張 莉,李文瓊
(1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院,安徽 六安237012;2.蘭州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心,甘肅 蘭州730020)
蕨菜又名拳頭菜,如意菜,龍爪菜等,含有多種對(duì)人體有益的營養(yǎng)成分[1-2]。近年來已成為深受人們熱愛的山野菜[2-4]。蕨菜中含有豐富的黃酮類物質(zhì),其含量高達(dá)7.28%[5],目前,研究發(fā)現(xiàn)蕨菜黃酮具有抗氧化以及增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等保健作用[4-7]。目前,有關(guān)蕨菜化學(xué)成分分析,尤其是黃酮類化合物的研究較多[5-7],多糖具有生理功能[8-9],但對(duì)于蕨菜多糖的相關(guān)研究報(bào)道較少,本文以皖西大別山產(chǎn)出野生蕨菜為原料,對(duì)其多糖的提取條件進(jìn)行相關(guān)研究,多糖提取的原料也可采用提取黃酮類化合物后的殘?jiān)?,因此本研究為蕨菜的進(jìn)一步的開發(fā),綜合利用蕨菜資源提供了依據(jù)。
蕨菜:2014年4月購于安徽霍山縣。
蕨菜粉:新鮮蕨菜103℃烘箱干燥,粉碎,過40目篩。
1.2.1 儀器
TD5-2自動(dòng)離心機(jī)(長沙平凡儀器表有限公司);HH-2恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);TU-1901型紫外可見光分光光度計(jì)(北京普析通用儀器設(shè)備有限公司);101AS-2型不銹鋼數(shù)顯電熱干燥箱(上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠);FA1004型電子天平(上海精科天平)等。
1.2.2 試劑
無水乙醚,無水乙醇,葡萄糖,濃硫酸,苯酚等均為國產(chǎn)分析純。
1.3.1 蕨菜粉的脫脂處理
取蕨菜粉放于烘箱,103℃烘至恒重,將蕨菜粉用濾紙包成濾紙包,用無水乙醚作為提取劑,水浴45℃加熱,索氏提取法脫脂。直到洗脫液無色,拿出濾紙包,放在通風(fēng)處等乙醚揮發(fā)到氣味比較淡時(shí)放入烘箱,103℃烘至恒重。
1.3.2 蕨菜粉的醇處理
把脫脂后的濾紙包放入索氏提取器,用無水乙醇作為提取劑,90℃恒溫水浴加熱,直到提取筒內(nèi)液體為無色,脫醇溶性雜質(zhì)。拿出過濾好的紙包,放在通風(fēng)處讓乙醇揮發(fā)至醇味比較淡時(shí)放進(jìn)干燥箱中,103℃烘至恒重。
1.3.3 蕨菜多糖含量的測(cè)定:苯酚硫-酸法[10-11]
(1)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在105℃下烘干至恒定重量后,準(zhǔn)確稱取0.100 0g置于100mL燒杯中加20mL蒸餾水溶解,轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,搖勻備用,濃度為1mg/mL,即為儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋10倍作為標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度為0.1mg/mL。
準(zhǔn)確移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中,補(bǔ)水至2mL,分別加入1mL 6%苯酚溶液,搖勻后迅速加入5mL濃硫酸,搖勻。將各試管于40℃水浴保溫30min后取出,冷水浴冷卻至室溫,在490nm處測(cè)其吸光度,以試劑空白作參比。得到回歸方程:A=9.557 1C-0.091 9,R2=0.993 3。
(2)樣品吸光度的測(cè)定
分別從樣液中取0.5mL溶液稀釋20倍后,取1.0mL稀釋液于試管中,按標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定吸光度。計(jì)算提取率。
1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)
(1)料液比單因素實(shí)驗(yàn)[13]
分別稱取蕨菜干粉置于錐形瓶中(n=2),設(shè)定水浴溫度為70℃,提取時(shí)間為2h,并且料液比為1∶10,1∶20,1∶30,1∶40和1∶50,水浴加熱回流提取。提取結(jié)束,過濾,濾液用蒸餾水定容至100mL。分別測(cè)定其中多糖含量。
(2)提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)[13]
分別稱取蕨菜干粉置于錐形瓶中(n=2),設(shè)定料液比為1∶20,提取溫度70℃,分別設(shè)定提取時(shí)間為1h,2h,3h,4h,5h,水浴加熱浸提。提取結(jié)束,過濾,濾液用蒸餾水定容至100mL。分別測(cè)定其中多糖含量。
(3)浸提溫度單因素實(shí)驗(yàn)[13]
分別稱蕨粉干粉置于錐形瓶中(n=2),設(shè)定固液比為1∶20,提取時(shí)間2h,分別設(shè)定提取溫度為50℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃,2小時(shí)后,提取結(jié)束,過濾,濾液用蒸餾水定容至100mL。分別測(cè)定其中多糖含量。
1.3.5 正交試驗(yàn)因素水平[14-15]
在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選用L9(33)正交實(shí)驗(yàn),正交因素水平如下:
表1 正交試驗(yàn)因素水平
在對(duì)蕨菜粉進(jìn)行預(yù)處理時(shí),經(jīng)過無水乙醚脫脂,無水乙醇去除醇溶性雜質(zhì),由公式:醇溶性物質(zhì)含量(%)=(未脫去醇溶性物質(zhì)濾紙包質(zhì)量-已脫去醇溶性物質(zhì)濾紙包質(zhì)量)÷蕨菜粉質(zhì)量×100%
表2 蕨菜粉醇溶性雜質(zhì)
從表2知,蕨菜內(nèi)含有醇溶性物質(zhì),經(jīng)過無水乙醇的處理,蕨菜包的質(zhì)量明顯減少,經(jīng)過計(jì)算,得出醇溶性物質(zhì)含量為2.76%。
2.2.1 料液比對(duì)蕨菜多糖提取率的影響
由圖1可知,隨料液比的加大,多糖提取率漸漸提高,固液比從1∶10到1∶20增長快速直至料液比1∶20之后,多糖提取率提高不明顯。且考慮到溶劑量的加大為后續(xù)的濃縮等步驟增加負(fù)擔(dān),因此,最合適的料液比為1∶20。
2.2.2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響
由圖2可知,提取時(shí)間小于3h時(shí),隨著提取時(shí)間的增加,提取率明顯提高,3h后整個(gè)曲線慢慢平穩(wěn),最后趨于穩(wěn)定,接著增加提取時(shí)間,但曲線還是趨于平緩,由此得出提取時(shí)間最優(yōu)為3h。
圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響
圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響
2.2.3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響
由圖3可知,從50℃到80℃,隨著提取溫度的升高,多糖得率呈現(xiàn)出先增加后下降的上升趨勢(shì),從80℃到90℃,提取溫度升高,多糖得率出現(xiàn)下降,因此,蕨菜多糖提取的最佳溫度為80℃。
圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響
根據(jù)表3、4知,極差R剖析得出,蕨菜多糖的提取率影響因素主順序?yàn)锳>B>C。即固液比對(duì)蕨菜多糖的提取率影響最小,浸提時(shí)間其次,而浸提溫度對(duì)蕨菜多糖的提取率影響最大,對(duì)提取效果影響顯著。最優(yōu)提取工藝:A3B3C2,提取率:6.23%。
表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果分析表
表4 L9(34)正交方差分析
用正交試驗(yàn)得出的最佳條件A3B3C2,即提取溫度為90℃,提取時(shí)間為4h,固液比為1∶20,進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。樣品量1.000 0g,平行實(shí)驗(yàn)3組。
表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)表明,該方法重現(xiàn)性好,結(jié)果穩(wěn)定可靠。
通過正交試驗(yàn)法優(yōu)化蕨菜多糖的提取工藝條件,對(duì)蕨菜多糖提取率的影響因素進(jìn)行了排序?yàn)椋篈>B>C,即最佳提取工藝為A3B3C2,浸提溫度為90℃,浸提時(shí)間為4h,固液比為1∶20,提取率為6.23%。
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