26±520.85）pg/mL，（22.26±11.44）pg/mL。地塞米松干預(yù)進一步降低了TNF-α和IL-17的水平，但對IL-10水平無顯著影響。結(jié)論內(nèi)毒素耐受狀態(tài)與內(nèi)毒素炎癥狀態(tài)比較，TNF-α和IL-10水平顯著降低，IL-17水平無顯著變化。應(yīng)用地塞米松可進一步降低內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下的TNF-α和IL-17水平。

內(nèi)毒素耐受；腫瘤壞死因子α；白細胞介素10；白細胞介素17

內(nèi)毒素也稱為脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌菌壁的主要成分，在人體內(nèi)LPS通過作用于Toll樣受體4激活核因子κB，使機體產(chǎn)生顯著的炎性反應(yīng)，多種促炎細胞因子升高，如腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-8、干擾素等，同時還伴隨多種抗炎介質(zhì)，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β、糖皮質(zhì)激素的升高，嚴重時可出現(xiàn)系統(tǒng)性炎性反應(yīng)綜合征、多器官功能障礙綜合征而危及生命。然而，如預(yù)先予機體小劑量的LPS刺激，機體對隨后大劑量或致死量LPS刺激呈現(xiàn)出低反應(yīng)甚至無反應(yīng)的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為內(nèi)毒素耐受。內(nèi)毒素耐受的形成避免了機體產(chǎn)生持續(xù)過度的炎性反應(yīng)，對機體是一種保護作用。內(nèi)毒素耐受的發(fā)生機制尚未完全清楚。目前認為LPS主要作用于單核/巨噬細胞，誘發(fā)炎性反應(yīng)或內(nèi)毒素耐受均主要通過單核/巨噬細胞系統(tǒng)產(chǎn)生，標志性事件是炎癥時TNF-α水平顯著升高，而內(nèi)毒素耐受時TNF-α升高水平顯著下降［1］。IL-17也是重要的促炎因子，在慢性炎癥和自身免疫性炎癥中發(fā)揮重要作用。內(nèi)毒素耐受時，炎癥表現(xiàn)明顯受抑，是否也影響IL-17的產(chǎn)生值得研究。到目前為止，尚未見相關(guān)研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：8～12周齡雌性昆明小鼠，體質(zhì)量26～38 g，購于中國醫(yī)科大學實驗動物中心，SPF級，飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院動物室獨立通風籠具系統(tǒng)，標準滅菌復合飼料及純凈水飼養(yǎng)，室內(nèi)自然溫度及光照。主要試劑：脂多糖（O55：B5）購于寶信生物公司；TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒和IL-17 ELISA試劑盒均購于博士德公司。

1.2 昆明小鼠分組

Ⅰ組：健康對照組（10只）；Ⅱ組：LPS陽性對照組（10只）；Ⅲ組：內(nèi)毒素耐受組（6只）；Ⅳ組：高劑量地塞米松干預(yù)內(nèi)毒素耐受組（6只）；Ⅴ組：低劑量地塞米松干預(yù)內(nèi)毒素耐受組（6只）。

1.3 分組處置

Ⅰ組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（0.5 mL/d）。Ⅱ組小鼠連續(xù)4 d腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（0.5 mL/d），第5天腹腔注射大劑量LPS（8 mg/kg）。Ⅲ組小鼠連續(xù)4 d腹腔注射小劑量LPS（80 μg/kg·d），第5天腹腔注射大劑量LPS（8 mg/ kg）。Ⅳ組小鼠連續(xù)4 d腹腔注射小劑量LPS（80 μg/ kg·d），第5天腹腔注射大劑量LPS（8 mg/kg），注射大劑量LPS前1 h腹腔注射地塞米松（10 mg/kg）。Ⅴ組小鼠連續(xù)4 d腹腔注射小劑量LPS（80 μg/kg· d），第5天腹腔注射大劑量LPS（8 mg/kg），注射大劑量LPS前1 h腹腔注射地塞米松（1 mg/kg）。各組于第5天注射大劑量LPS 3 h后，采用摘眼球法取血標本，留取血清，4℃保存，次日檢測血清細胞因子。

1.4 細胞因子水平測定

取血清標本，依照ELISA試劑盒內(nèi)說明具體操作，檢測OD值，應(yīng)用curve exert1.3軟件求得TNF-α、IL-10和IL-17濃度值。

1.5 統(tǒng)計學分析

正態(tài)分布數(shù)據(jù)2組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)2組間比較采用秩和檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。應(yīng)用GraphPad6繪制散點圖。

2 結(jié)果

血清TNF-α水平（圖1）：健康對照組（Ⅰ組）血清TNF-α濃度處于非常低的水平，LPS陽性對照組（Ⅱ組）TNF-α水平呈爆發(fā)式升高，2組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。內(nèi)毒素耐受組（Ⅲ組）較Ⅱ組TNF-α水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），證明內(nèi)毒素耐受誘導成功，但其水平仍高于Ⅰ組。地塞米松干預(yù)內(nèi)毒素耐受組（Ⅳ組和Ⅴ組）TNF-α水平低于Ⅲ組TNF-α水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01和P＜0.05）。

圖1 各組血清TNF-α水平Fig.1 Serum TNF-α levels in different groups

血清IL-10水平（圖2）：Ⅰ組血清IL-10濃度處于非常低的水平，Ⅱ組IL-10水平亦呈爆發(fā)式升高，兩組比較P＜0.01，差異有統(tǒng)計學意義。Ⅲ組較Ⅱ組IL-10水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。Ⅳ組IL-10水平較Ⅲ組IL-10水平增高，差異無統(tǒng)計學意義，Ⅴ組IL-10水平較Ⅲ組IL-10水平降低，差異不具有統(tǒng)計學意義。

圖2 各組血清IL-10水平Fig.2 Serum IL-10 levels in different groups

血清IL-17水平（圖3）：Ⅰ組血清IL-17濃度處于較低的水平，Ⅱ組IL-17水平較Ⅰ組增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），但IL-17水平升高幅度（不足3倍）不如TNF-α和IL-10水平升高的幅度。Ⅲ組IL-17水平較Ⅱ組僅輕度下降，差異無統(tǒng)計學意義。Ⅳ、Ⅴ組與Ⅲ組比較，IL-17水平均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。

3 討論

圖3 各組血清IL-17水平Fig.3 Serum IL-17 levels in different groups

機體初次受到中小劑量LPS刺激時TNF-α水平顯著升高，形成內(nèi)毒素耐受時TNF-α升高幅度明顯降低，TNF-α的這種變化特點被認為是形成內(nèi)毒素耐受的標志。本實驗同樣證實了，當小鼠單次受到LPS刺激時TNF-α水平顯著升高，多次小劑量LPS刺激后，當小鼠受到大劑量LPS刺激后TNF-α升高幅度明顯下降。許多研究表明內(nèi)毒素耐受的主要環(huán)節(jié)是單個核細胞的功能發(fā)生了顯著的變化［1］，有研究者稱其為“重程序化（reprogramming）”［2］。而TNF-α主要是由活化的單個核細胞產(chǎn)生的。因而內(nèi)毒素耐受表明單個核細胞系統(tǒng)的致炎功能被抑制。LPS可誘導體外培養(yǎng)的外周血單個核細胞產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受，進一步印證了上述觀點［3］。

IL-10是一種多效性免疫調(diào)節(jié)細胞因子，具有保護機體免于感染相關(guān)性免疫病理損傷的作用，固有免疫和獲得性免疫中的大部分細胞能夠表達IL-10。IL-10缺乏鼠表現(xiàn)出的針對抗原的免疫反應(yīng)程度加重且反應(yīng)時間延長，機體出現(xiàn)過度的炎性反應(yīng)。IL-10缺乏鼠針對LPS的發(fā)熱反應(yīng)也表現(xiàn)為程度加重和時間延長。依賴于IL-10的負反饋在防止由于T細胞介導的自身免疫病和感染誘發(fā)的免疫病理性組織損害中具有重要作用［4］。本實驗中，LPS陽性對照組小鼠在單次大劑量LPS刺激后，在TNF-α顯著升高的同時也伴隨IL-10的顯著升高，說明LPS誘發(fā)炎性反應(yīng)的同時也開啟了炎癥的負反饋機制。但在內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下，IL-10也隨TNF-α水平降低而降低。小鼠內(nèi)毒素耐受對細胞因子影響的研究結(jié)果表明TNF-α、IL-6和IL-10的產(chǎn)生在免疫耐受狀態(tài)下均受到抑制，與本實驗結(jié)果相近［5］。體外單個核細胞培養(yǎng)誘導的內(nèi)毒素耐受也同樣表現(xiàn)為TNF-α和IL-10水平降低［3］。說明IL-10對炎癥的負反饋機制并不是內(nèi)毒素耐受的產(chǎn)生機制。IL-10基因敲除鼠仍能發(fā)生內(nèi)毒素耐受更加有力的說明IL-10不是內(nèi)毒素耐受產(chǎn)生的責任細胞因子［6］。

無論體內(nèi)實驗還是體外實驗都表明LPS誘導的炎性反應(yīng)不僅引起TNF-α水平的升高，還可引起IL-17水平的升高。IL-17參與許多慢性炎性反應(yīng)的發(fā)生，也與自身免疫狀態(tài)具有很強的關(guān)聯(lián)性［7］。本實驗中，內(nèi)毒素耐受在降低了以TNF-α促炎因子為代表的炎性反應(yīng)的同時，也降低了以IL-10為代表的抑炎因子的負反饋反應(yīng)，但對IL-17水平無顯著影響。Rachmawati等［8］在模擬的內(nèi)毒素耐受實驗中，以一種抗TLR4單克隆抗體預(yù)刺激TLR4，產(chǎn)生了LPS耐受的現(xiàn)象，單核/巨噬細胞的功能受到抑制，但輔助性CD4+T細胞的活性并未受損。Th17細胞也來源于輔助性CD4+T細胞，故此推測其產(chǎn)生IL-17的能力也未受損。這可能是本實驗中內(nèi)毒素耐受未對IL-17水平產(chǎn)生顯著影響的機制。

糖皮質(zhì)激素具有抑制IL-17的作用［9］，但在內(nèi)毒素耐受過程中，這一作用是否受到影響，尚未見報道。本實驗中，對地塞米松干預(yù)內(nèi)毒素耐受組，預(yù)先應(yīng)用糖皮質(zhì)激素-地塞米松后再使用大劑量LPS注射，則TNF-α和IL-17水平較未用地塞米松的內(nèi)毒素耐受組顯著下降，提示內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下的免疫細胞仍具有對糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)能力。糖皮質(zhì)激素可能與內(nèi)毒素耐受具有協(xié)同抑炎作用，能更廣泛的抑制炎性反應(yīng)，既能抑制固有免疫功能，又能抑制TH17細胞的功能。

內(nèi)毒素耐受對IL-17是否存在影響，尚未見相關(guān)研究報道。本研究初步表明內(nèi)毒素耐受對IL-17水平無顯著影響，但預(yù)先給予地塞米松作用后，內(nèi)毒素耐受小鼠的IL-17產(chǎn)生受到顯著抑制。

綜上所述，內(nèi)毒素耐受狀態(tài)與內(nèi)毒素炎癥狀態(tài)比較，TNF-α和IL-10水平顯著降低，IL-17水平無顯著變化。應(yīng)用地塞米松可進一步降低內(nèi)毒素耐受狀態(tài)下的TNF-α和IL-17水平，但對IL-10水平無進一步的顯著影響。這一結(jié)果進一步說明了內(nèi)毒素耐受主要發(fā)生在炎性反應(yīng)的單核/巨噬細胞環(huán)節(jié)，而對淋巴細胞參與的以IL-17為標志的炎性反應(yīng)環(huán)節(jié)影響不顯著。

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（編輯裘孝琦）

EffectofEndotoxin Tolerance on Cytokine

ZHAOXin-xin，MINRui，ZHANGLi-li
（DepartmentofRheumatology，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo further determine the inflammation-associated cytokine changes during endotoxin（LPS）tolerance.MethodsKunming mice were divided into groups.The endotoxin tolerance mouse model was established with repeated injection of LPS.Serum levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α），interleukin-10（IL-10）and IL-17 were determined by ELISA assay.ResultsThe serum concentrations of TNF-α，IL-10 and IL-17 were 2 261.49±1 090.28 pg/mL，7 780.42±2 320.04 pg/mL，and 27.28±13.76 pg/mL in the LPS control group，which were increased significantly compared to the normal healthy control group.The serum concentrations of TNF-α，IL-10 and IL-17 were 1 174.19±450.91 pg/mL，1 293.26±520.85 pg/mL，and 22.26±11.44 pg/mL in the endotoxin tolerance group.Levels ofTNF-αand IL-17 were furtherdecreased by dexamethasone treatment during LPS tolerance inducing，while the IL-10 level did not change significantly.ConclusionCompared to the status of endotoxin inflammation，levels ofTNF-αand IL-10 decreased significantly，while levels ofIL-17 were notsignificantly changed in the status ofendotoxin tolerance.Dexamethasone could furthersuppress TNF-αand IL-17 levels during endotoxin tolerance inducing.

endotoxin tolerance；tumor necrosis factor-α；interleukin-10；interleukin-17

R392

A

0258-4646（2015）03-0259-04

趙欣欣（1968-）男，副主任醫(yī)師，博士. E-mail：cellcept@sohu.com

2014-09-18

網(wǎng)絡(luò)出版時間：