加巴噴丁對大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷DRG中TRPV1的影響

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.麻醉科；2.急診科，大連 116011）

加巴噴丁對大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷DRG中TRPV1的影響

閻妮1，欒永1，李潤玖2

（大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1.麻醉科；2.急診科，大連 116011）

目的研究加巴噴丁對坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（CCI）大鼠DRG中TRPV1的影響。方法使用SD雄性大鼠建立CCI模型，隨機(jī)分為3組：對照組，CCI組，CCI+GBP組。使用行為學(xué)檢測機(jī)械性痛和熱痛。術(shù)后第8天，搜集DRG，用RT-PCR和Western blot檢測DRG中TRVP1的表達(dá)情況。結(jié)果CCI手術(shù)后DRG中TRPV1基因的mRNA表達(dá)顯著增加，GBP能夠減少CCI后DRG的TRPV1基因的mRNA表達(dá)。結(jié)論在CCI手術(shù)后，DRG中TRPV1基因的表達(dá)升高，使用GBP后，其表達(dá)降低。

神經(jīng)痛；加巴噴?。蛔巧窠?jīng)慢性壓迫損傷；大鼠；TRPV1

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain）是臨床常見的一種慢性疼痛，具有痛覺過敏、痛覺異常和自發(fā)性疼痛的特點(diǎn)。神經(jīng)病理性疼痛的病因比較復(fù)雜，包括中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的損傷、感染炎癥、異物壓迫、糖尿病等都可能引起患者產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛的癥狀。神經(jīng)病理性疼痛的患者長時(shí)間忍受折磨，但由于目前該病的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，沒有合適的治療方法［1］。神經(jīng)病理性疼痛不單影響患者個(gè)人的生活，還會(huì)影響到患者的家庭、工作。為此，找到合適的治療藥物緩解疼痛尤其重要。

瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（transient receptorpotential vanilloid 1，TRPV1），是指“瞬態(tài)感受器電位陽離子通道，子類Ⅴ，成員1”（transient receptor potential cation channel，subfamilyⅤ，member 1），該通道是由TRPV1基因所編碼的蛋白質(zhì)［2］。該通道被發(fā)現(xiàn)存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)系統(tǒng)上，并且涉及痛覺的傳遞和調(diào)制，以及整合各種疼痛信息［3］。

目前，加巴噴丁治療神經(jīng)病理性疼痛的療效逐漸被臨床認(rèn)可，越來越成為科研的焦點(diǎn)。大量的臨床試驗(yàn)已證實(shí)加巴噴丁可以緩解患者的部分疼痛癥狀［4］，但是內(nèi)在作用機(jī)制仍有待研究。本研究通過坐骨神經(jīng)慢性壓迫損傷（chronic constriction injury，CCI）大鼠模型，證實(shí)加巴噴丁能有效抑制神經(jīng)病理性疼痛。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級健康的SD雄性大鼠18只，體質(zhì)量為190～210 g，購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)環(huán)境有通風(fēng)系統(tǒng)，溫度控制在23℃，燈光控制明暗各12 h。 將18只SD大鼠隨機(jī)分為3組（每組n= 6）：對照組；手術(shù)組，CCI；治療組，CCI+GBP 100 mg/kg加巴噴丁組。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑

Von Frey絲，不銹鋼絲網(wǎng)墊（0.5 cm×0.5 cm），有機(jī)玻璃隔板20 cm×10 cm×15 cm，手術(shù)器械，戊巴比妥鈉，加巴噴丁。

1.3 大鼠CCI模型

根據(jù)Bennet-xie模型制作大鼠CCI模型，腹腔注射麻醉，給大鼠備皮，用75%乙醇消毒，鋪消毒巾，用手術(shù)刀在大鼠左側(cè)大腿中點(diǎn)切開皮膚，經(jīng)股二頭肌的縫隙鈍性分離，暴露出坐骨神經(jīng)，小心將坐骨神經(jīng)與周圍組織分開。在坐骨神經(jīng)主干遠(yuǎn)端7 mm處，用4號羊腸線將坐骨神經(jīng)結(jié)扎4道，每道之間間隔1 mm。

1.4 行為學(xué)檢測

實(shí)驗(yàn)大鼠手術(shù)后，觀察其步態(tài)和后肢的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，觀察大鼠是否有肢體癱瘓和運(yùn)動(dòng)障礙的問題。

1.4.1 Von-frey檢測大鼠對機(jī)械性刺激的反應(yīng)：測試大鼠行為時(shí)，保證環(huán)境不受外界干擾，將待檢測大鼠放置在有機(jī)玻璃擋板中，下面放不銹鋼網(wǎng)。大鼠適應(yīng)環(huán)境1 h后，使用Von-frey絲扎大鼠左、右足底，每只大鼠刺激3次，每次間隔20 s。大鼠出現(xiàn)抬足、縮足、甩足、舔足等反應(yīng)。將3次結(jié)果取平均值作為機(jī)械縮足反射閾值（mechanical withdrwal threshold，MWT）。各組大鼠在手術(shù)前測定左足基礎(chǔ)機(jī)械痛域，手術(shù)后第4天開始，每天測量機(jī)械性痛域，測定時(shí)間固定為上午10時(shí)到11時(shí)。

1.4.2 檢測大鼠對熱刺激的反應(yīng)：在安靜的環(huán)境，將熱板測痛儀預(yù)熱到55℃，然后將大鼠放置于觀察箱中，檢測大鼠從后足接觸熱板到縮足反射的潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）。檢測3次，取平均值，作為熱痛過敏的閾值，最高閾值設(shè)定為20 s，超過20 s后正常大鼠可以引起疼痛反應(yīng)。

1.5 RT-PCR檢測大鼠DRG中TRPV1的mRNA水平

選取CCI手術(shù)后第8天處死大鼠，搜集腰3，腰4，腰5的手術(shù)側(cè)DRG，應(yīng)用RT-PCR的方法研究GBP對疼痛相關(guān)基因TRPV1的影響。使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，大連Takara公司合成。TRPV1 Forward：5′-GGTGGACGAGGTAAACTGGA-3′，Reverse 5′-GCTGGGTGGCATGTCTATCT-3′，131 bp；GAPDH，F(xiàn)orward：5′-CCGAGGGCCCACTAA AGG-3′，Reverse：5′-GCTGTTGAAGTCACAGGAGA CAA-3′，120 bp。逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄具體操作：1 μL樣品RNA，1 μ L隨機(jī)引物Random Hexamer（50 pmol/μL），2 μL 5× Reverse transcriptase buffer，6 μL RNase-free H2O，在65℃變性5 min后迅速置于冰浴中。再加入2 μL 5×Reverse transcriptase buffer，4 μ L dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL RNase抑制劑（200 U/μL），2 μL DTT（100 mmol/L），1 μL M-MLV Reverse Transcriptase（50 U/μL），總體積為20 μL，于37℃溫育1 h，反應(yīng)結(jié)束后在95℃加熱5 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，4℃冷卻，產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：sybr green PCR master mix（Applied Biosystems by life technologies）12.5 μL、正義與反義PCR引物各1 μL、ddH2O 8.5 μL、模板mRNA2 μL。反應(yīng)條件：95℃10 s，95℃5 s，60℃45 s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，自動(dòng)計(jì)算定量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 疼痛行為學(xué)結(jié)果

CCI組與CCI+GBP組大鼠術(shù)后健康狀態(tài)好，能夠正常飲食，喝水，大鼠體質(zhì)量沒有明顯降低，手術(shù)傷口愈合良好，無感染。這2組大鼠手術(shù)后第3天基本恢復(fù)正常。術(shù)后1周，大鼠手術(shù)側(cè)下肢長時(shí)間懸空或不敢觸地負(fù)重，步態(tài)表現(xiàn)為跛行，站立時(shí)以對側(cè)正常后肢負(fù)重為主，無肢體癱瘓。

2.2 CCI大鼠機(jī)械性刺激痛閾的變化及GBP對其變化的影響

各組手術(shù)前左、右后足機(jī)械性痛閾無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＞0.05）。CCI組自術(shù)后第4天開始出現(xiàn)患側(cè)機(jī)械性痛閾顯著下降，與對照組對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比有顯著性差異（P＜0.01）。CCI+GBP組在手術(shù)后4～8 d，出現(xiàn)機(jī)械性痛閾上升，與CCI組相比較有顯著性差異（P＜0.01），手術(shù)后第10天，其機(jī)械性痛閾與CCI組相比較沒有顯著性差異（P＞0.05）。見表1、2，圖1。

2.3大鼠DRG中TRPV1mRNA表達(dá)情況

CCI手術(shù)后，CCI組與對照組相比較，DRG中TRPV1的mRNA表達(dá)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；CCI+GBP組與CCI組比較，DRG中TRPV1的mRNA表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見圖2。

表1 大鼠CCI手術(shù)側(cè)后足機(jī)械性痛閾的變化（g）Tab.1 Changes of MWT of hind paw of rats at operation side after CCI（g）

表2 大鼠CCI非手術(shù)側(cè)后足機(jī)械性痛閾（MWT）的變化（g）Tab.2 Changes of MWT of hind paw of rats at non-operation side after CCI（g）

圖1 大鼠CCI手術(shù)側(cè)后足機(jī)械性痛閾的變化Fig.1 Changes of MWT of hind paw of rats at operation side after CCI

圖2 大鼠DRG中TRPV1mRNA表達(dá)的變化Fig.2 Changes of TRPV1mRNA expression in DRG of rats

2.4 大鼠DRG中TRPV1的蛋白表達(dá)情況

CCI手術(shù)后，CCI組與對照組相比較，DRG中 TRPV1的蛋白表達(dá)升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；CCI+GBP組與CCI組比較，DRG中TRPV1的蛋白表達(dá)降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見圖3。

圖3 大鼠DRG中TRPV1的蛋白表達(dá)變化Fig.3 Changes of TRPV1 protein expression in DRG of rats

3 討論

TRPV1受體在外周神經(jīng)中，主要分布于脊髓背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)中的初級感覺神經(jīng)元，特別是中小型神經(jīng)元。TRPV1通道與配體結(jié)合后激活膜離子通道，引起鈣離子跨膜流動(dòng)，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度改變，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號，參與多種細(xì)胞內(nèi)病理生理過程。神經(jīng)損傷后，會(huì)產(chǎn)生炎性因子，進(jìn)而激活TRPV1受體。有研究證明TRPV1受體與神經(jīng)病理性疼痛的形成相關(guān)。朱琳等［5］的研究發(fā)現(xiàn)，TRPV1受體被辣椒素激活后，會(huì)產(chǎn)生神經(jīng)興奮，隨后導(dǎo)致TRPV1受體發(fā)生脫敏反應(yīng)。在臨床應(yīng)用當(dāng)中，8%濃度的辣椒素透皮貼劑可以緩解帶狀皰疹后的神經(jīng)疼痛［6］。TRPV1受體被激活還會(huì)引起降鈣素基因相關(guān)肽的釋放，從而導(dǎo)致血管擴(kuò)張和血漿外滲，這也是產(chǎn)生神經(jīng)性炎癥的重要原因［7］。使用辣椒素可以緩解弗氏佐劑引起的炎癥痛［8］。近期有報(bào)道，辣椒辣素坐骨神經(jīng)周圍給藥可以減輕神經(jīng)松弛結(jié)扎所引起的痛覺過敏［9］。許先成等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛的模型中，大鼠背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1的表達(dá)增高與疼痛的形成和維持有關(guān)。最近的一份研究報(bào)道證實(shí)，TRPV敲除的小鼠，由外周神經(jīng)損傷引起的機(jī)械痛敏比野生型小鼠輕，并且其機(jī)制與脊髓背角中間神經(jīng)元的抑制信號的減弱有關(guān)，為TRPV在神經(jīng)病理性疼痛中的作用提供了更為直接的證據(jù)［11］。本研究通過構(gòu)建大鼠CCI的動(dòng)物模型，研究加巴噴丁對DRG中TRPV1的變化情況。

通過行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，證明大鼠CCI模型建立成功，并且在CCI模型的大鼠注射加巴噴丁，可以改善大鼠的疼痛程度。利用RT-PCR技術(shù)檢測DRG中TRPV1的基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCI手術(shù)后TRPV1表達(dá)明顯升高，注射加巴噴丁后，能夠降低由CCI手術(shù)引起的TRPV1表達(dá)增高的情況。利用Western blot技術(shù)檢測DRG中TRPV1的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明與mRNA水平的表達(dá)一致，CCI后TRPV1蛋白表達(dá)增高，加巴噴丁能夠降低CCI手術(shù)引起的TRPV1蛋白表達(dá)增高。

外周神經(jīng)損傷引起的神經(jīng)病理性疼痛，表現(xiàn)為痛覺過敏、異常痛敏、感覺缺失和自發(fā)性疼痛。外周神經(jīng)損傷后會(huì)有離子通道表達(dá)的改變，這種改變可能是受損傷神經(jīng)纖維興奮性增高和放電的重要原因。有文獻(xiàn)報(bào)道，結(jié)扎周圍神經(jīng)可以引起神經(jīng)源性的疼痛，從而導(dǎo)致DRG中TRPV1的表達(dá)增加［12］。

通過我們的研究發(fā)現(xiàn)，加巴噴丁能夠緩解CCI的行為學(xué)表現(xiàn)，并降低TRPV1在基因與蛋白水平的表達(dá)，提示我們，加巴噴丁有可能通過TRPV1通道發(fā)揮緩解疼痛的作用。TRPV1有可能是加巴噴丁的作用位點(diǎn)。

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（編輯裘孝琦）

The Effectof Gabapentin on TRPV1 in RatDRGafter CCI

YAN Ni1，LUANYong1，LIRun-jiu2
（1.Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China；2.Emergency Department，The First Affiliated HospitalofDalian MedicalUniversity，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo study the effect of Gabapentin（GBP）on the transient receptor potential vanilloid l（TRPV1）in dorsal root ganglion（DRG）of rats with chronic constriction injury（CCI）.MethodsSD male rats were used to establish CCI model and randomly divided into 3 groups，the controlgroup，the CCIgroup，and the CCI+GBPgroup.Mechanicalallodynia and thermalhyperalgesia were measured to evaluate the establishment of CCI model and the analgesic effect of GBP.At the postoperative 8 days，all rats were sacrificed and dorsal root ganglions were collected for further RT-PCR and Western-blotting analysis to detect expression of TRVP1 in DRG.ResultsThe mRNA and protein expression of TRPV1 were both significantly increased in DRG after CCI operation and GBP could decrease mRNA expression of TRPV1 gene in DRG after CCI.ConclusionThe expression ofTRPV1 was increased in DRGafter CCIoperation which wasdecreased afteradministration ofGBP.

neuralgia；Gabapentin；chronic constriction injury；rat；TRPV1

R745.4

A

0258-4646（2015）03-0234-04

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目（L2013351）

閻妮（1978-），女，主治醫(yī)師，碩士研究生.

李潤玖，E-mail：jizhenicu@163.com

2014-11-30

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：