杜仲葉總黃酮降血脂作用研究

雷燕妮，張小斌

(商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000)

杜仲葉(Eucommia folium)為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥葉，為2010版《中國藥典》收載品，夏、秋二季枝葉茂盛時采收，曬干或低溫烘干。氣微，味微苦，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨之功效［1］。研究發(fā)現(xiàn)杜仲主要有效成分為黃酮類、環(huán)烯醚萜類、木質(zhì)素、杜仲膠等成分［2］。鄧素蘭等［3］研究表明杜仲葉中黃酮類成分含量豐富，且在民間常有飲用杜仲嫩葉茶來調(diào)節(jié)血脂的報道［4］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，杜仲具有降血脂、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等藥理作用［5］。關(guān)于杜仲藥理作用研究已相當(dāng)成熟，而對杜仲葉的研究則成為了熱點。

近些年來，隨著人們生活水平的日益提高，由飲食習(xí)慣而導(dǎo)致的高血脂、脂肪肝等疾病的發(fā)病率正逐年增加，目前，除了飲食控制和強(qiáng)化體育鍛煉之外，就是依靠藥物治療［6］。然而，理想的治療高血脂的藥物在目前仍然比較匱乏。本實驗通過建立大鼠高血脂模型，以非諾貝特為陽性對照藥，觀察杜仲葉總黃酮(Total Flavonoids of Eucommia Folium，TFEF)對高血脂動物模型的降血脂作用，以期為進(jìn)一步開發(fā)治療高血脂藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性 Wistar大鼠，體重為120～250 g，SPF級，購于陜西醫(yī)藥控股集團(tuán)生物制品有限公司，生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2008-005;使用許可證號:SYXK(陜)2008-006。

1.2 藥物與試劑

杜仲(購于商洛市香菊制藥公司，產(chǎn)地商洛，經(jīng)陜西省商洛市中藥材GAP科研工程中心張小斌教授鑒定為杜仲科植物杜仲的樹葉)。蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院);速眠新Ⅱ注射液(吉林省敦化市圣達(dá)動物藥品有限公司，批號:20120404);非諾貝特(北京京豐制藥有限公司，批號:100603);甲基硫氧嘧啶(江蘇常州康普藥業(yè)有限公司，批號:20020366);膽固醇、牛磺膽酸鈉(西安綠郡生物科技有限公司);豬油(市售板油熬制);乙腈、甲醇、甲酸、冰醋酸(天津天力化學(xué)試劑廠);甘油三酯測定試劑(浙江東甌生物工程有限公司，批號:200305002);總膽固醇測定試劑(咸寧吉斯生物科技有限公司，批號:20090428);高密度脂蛋白膽固醇(上海榮盛生物技術(shù)有限公司，批號:2401199);低密度脂蛋白膽固醇(上海榮盛生物技術(shù)有限公司，批號:2401196);水為自制純水，其他試劑均為化學(xué)分析純。

1.3 儀器

MK3酶標(biāo)分析儀，美國熱電公司;LC-2010型高效液相色譜儀，日本島津公司;759CRT型紫外可見分光光度計，上海荊和分析儀器有限公司;ACS-ZE01型電子計重秤，杭州萬特衡器有限公司;HH-600型數(shù)顯三用恒溫水箱，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所;DV114C型電子天平，美國奧豪斯;ZH-B6大鼠代謝籠，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司。

1.4 杜仲葉總黃酮的制備及組成分析

1.4.1 杜仲葉總黃酮的制備 以超聲波輔助法提取杜仲葉總黃酮［7］，按照料液比(g/mL)1∶15，超聲浸提時間2 h，反復(fù)浸提3次，超聲功率0.45 W/cm2，再采用柱層析法進(jìn)行純化。

1.4.2 杜仲葉總黃酮組成分析 參照郭孝武［8］所用方法測定杜仲葉總黃酮含量。采用HPLC法測定黃酮類成分組成及其含量，具體方法參照2010 版《中國藥典》［1］。

1.5 高血脂動物模型的建立

取健康Wistar大鼠35只，體重110～170 g，常規(guī)飼養(yǎng)，自由取食、飲水一周后觀察，無異常，隨機(jī)分為兩組:5只為正常對照組，30只為造模組，兩組均以基礎(chǔ)飼料飼喂。參照劉建文［9］所用方法制備:高脂飼料(4%的膽固醇、10%的豬油、0.2%的甲基硫氧嘧啶和86%的基礎(chǔ)飼料)，飼喂7～10天即可形成明顯的高脂血癥。造模組每天同一時間飼喂等量的高脂飼料，正常對照組在每天同一時間飼喂相等數(shù)量的基礎(chǔ)飼料，連續(xù)喂到第10天，參照文獻(xiàn)［10］中1.2.2的方法判斷造模是否成功［10］，隨后，在造模組中挑選25只造模成功的大鼠，以開展后續(xù)實驗。

1.6 進(jìn)行動物分組、給藥及樣品處理

1.6.1 將動物分組及其給藥劑量 把已經(jīng)成功造模的高血脂大鼠平均分為5組，每組6只，分別為:模型組、陽性組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每天定時給模型組和陽性組兩個對照組飼喂等體積的蒸餾水，分別用90，30，10 mg/(kg·d)的杜仲葉總黃酮對給藥組大鼠灌胃，給予陽性藥對照組15 mg/(kg·d)非諾貝特，連續(xù)給藥30天。

1.6.2 動物給藥及處理 給藥過程中，除正常對照組外，其余各組上午繼續(xù)給予高脂飼料5 g/100 g。

給藥方式:各組大鼠每天灌胃給予供試藥品1次(陽性對照藥物以及不同劑量的杜仲總黃酮)，灌胃量為1.5 mL/100 g體重，連續(xù)給藥30天。

平時觀察并進(jìn)行記錄:在代謝籠中飼養(yǎng)大鼠，將各實驗組大鼠的活動情況每天定期觀察，并記錄其進(jìn)食量與進(jìn)水量，于每周同一時間稱量大鼠體重;最后一次給藥結(jié)束后，將各組大鼠禁食14小時，再次進(jìn)行體重稱量之后處死，麻醉(肌肉注射速眠新Ⅱ)，抽取其新鮮血液，并將血清分離，將其肝臟組織取出后制成組織勻漿，分別用1.2中試劑盒測定大鼠血清和肝臟相關(guān)指標(biāo)［11-14］。

1.7 血脂指標(biāo)測定

所有血液和肝組織指標(biāo)均采用試劑盒檢測，嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行，以酶法或比色法測定。

1.8 數(shù)據(jù)處理

剔除異常數(shù)值，所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，結(jié)果均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，對數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉總黃酮成分分析

杜仲葉中黃酮得率為20.3%，比色法測得制備的杜仲葉黃酮提取物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為83.7%，純度相對較高。杜仲葉總黃酮的HPLC分析見圖1，可見杜仲葉總黃酮主要由4種成分組成，分別是山奈酚、槲皮素、紫云英苷和蘆丁。

圖1 杜仲葉總黃酮HPLC圖Fig.1 The total flavonoids from Eucommia ulmoides leaves HPLC diagram

2.2 杜仲葉總黃酮對大鼠體重的影響

在整個試驗中，所有試驗動物均能正常生長，活動情況亦未出現(xiàn)異常現(xiàn)象，無異常死亡情況。各組試驗動物數(shù)量均控制在5～8只范圍內(nèi)，使其符合藥理活性實驗的要求。最后，全部大鼠處理均符合實驗動物倫理學(xué)要求。從表1可以看出，各組大鼠體重均有所增加，但各組間每周平均體重差異不明顯(P＞0.05)。與模型對照組比較發(fā)現(xiàn)，在試驗結(jié)束之前，禁食后高劑量組的最終體重有顯著降低(P＜0.05)，其余各組無顯著性差異(P ＞0.05)。

表1 杜仲葉總黃酮對大鼠體重的影響Tab.1 Effect of total flavonoids of Eucommia ulmoides leaves on weight of rats(x ±s，g，n=6)

2.3 杜仲葉總黃酮對高血脂大鼠血脂指標(biāo)的影響

試驗結(jié)束之后，經(jīng)過對樣品進(jìn)一步處理和檢測發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，各模型組均有顯著性或極顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，說明本次成功完成造模試驗。經(jīng)過對大鼠喂食杜仲葉總黃酮一個月，對比給藥組(高、中、低劑量組和陽性組)與模型組中的總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、脂蛋白以及載脂蛋白B含量，以上各成分含量均有不同程度降低(P＜0.05或P＜0.01);而高密度脂蛋白和載脂蛋白A則有不同程度升高，如表2和表3。當(dāng)給藥劑量為75 mg·kg-1時，TC，HDL-C和LP-a指標(biāo)水平均高于正常組，而TG，LDL-C，APo-A和APo-B的水平略低于正常組;同時，與相同劑量的陽性藥物相比，給藥組的降血脂作用要稍遜一籌，但無顯著性差異(P＞0.05)。

表2 杜仲葉總黃酮對大鼠血脂水平的影響Tab.2 Effect of total flavonoids of Eucommia ulmoides leaf on serum lipid level in rats(x ± s，mmol·L-1，n=6)

表3 杜仲葉總黃酮對大鼠血脂水平的影響Tab.3 Effect of total flavonoids of Eucommia ulmoides leaf on serum lipid level in rats(x ± s，mmol·L-1，n=6)

2.4 杜仲葉總黃酮對高血脂大鼠肝臟組織中脂質(zhì)含量的影響

由表4可見，在模型組中，大鼠肝臟組織中的總膽固醇和甘油三酯含量與正常組比較，有顯著增高(P＜0.05或P＜0.01);在陽性對照組及杜仲葉總黃酮給藥組(高、中劑量組)與正常組相比較，其肝臟組織中甘油三酯和總膽固醇含量有顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);而與模型組相比較，正常組肝臟組織中的所有指標(biāo)均低于其他組。另外，肝臟指數(shù)無明顯變化。

表4 杜仲葉總黃酮對大鼠肝組織中脂質(zhì)含量及肝臟指數(shù)的影響Tab.4 Effect of total flavonoids of Eucommia ulmoides leaveson lipid content and index of liver in rat liver(x ± s，n=6)

3 結(jié)論與討論

中藥復(fù)方治療高血脂，辨證施治，可達(dá)到標(biāo)本兼治的目的，其降脂作用緩和且藥效持久，副作用小。因而，研制出具有降高血脂的新型中藥就顯得很有必要［6］。

現(xiàn)代研究表明，血脂長期過高，易引發(fā)動脈粥樣硬化和冠心病等心腦血管疾病。動脈硬化通常不易察覺，通過不定期檢查血液中有關(guān)血脂指標(biāo)含量，可及時發(fā)現(xiàn)并預(yù)防動脈硬化。通過對實驗性高血脂大鼠血脂水平的檢測研究，與模型對照組相比較，發(fā)現(xiàn)杜仲葉總黃酮劑量組能夠明顯改善高血脂大鼠的血脂水平，并且呈現(xiàn)一定的量-效關(guān)系，表明杜仲葉總黃酮具有較好的降血脂作用。綜上所述，杜仲葉總黃酮具有降低高血脂模型大鼠血脂水平的作用。

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