氣相色譜法測定菜粕異硫氰酸酯不確定度評定

張鳳枰 杜雪莉 趙 艷 李應(yīng)東 劉耀敏

(通威股份有限公司1，成都 610041)(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院2，上海 201306)

氣相色譜法測定菜粕異硫氰酸酯不確定度評定

張鳳枰1,2杜雪莉1趙 艷1李應(yīng)東1劉耀敏1

(通威股份有限公司1，成都 610041)
(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院2，上海 201306)

對采用氣相色譜內(nèi)標法測定菜粕中的異硫氰酸酯含量的測量不確定度進行了評定。建立測量模型，分析確定菜粕中異硫氰酸酯含量的不確定度來源，并對測量過程中的不確定度分量進行逐層分析與合成，當菜粕的丙烯基異硫氰酸酯含量為99.2 mg/kg時，得到其合成標準不確定度和擴展不確定度分別為2.2、4.4 mg/kg。結(jié)果表明，校正因子測定引入的不確定度分量對合成標準不確定度的貢獻最大，樣品重復(fù)測定、回收試驗和添加內(nèi)標溶液帶來的不確定度分量也不容忽視，試樣稱量對總不確定度的貢獻最小，為采用該方法測定菜籽餅粕中異硫氰酸酯含量的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

測量不確定度評定 氣相色譜 內(nèi)標法 丙烯基異硫氰酸酯 菜粕

測量不確定度是指根據(jù)所獲信息表征賦予被測量值分散性的非負參數(shù)[1]，通過對測量不確定度的評定，不僅能夠給出測量結(jié)果的可信程度，而且還可以對測量結(jié)果的質(zhì)量進行定量評定，使測量結(jié)果可以在國際和國內(nèi)不同檢測機構(gòu)間進行量值比對和實驗室間數(shù)據(jù)共享。菜籽餅粕營養(yǎng)豐富，為潛力很大的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料資源，已廣泛應(yīng)用于飼料加工業(yè)，但菜籽餅粕中含有硫苷(Glucosinolate)，在芥子酶作用下會轉(zhuǎn)化成異硫氰酸酯(Isothiocyanate，ITC)、噁唑烷硫酮(Oxazolidine，OZT)、硫氰酸酯(Thiocyanate，TC)和腈類(Nitriles)等毒素，對動物機體有很大毒害作用。國家飼料衛(wèi)生標準規(guī)定菜籽餅粕的異硫氰酸酯允許量為<4 000 mg/kg[2]，氣相色譜法測定飼料中異硫氰酸酯的含量是國家標準檢測方法[3]。有關(guān)異硫氰酸酯的化學(xué)性質(zhì)、生物活性、測定方法等報道較多[4-7]，但采用氣相色譜法測定菜粕中異硫氰酸酯含量的測量不確定度評定，國內(nèi)外鮮見公開報道。本試驗以氣相色譜內(nèi)標法測定飼料中丙烯基異硫氰酸酯的含量為例，按照最新的國際標準ISO/IEC Guide98-3—2008《測量不確定度表示指南》[1]、《CNAS-GL05:2011 測量不確定度要求的實施指南》[8]及《CNAS-GL06:2006 化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[9]，建立測定過程中各分量的測量模型，對測定過程中各分量不確定度來源進行分析，在對各分量進行量化的基礎(chǔ)上，合成得到了測定結(jié)果的標準不確定度和擴展不確定度，旨在為飼料生產(chǎn)企業(yè)菜粕的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料

7890A氣相色譜儀，配7683B自動進樣器、FID檢測器：美國Agilent科技有限公司；CP224S、CP225D電子分析天平：德國Sartorius公司；ZHWY-2112F恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；Allegra 64R冷凍離心機：美國Beckman Coulter公司。

丙烯基異硫氰酸酯、正丁基異硫氰酸酯標準品(99.0±1.0)%：美國Sigma-Aldrich公司；二氯甲烷、檸檬酸、磷酸氫二鈉、無水硫酸鈉、丙酮(均為分析純)：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；試驗用水為Milli-Q Gradient超純水。

菜粕樣品：通威股份有限公司技術(shù)中心提供。

1.2 異硫氰酸酯標準溶液的制備

按GB/T 13087—1991《飼料中異硫氰酸酯的測定方法》進行[3]。

正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液：準確稱取50 mg正丁基異硫氰酸酯標準品，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL，得1.000 mg/mL內(nèi)標儲備溶液；準確移取10 mL內(nèi)標儲備溶液于100 mL容量瓶中，用二氯甲烷稀釋定容，得0.100 0 mg/mL內(nèi)標使用溶液。

丙烯基異硫氰酸酯標準溶液：準確稱取1 000 mg丙烯基異硫氰酸酯標準品，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL，得20.00 mg/mL丙烯基異硫氰酸酯標準儲備溶液；準確分別移取標準儲備液5.0 mL于10、25、50、100 mL容量瓶內(nèi)，用二氯甲烷稀釋定容，得10.00、4.00、2.00、1.00 mg/mL丙烯基異硫氰酸酯標準使用液；分別準確移取4.00 mg/mL丙烯基異硫氰酸酯標準使用液5.0 mL于50、100 mL，用二氯甲烷稀釋定容，得0.40、0.20 mg/mL丙烯基異硫氰酸酯標準使用液。

1.3 樣品前處理方法

稱取約2.2 g試樣(精確至0.000 1 g)于具塞錐形瓶中，加入50 mL pH 7緩沖液，30 mg酶制劑，0.1 mg/mL丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液10 mL，25 ℃、120 r/min震蕩2 h，將具塞三角瓶中內(nèi)容物轉(zhuǎn)入離心試管中，5 000 r/min離心5 min，用滴管吸取少量離心管下層有機相溶液，通過鋪有少量無水硫酸鈉層和脫脂棉的漏斗過濾，得澄清濾液備用，待氣相色譜分析。

1.4 氣相色譜條件

色譜柱：HP-FAAP彈性石英毛細管柱，30 m×0.32 mm×0.25 μm；色譜柱起始溫度60℃，以5 ℃/min升到120 ℃，保持2 min；進樣口溫度：160 ℃；檢測器溫度：170 ℃；載氣：高純氮，柱流速：2.0 mL/min；氫氣流速：35 mL/min；空氣流速：400 mL/min；尾吹流速：20 mL/min；分流比：50∶1；進樣量1 μL。

1.5 測定

按上述色譜條件，待基線穩(wěn)定后，標樣、試樣溶液分別等體積進樣，進行氣相色譜分析，以樣品峰的保留時間與異硫氰酸酯標準品的保留時間定性，內(nèi)標法計算異硫氰酸酯的含量。

2 測量模型

式中：X為試樣中丙烯基異硫氰酸酯的含量/mg/kg；F為校正因子；me為10 mL正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標的質(zhì)量/mg；Sa為丙烯基異硫氰酸酯的峰面積；Se為正丁基異硫氰酸酯的峰面積；m為為試樣質(zhì)量/g。

3 不確定度來源分析

按照測量模型和測量方法，分析其不確定度來源有：校正因子測定產(chǎn)生的不確定度、樣品稱量產(chǎn)生的不確定度、添加正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液產(chǎn)生的不確定度、樣品重復(fù)測定產(chǎn)生的不確定度以及回收率產(chǎn)生的不確定度。

3.1 校正因子測定產(chǎn)生的相對標準不確定度urel(f)

分別準確移取0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0 mg/mL丙烯基異硫氰酸酯標準使用液1.0 mL于試管中，再分別加入1.000 mg/mL正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標儲備溶液1.0 mL，渦旋混合2 min，得到系列混合標準溶液，經(jīng)氣相色譜分析，根據(jù)丙烯基異硫氰酸酯和正丁基異硫氰酸酯的質(zhì)量、峰面積計算校正因子。

3.1.1 配制正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標儲備溶液產(chǎn)生的相對標準不確定度urel(IS1)(測量不確定度B類評定)

3.1.1.1 正丁基異硫氰酸酯標準品引入的相對標準不確定度urel(ISp)

由標準物質(zhì)證書可知：正丁基異硫氰酸酯的純度為99.0%，最大允差為1.0%，因此可按均勻分布[1]計算出其相對標準不確定度為：

3.1.1.2 標準品稱量產(chǎn)生的相對標準不確定度urel(ISm)

3.1.1.3 正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液配制過程中器量校準引起的相對標準不確定度urel(ISV1)

使用容量瓶、單標線吸量管所導(dǎo)致的體積相對標準不確定度主要有3個分量：1)體積校準不確定度引起的相對標準不確定度分量urel1(V)，可按JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[10]規(guī)定的容量允差按三角分布計算；2)充滿液體至刻度的變動性引起的相對標準不確定度分量urel2(V)，可通過A類不確定度評定得到，具體做法為連續(xù)核查10次排出的體積的相對標準偏差(通過稱量決定)；3)溶液溫度與檢定標準溫度(20 ℃)不同引起的相對標準不確定度分量urel3(V)，20 ℃水的體積膨脹系數(shù)為0.000 21/℃，按均勻分布求得。

表1 容量瓶、單標線吸量管的相對標準不確定度

設(shè)標準溶液溫度與檢定標準溫度的溫差為5 ℃，使用容量瓶、單標線吸量管引起的體積相對標準不確定度urel(V)計算結(jié)果見表1。

本次標液配制僅使用了50 mL容量瓶，由使用容量瓶引起的體積相對標準不確定度為：

因此，配制正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標儲備溶液產(chǎn)生的相對不確定度為：

=0.59%

3.1.2 配制丙烯基異硫氰酸酯標準溶液產(chǎn)生的相對不確定度urel(S)(測量不確定度B類評定)

3.1.2.1 丙烯基異硫氰酸酯標準品引入的相對標準不確定度urel(Sp)

由標準物質(zhì)證書可知：丙烯基異硫氰酸酯的純度為99.0%，最大允差為1.0%，因此可按均勻分布[1]計算出其相對標準不確定度為：

3.1.2.2 丙烯基異硫氰酸酯標準品稱量產(chǎn)生的相對標準不確定度urel(Sm)

3.1.2.3 丙烯基異硫氰酸酯溶液配制過程中容量瓶和吸量管引入的相對標準不確定度urel(SV)

本次標液配制使用了100、50、25、10 mL容量瓶和5 mL單標線吸量管，由使用容量瓶、單標線吸量管引起的體積相對標準不確定度為：

urel(SV)=

=0.48%

因此，配制丙烯基異硫氰酸酯標準溶液產(chǎn)生的相對不確定度為：

=0.75%

3.1.3 配制系列混合標準溶液過程中吸量管引入的測量不確定度urel(V1)(測量不確定度B類評定)

本次標液配制僅使用了1 mL單標線吸量管，由使用單標線吸量管引起的體積相對標準不確定度為：

由于品種、產(chǎn)地不同，菜粕的丙烯基異硫氰酸酯含量差異較大，為保證校正因子的準確性，試驗設(shè)置了6個濃度梯度，每個濃度梯度進樣2針，得到丙烯基異硫氰酸酯、丁烯基異硫氰酸酯色譜峰面積，根據(jù)添加的質(zhì)量、峰面積計算校正因子，結(jié)果見表2。

表2 校正因子測定結(jié)果

標準不確定度采用平均值的標準偏差：

=0.004 1

校正因子測定過程中產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

因此，校正因子測定產(chǎn)生的相對標準不確定度為：

=1.74%

3.2 樣品稱量產(chǎn)生的相對標準不確定度urel(m)(測量不確定度B類評定)

3.3 添加正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液產(chǎn)生的相對不確定度urel(me)(測量不確定度B類評定)

這部分的不確定度由以下2個分量合成：配制正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液產(chǎn)生的不確定度urel(IS2)、加入內(nèi)標溶液體積引入的相對標準不確定度urel(V2)。

3.3.1 配制正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液產(chǎn)生的相對不確定度urel(IS2)

3.3.1.1 正丁基異硫氰酸酯標準品引入的相對標準不確定度urel(ISp)

計算同3.1.1.1。

3.3.1.2 標準品稱量產(chǎn)生的相對標準不確定度urel(ISm)

計算同3.1.1.2。

3.3.1.3 正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液配制過程中器量校準引起的相對標準不確定度urel(ISV2)

本次標液配制使用了100、50 mL容量瓶和10 mL單標線吸量管，由使用容量瓶、單標線吸量管引起的體積相對標準不確定度為：

配制正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液產(chǎn)生的相對不確定度為：

=0.60%

3.3.2 加入內(nèi)標溶液吸量管引入的相對標準不確定度urel(V2)

加入內(nèi)標溶液使用10 mL單標線吸量管引入的不確定度為：

因此，添加正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液產(chǎn)生的相對不確定度為

3.4 樣品含量重復(fù)測定產(chǎn)生的相對標準不確定度urel(Xrep)(測量不確定度A類評定)

樣品混合均勻程度、儀器設(shè)備的分辨率和穩(wěn)定性、實驗人員操作技能等是影響測定結(jié)果的重要因素，樣品含量重復(fù)測定的相對標準不確定度綜合體現(xiàn)了樣品均勻性、質(zhì)量測量、體積測量、儀器測量中重復(fù)性的隨機影響。按上述方法平行測定樣品8次，測定結(jié)果及計算數(shù)據(jù)見表3。

表3 樣品重復(fù)測量結(jié)果

樣品重復(fù)測定產(chǎn)生的相對不確定度為：

因樣品重復(fù)測定已考慮儀器的分辨率和穩(wěn)定性，評定測量不確定度時不再另外計算儀器檢測器給出的不確定度。

3.5 回收試驗引入的相對標準不確定度urel(R)(測量不確定度A類評定)

分析方法的偏差通常是通過研究相關(guān)標準物質(zhì)或通過加料研究而確定的，可以表示為分析回收率(觀察值除以期望值)。分別完成1.0、2.0、10.0 mg 3個水平的添加，每個添加水平做2個重復(fù)，計算回收率，回收率范圍為100.2%～105.5%，平均回收率為103.0%，結(jié)果見表4。

表4 樣品回收率測定值

標準不確定度采用平均值的標準偏差：

=0.82

加標回收試驗產(chǎn)生的相對測量不確定度為：

顯著性檢測是用來確定平均回收率是否與1.0有顯著性差異。用t-檢驗(σ未知)確定加標平均回收率與1.0有無顯著性差異，設(shè)顯著水平為α=0.05，t1-0.05(n-1)=1.943(n=6)。

平均回收率與1.0差異顯著，因此必須考慮方法回收率引入的不確定度。

4 合成標準不確定度、擴展不確定度計算和測量不確定度報告

4.1 計算合成標準不確定度

ucrel(X)=

=2.20%

合成標準不確定度為：

uc(X)=ucrel(X)×X=2.2 mg/kg。

4.2 計算擴展不確定度

不確定度各分量按正態(tài)分布處理，取包含因子k=2，包含概率p=95%，擴展不確定度為：

U=k×uc(X)=4.4 mg/kg。

4.3 測量不確定度報告

菜粕中的丙烯基異硫氰酸酯含量測定結(jié)果為：

X=(99.2±4.4)mg/kg，k=2。

5 討論和結(jié)論

5.1 討論

將各不確定度分量值按比例繪成圖1，從圖1可以看出，校正因子測定引入的不確定度分量對總不確定度的貢獻最大，樣品重復(fù)測定、回收試驗和內(nèi)標溶液帶來的不確定度分量也不容忽視，提醒試驗人員完成檢測時，注意通過提高樣品的均勻性、試驗操作技能、儀器的分辨率等，可降低相關(guān)不確定度分量。另外，試樣稱量對總不確定度的貢獻最小，說明使用分度值為0.000 1 g的天平，完全能夠滿足本試驗的精度要求。

圖1 測量不確定度分量分布示意圖

5.2 結(jié)論

通過建立測定過程中各分量的數(shù)學(xué)模型，分析、識別了不確定度來源，其不確定度主要來源于校正因子、樣品稱量、正丁基異硫氰酸酯內(nèi)標溶液添加、樣品重復(fù)測定、回收率等因素。在對各不確定度分量進行量化的基礎(chǔ)上，合成得到了測定結(jié)果的標準不確定度。當菜粕的丙烯基異硫氰酸酯含量為99.2 mg/kg時，得到其合成標準不確定度和擴展不確定度分別為2.2mg/kg和4.4 mg/kg。結(jié)果表明，校正因子測定引入的不確定度分量對合成標準不確定度的貢獻最大，樣品重復(fù)測定、回收試驗和添加內(nèi)標溶液帶來的不確定度分量也不容忽視，試樣稱量對總不確定度的貢獻最小，提醒試驗人員完成檢測時，注意通過提高樣品的均勻性、試驗操作技能、儀器的分辨率等，可降低相關(guān)不確定度分量，為采用該方法測定菜籽餅粕中異硫氰酸酯含量的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

[1]ISO/IEC.Guide 98-3-2008 Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement [S]

[2]GB/T 13078—2001，飼料衛(wèi)生標準[S]

[3]GB/T 13087—1996，飼料中的異硫氰酸酯的測定方法[S]

[4]Schramm K,Vass?o D G,Reichelt M,et al.Metabolism of glucosinolate-derived isothiocyanates to glutathioneconjugates in generalist lepidopteran herbivores[J].Insect Biochemistry and Molecular Biology，2012(42):174-182

[5]Gu Zhenxin，Guo Qianghui,Gu Yingjuan.Factors influencing glucoraphanin and sulforaphane formation inBrassicaplants：a review[J].Journal of Integrative Agriculture，2012，11(11):1804-1816

[6]姜子濤，張清峰，李榮.異硫氰酸酯的產(chǎn)生、化學(xué)性質(zhì)及測定方法[J].中國調(diào)味品，2005(4)：9-14

[7]潘雷，李愛科，程茂基，等.菜籽餅粕中硫甙降解產(chǎn)物定量檢測方法研究進展[J].中國油脂，2009，34(6)：70-74

[8]CNAS-GL05—2011，測量不確定度要求的實施指南[S]

[9]CNAS-GL06—2006，化學(xué)分析中不確定度的評估指南[S]

[10]JJG 196—2006，《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[S].

Uncertainty Evaluation of Determination of Allyl Isothiocyanate in Rapeseed Meal with Gas Chromatography by Internal Standard Method

Zhang Fengping1, 2Du Xueli1Zhao Yan1Li Yingdong Liu Yaomin1
(Tongwei Co. Ltd.1, Chengdu 610041)(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University2, Shanghai 201306)

In the paper, the measurement uncertainty of determination on allyl isothiocyanate in rapeseed meal by gas chromatography internal standard method has been evaluated. The measurement models of each component in the process were established. The main sources of uncertainty have been analyzed and identified. The impact of every uncertainty component for the measurement uncertainty was estimated. Based on the quantitative analysis of each source, the relative standard uncertainty of measurement result was finally obtained as: the determination result of allyl isothiocyanate content in rapeseed meal 99.2 mg/kg; the combined standard measurement uncertainty and expanded one as 2.2 and 4.4 mg/kg respectively. The evaluation indicated that the correction factor was the reason which had made the most contribution to the relatively combined standard measurement uncertainty. The influence of repetitive test, the spike recovery a well as internal standard solution could not be neglected. The effect of sample weight was minimal. This evaluation has provided a theoretical basis for the quality control on allyl isothiocyanate content determination of rapeseed meal.

measurement uncertainty evaluation, gas chromatography,intemal standard method, allyl isothiocyanate, rapeseed meal

S816.2

A

1003-0174(2014)06-0112-06

四川省科技支撐計劃(2011NZ0071)

2013-06-20

張鳳枰，男，1972年出生，高級工程師，食品營養(yǎng)評價和質(zhì)量安全檢測