麥門冬合千金葦莖湯抑制A549細(xì)胞增殖作用及其機(jī)制

周宇輝 詹瑧 唐于平 段金廒 張旭

肺癌是當(dāng)前發(fā)病率和死亡率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤，對(duì)放療、化療和免疫治療的敏感性均較差，尋找有效的治療方法是當(dāng)前肺癌治療亟需解決的問題。采用抗腫瘤中藥治療惡性腫瘤是具有中國(guó)特色的腫瘤治療方式。麥門冬合千金葦莖湯分別是《金匱要略》記載的主治肺痿肺癰的中醫(yī)古方，麥門冬湯主治“肺中氣陰虧虛”、千金葦莖湯清肺化痰活血，兩方合用，具有清熱養(yǎng)陰、潤(rùn)肺降氣、祛瘀排膿之功，與現(xiàn)代中醫(yī)所認(rèn)為之肺癌的主要病機(jī)“氣陰兩虛、熱毒痰瘀互結(jié)”[1]基本相符?，F(xiàn)代也有人以其中一首方劑加味的方式應(yīng)用于臨床來(lái)治療肺癌，本研究以人肺腺癌細(xì)胞系（A549）為主要對(duì)象，研究麥門冬湯合千金葦莖湯有效部位群對(duì)肺癌細(xì)胞株的抑制作用及可能的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 肺癌細(xì)胞株A549和人胚肺成纖維細(xì)胞HFL-1均購(gòu)自中科院上海生物細(xì)胞所。

1.1.2 藥物及處理 麥門冬湯合千金葦莖湯萃取部位，由南京中醫(yī)藥大學(xué)方劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，將麥門冬合千金葦莖湯（原藥材總計(jì)21.6 kg）進(jìn)行水煎煮并揮發(fā)油提取，得到揮發(fā)油部分和水提液部分。將水提液濃縮后醇沉，醇溶液回收溶劑至無(wú)醇后，依次用環(huán)己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，最后共得到8個(gè)部分樣品，樣品均配制成100 mg/mL的母液，-20oC保存，臨用前解凍。

1.1.3 主要試劑 培養(yǎng)液RPMI-1640為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；優(yōu)級(jí)新生牛血清為杭州四季青生物制品廠產(chǎn)品；胰蛋白酶為AMRESCO公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）為AMRESCO公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazoliumbromide, MTT]為AMRESCO公司產(chǎn)品；吉姆薩染液購(gòu)自南京建成生物工程研究所；碘化丙啶（propidium iodide, PI）和RNaseA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Hoechst 33258染色劑為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；抗EGFR抗體和抗ERK1/2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；抗β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)GenScript公司；辣根過氧化物酶偶聯(lián)羊抗兔和羊抗鼠IgG抗體均購(gòu)自美國(guó)Immunology Consultants Laboratory公司；化學(xué)發(fā)光試劑ECL購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器及設(shè)備 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific Forma），倒置顯微鏡（美國(guó)Olympus），酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad），F(xiàn)ACScan型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson），Z-32K型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)HERMLE），-70oC 309L型低溫冰箱（日本SANYO），電泳儀（美國(guó)Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549和人胚肺細(xì)胞HFL-1用含10%小牛血清的RPMI-1640（青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL，pH7.4）培養(yǎng)液，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別用不同濃度的部位樣品處理細(xì)胞，未加藥組為對(duì)照組。

1.2.2 細(xì)胞增殖活性測(cè)定 采用噻唑藍(lán)（MTT）比色法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞和HFL-1細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，設(shè)對(duì)照組和不同部位濃度處理組（1 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL），每組6個(gè)復(fù)孔。于作用后72 h，每孔加入MTT（5 mg/mL）20 μL，37oC下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入DMSO溶解藍(lán)紫色顆粒后，以Ascent酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)490 nm測(cè)定吸光度值（A值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值×100%。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)過夜，于倒置顯微鏡下觀察不同部位分別作用A549細(xì)胞后24 h、48 h及72 h時(shí)細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4 集落形成測(cè)定 采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，以250個(gè)細(xì)胞/孔均勻接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞貼附，分別加入用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度為1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL的部位樣品，每組3個(gè)平行孔，置37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，去除培養(yǎng)液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆薩染液染色10 min，自來(lái)水沖洗，晾干，用Quantity One軟件計(jì)算克隆數(shù)，按以下公式計(jì)算克隆形成率和克隆形成抑制率?？寺⌒纬陕剩?）=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%；克隆形成抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù)）×100%。

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)周期分析 采用PI染色檢測(cè)細(xì)胞周期。收集藥物作用72 h的A549細(xì)胞，用PBS洗滌，1 000 rpm、10 min離心2次，將細(xì)胞沉淀充分混勻，緩慢加入1 mL冰乙醇（70%）固定保存于-20oC。檢測(cè)前PBS洗滌去除乙醇，1 200 rpm、10 min離心2次，加入PI（50 μg/mL）染液混均，4oC避光孵育30 min后，用流式細(xì)胞儀（美國(guó)Becton Dickinson公司）進(jìn)行DNA含量和細(xì)胞周期分析。所用軟件為Cellqest，低于G1期的細(xì)胞（亞G1期）為凋亡細(xì)胞，其占細(xì)胞總數(shù)的比例為凋亡細(xì)胞比例。

1.2.6 凋亡的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)檢測(cè) 采用Hoechst 33258熒光染色。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，均勻接種于預(yù)置蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別以RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋的終濃度為1 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL的部位處理，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，72 h后，吸棄培養(yǎng)液，進(jìn)行Hochest 33258染色，方法參照說明書進(jìn)行，染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果判斷：正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻熒光，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光，甚至可見DNA熒光碎片。

1.2.7 Western blot檢測(cè) 用裂解液處理收集細(xì)胞，以蛋白提取樣品作SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉后加入一抗（抗體稀釋濃度為1:200），PBST洗膜3次，每次10 min；加入二抗工作液（稀釋濃度為1:5 000），PBST洗膜3次，每次10 min；浸于適量ECL化學(xué)發(fā)光試劑中（A液:B液=1:1）1 min，取出，室溫條件下用保鮮膜包置于暗盒中，壓片曝光30 s-3 min，洗片，用Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0行統(tǒng)計(jì)分析，所有定量數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT比色法檢測(cè)的結(jié)果 麥門冬湯合千金葦莖湯8個(gè)提取部位分別作用A549細(xì)胞72 h后，第6部位即乙酸乙酯萃取部位各濃度細(xì)胞存活率明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），提示乙酸乙酯萃取部位有明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，10 μg/mL和1 μg/mL乙酸乙酯萃取部位作用的細(xì)胞存活率＜50%，引起的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯大于100 μg/mL乙酸乙酯萃取部位（P＜0.05）（圖1）。

2.2 不同濃度乙酸乙酯萃取部位對(duì)A549細(xì)胞和HFL-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 作用72 h后，不同濃度的乙酸乙酯萃取部位均有促進(jìn)HFL-1細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制A549細(xì)胞的作用，同一濃度，HFL-1細(xì)胞存活率明顯高于A549細(xì)胞存活率，以10 μg/mL乙酸乙酯萃取部位組最為明顯，引起A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用明顯高于100 μg/mL（P＜0.01）；同時(shí)，促進(jìn)HFL-1細(xì)胞生長(zhǎng)作用明顯高于其他濃度的藥物（P＜0.01）（圖2）。

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 在倒置顯微鏡下可見正常對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，分布密集，多呈多角形，細(xì)胞走向趨于一致，多角形細(xì)胞的細(xì)胞體飽滿、有2-3個(gè)扁平而長(zhǎng)的突起，細(xì)胞核較大，呈卵圓形且多居中。用乙酸乙酯萃取部位處理A549細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞間隔增寬，突起縮短。細(xì)胞質(zhì)減少，細(xì)胞體縮小，黑色顆粒增多（圖3）。

2.4 對(duì)A549細(xì)胞集落形成的影響 經(jīng)不同濃度乙酸乙酯萃取部位處理后的細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少（圖4），說明乙酸乙酯萃取部位抑制了A549細(xì)胞的克隆形成。10 μg/mL乙酸乙酯萃取部位組較對(duì)照組克隆形成率明顯降低，克隆形成抑制率顯著升高，克隆形成抑制率可達(dá)＞70%（P＜0.01）（表1）。

2.5 細(xì)胞周期分析 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見表2，10 μg/mL乙酸乙酯萃取部位作用后細(xì)胞周期與對(duì)照組的細(xì)胞相比細(xì)胞周期的分布無(wú)明顯改變（P＞0.05）。與對(duì)照組（圖5A）比較，實(shí)驗(yàn)組G1期峰前出現(xiàn)顯著的凋亡峰（圖5B），同時(shí)實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)比對(duì)照組顯著增加（P＜0.01），表明乙酸乙酯萃取部位能夠誘導(dǎo)A549細(xì)胞細(xì)胞凋亡。

2.6 Hoechst 33258染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 經(jīng)乙酸乙酯萃取部位不同濃度作用72 h后，用Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡結(jié)果顯示（圖6），對(duì)照組細(xì)胞所發(fā)熒光較弱，較均勻，經(jīng)乙酸乙酯萃取部位處理后，細(xì)胞數(shù)量減少，出現(xiàn)有高亮藍(lán)色的典型凋亡小體，其細(xì)胞皺縮、細(xì)胞核固縮、碎裂、發(fā)泡、體積變小，熒光強(qiáng)度增高。說明乙酸乙酯萃取部位有明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的作用。

表 1 不同濃度乙酸乙酯萃取部位處理A549細(xì)胞后克隆形成率及克隆形成抑制率的比較Tab 1 Comparion of clone-formation rate and clone-formation inhibition rate among A549 cells treated with different concentration of ethyl acetate extract

表 2 乙酸乙酯萃取部位對(duì)A549細(xì)胞周期及凋亡率的影響Tab 2 The effects of ethyl acetate extract on cell cycle and apoptotic rate of A549 cells

圖 1 麥門冬湯合千金葦莖湯8個(gè)部位對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig 1 The effect of eight extracts form Maimendong & qianjinweijing tang on A549 cells growth

圖 2 乙酸乙酯萃取部位對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Fig 2 The effect of ethyl acetate extract on cells growth

圖 3 不同濃度乙酸乙酯萃取部位對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響（×200）Fig 3 Proliferative inhibition of different concentrations of ethyl acetate extract on A549 cells (×200) . A: Control group; B: 1 μg/mL ethyl acetate extract group; C: 10 μg/mL ethyl acetate extract group; D: 100 μg/mL ethyl acetate extract group.

圖 4 不同濃度乙酸乙酯萃取部位處理A549后細(xì)胞克隆形成情況Fig 4 The effect of different concentrations of ethyl acetate extract on colony formation of A549 cells. A: Control group; B: 1 μg/mL ethyl acetate extract group; C: 10 μg/mL ethyl acetate extract group; D: 100 μg/mL ethyl acetate extract group.

2.7 Western blot檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組A549細(xì)胞相比，不同濃度乙酸乙酯部位處理組的細(xì)胞β-actin蛋白表達(dá)相當(dāng)，而細(xì)胞的EGFR和ERK1/ERK2蛋白表達(dá)量均有下降，其中以100 μg/mL最為明顯，10 μg/mL和1 μg/mL次之（圖7），說明乙酸乙酯萃取部位能夠下調(diào)EGFR-ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3 討論

肺癌是世界各國(guó)常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中增長(zhǎng)是最快的，是目前人類癌癥死亡的主要原因，并被認(rèn)為是當(dāng)今世界對(duì)人類健康與生命危害最大的惡性腫瘤。在我國(guó)，肺癌占惡性腫瘤發(fā)病、死亡的首位。大部分患者就診時(shí)已處于中晚期階段，現(xiàn)行的常規(guī)的治療手段效果不甚理想。近年來(lái)，中醫(yī)藥治療肺癌在穩(wěn)定病灶、延長(zhǎng)生存時(shí)間、改善生存質(zhì)量等方面發(fā)揮了顯著的療效，不僅單用有效，而且可與手術(shù)、放療、化療聯(lián)合運(yùn)用提高臨床療效和減少毒副反應(yīng)，應(yīng)用廉價(jià)的

圖 5 乙酸乙酯萃取部位作用A549細(xì)胞流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果Fig 5 Apoptosis of lung cancer cell line A549 induced by ethyl acetate extract. A: Control group; B: Ethyl acetate extract group.

圖 6 不同濃度乙酸乙酯萃取部位誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變（×400）Fig 6 Ethyl acetate extract-induced apoptotic morphologic changes of A549 cells (×400). A: Control group; B: 1 μg/mL ethyl acetate extract group; C:10 μg/mL ethyl acetate extract group; D: 100 μg/mL ethyl acetate extract group.

圖 7 乙酸乙酯萃取部位對(duì)A549細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig 7 Effects of ethyl acetate extract on expression of apoptosisrelated genes in A549 cells

2中藥治療肺癌在臨床實(shí)踐中日益顯示出優(yōu)勢(shì)。從多靶點(diǎn)綜合考慮治療肺癌是我國(guó)中醫(yī)藥治療肺癌的特色之一，但中藥復(fù)方的成分復(fù)雜、整體層次研究困難，單一成分研究較容易，但又常失去中醫(yī)藥的特色。因此，對(duì)于有效部位群的藥效相關(guān)性研究就顯得尤為重要，它在中藥現(xiàn)代化研究中起著承前啟后的作用。

體外實(shí)驗(yàn)是目前抗腫瘤藥物研究的重要方法，本研究采用人肺腺癌A549細(xì)胞為主要研究對(duì)象，對(duì)中藥復(fù)方麥門冬湯合千金葦莖湯有效部位群的體外抑癌作用進(jìn)行了研究。本研究的檢測(cè)結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取部位能有效地抑制A549細(xì)胞的增殖，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。細(xì)胞無(wú)限制快速生長(zhǎng)是惡性腫瘤細(xì)胞的主要特征之一，從光鏡觀察及MTT細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)證實(shí)，乙酸乙酯萃取部位對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，集落形成實(shí)驗(yàn)也得出一致的結(jié)論，克隆形成率是體外抗癌藥物敏感性篩選的重要方法之一，由結(jié)果可看出乙酸乙酯萃取部位可以抑制A549細(xì)胞克隆形成能力，而克隆形成能力可反應(yīng)細(xì)胞的增殖能力和群體依賴性，克隆形成率的降低說明經(jīng)乙酸乙酯萃取部位干預(yù)后腫瘤細(xì)胞群中有增殖能力的干細(xì)胞比例減少，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。在以上結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步探討乙酸乙酯萃取部位對(duì)A549細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞在G1峰前出現(xiàn)了明顯凋亡峰，提示凋亡細(xì)胞數(shù)增多，這表明乙酸乙酯萃取部位能夠誘導(dǎo)肺腺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡是基因調(diào)控的細(xì)胞自主死亡過程，主要表現(xiàn)為染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核固縮，進(jìn)而核碎裂形成凋亡小體。Hoechst染色細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染。本研究顯示，經(jīng)乙酸乙酯萃取部位干預(yù)72 h后的各組細(xì)胞，用Hoechst 33258染色熒光顯微鏡下觀察，均能找到細(xì)胞核致密濃縮發(fā)白發(fā)亮的細(xì)胞，其細(xì)胞核染色質(zhì)凝集、邊移、并發(fā)生碎裂、出現(xiàn)凋亡小體，證實(shí)乙酸乙酯萃取部位可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，綜合以上結(jié)果，提示乙酸乙酯萃取部位誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其顯著抑制A549細(xì)胞增殖的重要途徑。

細(xì)胞凋亡的機(jī)制中，凋亡的細(xì)胞因子受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑一直被人們所關(guān)注，目前認(rèn)為絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase, MAPK）信號(hào)傳導(dǎo)通路的異常激活與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extra cellular signal regulated kinase, ERK）是MAPK通路的主要成員，其Raf-MEK-ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是最具代表性的MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一，也是研究的較為清楚的通路[3]，主要介導(dǎo)促有絲分裂和抗凋亡信號(hào)，可以通過抑制凋亡促進(jìn)細(xì)胞存活，參與細(xì)胞的增殖、分化以及多種代謝功能。研究[4]發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌形成早期階段ERK通路已被激活。Brognard等[5]在對(duì)19種組織分型不同的非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，17種存在ERK通路激活現(xiàn)象，提示在非小細(xì)胞肺癌中ERK1/2有促進(jìn)細(xì)胞生存和產(chǎn)生化療耐藥的作用。在轉(zhuǎn)移方面，ERK1/2的激活除了能促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表達(dá)，引起血管生成，促進(jìn)肺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]，還參與由糖蛋白聚集素（clusterin, CLU）調(diào)節(jié)的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變（mesenchymal-to-epithelial transition, MET）和肺腺癌的惡性行為[7]。由此可見，ERK蛋白的過表達(dá)在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中起著重要的促進(jìn)作用。其主要的作用機(jī)制為細(xì)胞外生長(zhǎng)因子（EGF或TGF-α）與膜受體EGFR結(jié)合引起受體二聚化，氨基酸殘基磷酸化，從而激活細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的Ras-Raf通路，活化的Ras-Raf可進(jìn)一步激活MEK-ERK通路，后者進(jìn)入細(xì)胞核作用與c-Jun、c-Fos等多種轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致細(xì)胞增殖或分化。ERK是Ras/Raf/MEK/ERK通路上與細(xì)胞核最為靠近的成員，ERK1與ERK2蛋白有90%相同的氨基酸序列，并在體外有相同的作用底物，二者有功能上的重疊。本研究結(jié)果顯示，乙酸乙酯萃取部位作用于A549細(xì)胞后，引起ERK1/ERK2表達(dá)下調(diào)，說明其激酶活性下降，同時(shí)引起上游信號(hào)EGFR表達(dá)降低，提示EGFR-ERK/MAPK信號(hào)通路是乙酸乙酯萃取部位作用靶點(diǎn)之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證明乙酸乙酯萃取部位在抑制A549細(xì)胞增殖的同時(shí)使細(xì)胞趨于凋亡，其作用機(jī)理與ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑密切相關(guān)，而乙酸乙酯萃取部位作為細(xì)胞外信號(hào)分子，作用于細(xì)胞后，其受體和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，以及如何啟動(dòng)細(xì)胞凋亡基因表達(dá)是值得我們進(jìn)一步研究的課題。因此，對(duì)有效部位群及化合物作用肺癌信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及相關(guān)機(jī)制的研究值得進(jìn)一步探討，同時(shí)為豐富中醫(yī)經(jīng)典復(fù)方有效作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。