過氧化氫對銀杏懸浮細胞黃酮含量及抗氧化酶活性的影響

陳 穎 ，楊 華 ，樂 利 ，林芳芝 ，羅永亞 ，王俊霖 ，曹福亮

（南京林業(yè)大學(xué) a.生物與環(huán)境學(xué)院，b.林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

過氧化氫對銀杏懸浮細胞黃酮含量及抗氧化酶活性的影響

陳 穎a，楊 華a，樂 利a，林芳芝a，羅永亞a，王俊霖a，曹福亮b

（南京林業(yè)大學(xué) a.生物與環(huán)境學(xué)院，b.林學(xué)院，江蘇 南京 210037）

以銀杏懸浮細胞為研究材料，通過向液體培養(yǎng)基中添加0～20.0 mM的H2O2，探討H2O2處理下銀杏細胞黃酮代謝、抗氧化酶及活性氧之間的相互關(guān)系。主要結(jié)果有：①外源H2O2處理限制了懸浮細胞的生長,但提高了苯丙氨酸解氨酶 （PAL）活性（20 mM第6 d除外）和總黃酮的合成，最高達18.8 mg/g DW（10.0 mM處理）。②低濃度（0.5～1.0 mM或0.5～5.0 mM） 的H2O2能夠激活SOD和CAT酶，而高于5 mM以上抑制兩酶活性，POD活性在10～20 mM較高。0.5～1.0 mM外源H2O2對細胞內(nèi)源H2O2和MDA（第6 d的20 mM除外）的積累影響不大，但在5～20 mM時兩者出現(xiàn)大量積累，同時高濃度的H2O2也促進了脯氨酸的合成。這些結(jié)果表明在銀杏細胞內(nèi)可能存在一個黃酮（抗氧化物質(zhì)）—活性氧—抗氧化酶的動態(tài)平衡系統(tǒng)，在低濃度（0.5～1.0 mM）H2O2處理下銀杏細胞可能通過提高SOD和CAT酶活性清除胞內(nèi)O2.-和多余的過氧化氫，維持生長；中等濃度（5～10 mM）H2O2處理下細胞可能通過提高POD活性、刺激黃酮的積累、提高脯氨酸含量來抵御胞內(nèi)高濃度的H2O2等活性氧對細胞的脅迫，維持細胞生存；過高的H2O2（20 mM，處理6 d）處理打破了細胞內(nèi)三者的動態(tài)平衡，導(dǎo)致細胞的褐化死亡。5～10 mMH2O2處理對銀杏細胞總黃酮的積累最有效。

銀杏；懸浮細胞；過氧化氫；黃酮；抗氧化酶

銀杏是陸生植物中最古老的樹種之一，被譽為活化石，因其體內(nèi)具有兩類重要的活性物質(zhì)—黃酮類和萜內(nèi)酯類化合物而備受關(guān)注[1]。利用細胞培養(yǎng)技術(shù)可以解決土地少，周期長、產(chǎn)量低的缺點，可以在條件可控的情況下大量生產(chǎn)黃酮和內(nèi)酯。在植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)有用藥物的過程中，誘導(dǎo)子的策略是目前提高次生代謝產(chǎn)物的重要方法之一[2]。誘導(dǎo)子是一類微量的能夠誘導(dǎo)或促進植物體內(nèi)某些活性物質(zhì)生物合成的觸發(fā)因子，包括生物誘導(dǎo)子和非生物誘導(dǎo)子[3]。近年來，非生物誘導(dǎo)子過氧化氫（H2O2）對植物生長及細胞代謝的影響研究引起了人們的主意。

過氧化氫是植物體內(nèi)活性氧（ROS）、氧化代謝的重要組成部分，也是過氧化物酶體、葉綠體和線粒體氧化代謝的產(chǎn)物[4]。過去人們一直認為H2O2是植物有氧代謝的有毒副產(chǎn)物，能夠氧化損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂類等大分子物質(zhì)，嚴重情況下會造成新陳代謝紊亂甚至死亡。然而，近年來的研究表明，H2O2具有雙重作用，高濃度會產(chǎn)生氧化脅迫，而低濃度的H2O2是生物體內(nèi)一種重要的信號分子，能夠觸發(fā)植物對各種非生物和生物脅迫的抗性[5]。H2O2參與各種各樣的生理生化過程，如緩解脅迫的抑制效應(yīng)[6]，氣孔關(guān)閉[7]，根系發(fā)育及向重性[8-9]、抗冷性[10]、抗病性[11]、DNA甲基化[12]等方面。H2O2還能促進植物體內(nèi)次生代謝物的產(chǎn)生，如H2O2能夠促進丹參懸浮細胞中丹參酚酸和丹參酮的合成[13]、誘發(fā)金絲桃細胞合成金絲桃素[14]及馬鈴薯花青素積累等[15]。但H2O2對銀杏懸浮細胞黃酮代謝的調(diào)控作用還未見報道。本研究以銀杏懸浮細胞為材料，研究不同濃度H2O2對銀杏細胞黃酮代謝和保護酶系統(tǒng)的影響，為銀杏細胞培養(yǎng)黃酮的代謝調(diào)控及機制研究、有效提高細胞黃酮產(chǎn)率提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

以南京林業(yè)大學(xué)下蜀林場實驗基地4年生銀杏（大佛指）幼葉為外植體，以MS+NAA1.0 mg/L+BA1.0 mg/L為培養(yǎng)基建立愈傷組織培養(yǎng)體系，初代培養(yǎng)35d后，轉(zhuǎn)入MS+NAA1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L的固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3周繼代一次，連續(xù)繼代5次后，獲得顏色翠綠、質(zhì)地疏松的愈傷組織。

1.2 過氧化氫處理懸浮細胞

在無菌條件下，選擇生長均一、濕重為6.0 g的愈傷組織接入100 mL的MS+NAA1.0 mg/L+KT0.5 mg/L不加瓊脂的液體培養(yǎng)基上進行懸浮細胞培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm，以后細胞液（含細胞）與新鮮培養(yǎng)液按1∶2的比例混合進行繼代培養(yǎng)，每12 d轉(zhuǎn)接一次，建立懸浮培養(yǎng)體系。將終濃度為 0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mM 的 H2O2（過濾滅菌加入）分別加入培養(yǎng)10 d的懸浮細胞培養(yǎng)液中，每處理6瓶，培養(yǎng)至3 d、6 d時取樣。收獲的細胞去除細胞水分后稱取鮮重，然后將一部分細胞在80℃烘箱中烘干至恒重（干重），用于總黃酮含量的測定，另一部分放入-70℃超低溫冰箱中用于酶活性和其他指標的測定。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照時間為14 h·d-1[16]，各培養(yǎng)基含30 g/L蔗糖和6.0 g/L瓊脂（液體培養(yǎng)不添加），pH值5.8，光照強度55 μmol·m-2s-1。

1.3 指標測定

PAL酶活性參照文獻[17]法并加以改進，鮮樣0.5 g用硼酸緩沖液（pH值8.8）進行冰浴研磨，10，000×g離心20 min，取上清液進行酶活性分析?？傸S酮含量采用分光光度法[18]測定。

POD、SOD、CAT酶活性、MDA含量均參照李合生法[19]、脯氨酸含量測定參照Bates等法[20]進行，H2O2含量測定參照趙世杰法[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗重復(fù)三次，每次3個重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源H2O2對銀杏總黃酮和PAL酶活性的影響

如圖1-a所示，第3 d時小于10 mM以下的H2O2處理對銀杏懸浮細胞總黃酮含量沒有顯著的影響，而在10～20 mM時總黃酮含量顯著增加，20 mM時達到最高（p＜0.05），比對照增加61.5%；而在第6 d時，5 mM和10 mM的H2O2處理對細胞總黃酮含量的促進作用最明顯，分別比對照增加206.0%和305.9%（p＜0.05），20 mM處理的總黃酮含量急劇下降，低于對照，這可能是由于高濃度H2O2對細胞結(jié)構(gòu)造成了傷害，導(dǎo)致了細胞衰老死亡的緣故。

H2O2處理對銀杏細胞中的PAL活性也表現(xiàn)出不同的影響（圖1-b），在第3 d時，PAL活性隨H2O2濃度的增加而增加，20 mM時達到最高，比對照增加87.4%；而在6 d時，0～5 mM H2O2處理PAL活性逐漸增強，在5 mM時達到最高，比對照增加50.0%，爾后出現(xiàn)下降，到20 mM時，PAL活性受到明顯地抑制，只有對照的52.2%，這與此濃度黃酮含量低的結(jié)果一致。

圖1 不同濃度過氧化氫對黃酮（a）、PAL活性(b)、懸浮細胞鮮重(c)、干重(d)、的影響Fig.1 Effects of different concentration H2O2 on contents of fl avonoids(a), activity of PAL(b) ,fresh weight (c) and dry weight(d) of suspension cells in Ginkgo biloba L.

圖2 過氧化氫處理下銀杏細胞的顏色變化（圖中數(shù)據(jù)表示H2O2 濃度：mM）Fig.2 Color changing of cell in Ginkgo biloba L. suspension cell cultures after added different concentrations of H2O2. for 3 days

2.2 外源H2O2對銀杏細胞生長量及細胞色度的影響

由圖1-c、d可以看出隨外源H2O2濃度的增加，懸浮細胞鮮重和干重除1 mM第3 d處理時兩者都有所增加外，其它都表現(xiàn)出抑制效應(yīng)，特別是10～20 mM處理，對細胞生長的抑制作用非常明顯，20 mMH2O2處理的其干、鮮重分別只有對照的46.6%和39.0%（p＜0.05）。說明高濃度H2O2嚴重影響了銀杏細胞的生長和干物質(zhì)的積累。從懸浮細胞的色度來看（圖2），低濃度處理（0～0.5 mM）細胞呈現(xiàn)黃綠色，1 mM時呈現(xiàn)綠色，細胞呈分散狀態(tài)；在5 mM以上，細胞呈現(xiàn)深綠色并帶有部分的褐色，細胞呈緊密顆粒狀，20 mM時呈黑綠色；6 d時20 mM H2O2處理的細胞褐化死亡。

2.3 外源過氧化氫對三種保護酶活性的影響

不同濃度的外源H2O2對懸浮細胞SOD、POD、CAT活性產(chǎn)生不同的影響。0.5～5.0 mM和1.0～5.0 mMH2O2處理都提高了SOD和CAT的活性，而10～20 mM H2O2處理時兩酶活性都出現(xiàn)顯著的下降（圖3a-b），兩者都在H2O2濃度為1 mM時活性達到最高，第3 d 和第6 d 的SOD活性分別比照增加了111.2%和92.0%；而CAT活性在第6 d時活性最強，比對照增加了147.4%。POD活性變化同SOD、CAT相反， 0.5～5 mM H2O2處理時POD活性變化與對照差異不顯著，而在10～20 mM時顯著地提高。第3 d時，20 mM H2O2處理的細胞POD活性最高（p ＜ 0.05），比對照增加169.3%；而在第6 d時，10 mM處理的POD活性達到最高（p＜ 0.05），比對照增加382.7%（圖3-c）。這些結(jié)果表明小于5 mM H2O2處理SOD和CAT酶被激活，而POD 的激活則需在10～20 mM的H2O2處理強度。

圖3 不同濃度外源過氧化氫對SOD(a)、CAT (b)和 POD (c) 活性，脯氨酸 (d)、H2O2 (e)和MDA (f) 含量的影響Fig.3 Effects of exogenous H2O2 on activities of SOD(a),CAT (b), POD(c) and contents of proline(d), H2O2 (e) and MDA(f) in Ginkgo biloba L. cells

2.4 外源過氧化氫對脯氨酸、MDA、H2O2含量的影響

不同濃度外源H2O2處理后，懸浮細胞中脯氨酸出現(xiàn)積累，在第3 d和第6 d時，其含量隨著處理濃度的增加而升高（p＜ 0.05）(第6 d時，除5 mM外)（圖3-d），但第6 d時各處理之間脯氨酸含量沒有第3 d時差異顯著。外源H2O2對銀杏細胞內(nèi)H2O2的影響如圖3-e，在第3 d 時各處理都隨著外源H2O2濃度增加而增加，10 mM處理的H2O2含量最高，比對照增加44.7%；而在第6 d時，5mM處理的最高，比對照增加120.8%，高于此濃度開始下降但仍高于對照。低濃度（0.5～1.0 mM）的H2O2處理對細胞內(nèi)H2O2含量的影響不大，甚至低于對照。從膜脂過氧化產(chǎn)物MDA來看，外源H2O2增加了體內(nèi)MDA的含量，短期內(nèi)（3 d）低濃度（0.5～5.0 mM）處理對MDA的積累影響不大，但在10～20 mM處理時急劇增加，10 mM時含量是對照的313.0%；到第6 d時，濃度大于5 mM以上MDA含量開始急劇增加，10 mM處理時MDA含量是對照的124.4%(圖3-f)。

3 討 論

近年來，許多環(huán)境刺激(如干旱)和化學(xué)物質(zhì)（如ABA）等都可刺激植物產(chǎn)生ROS[22]。H2O2是一種能夠通過膜通道而直接擴散的第二信使，其在環(huán)境脅迫防御反應(yīng)中的信號作用已得到證實。H2O2可與其它信號系統(tǒng)特別是激素信號相互作用，是激素介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路上的上游或下游組分[23]。低濃度的過氧化氫對植物生長表現(xiàn)出正相關(guān)，如經(jīng)H2O2處理過的玉米幼苗能表現(xiàn)出更強的耐寒力[24]；大豆經(jīng)H2O2處理后增強了其耐旱性[22]；適度的H2O2預(yù)處理能夠增強玉米的耐鹽性[25]和水稻的耐熱性[26]。我們的研究也表明＜5 mM以下的H2O2處對理銀杏細胞干、鮮重的影響不大，細胞生長正常，高于5 mM后細胞鮮重急劇下降，20 mM處理褐化嚴重，甚至導(dǎo)致細胞的死亡。

植物在受到外界干擾時，如機械損傷和微生物干擾脅迫時，植物細胞代謝往往會轉(zhuǎn)向次生代謝物的合成，產(chǎn)出植保素，苯丙氨酸解氨酶(PAL)是高等植物中較普遍的、與植物次生代謝合成關(guān)系密切的關(guān)鍵酶[27]。用外源H2O2處理植物時，細胞的生長受到一定的抑制，但細胞的防御作用也會相應(yīng)地增強，次生代謝會大大提高[15]。在我們的研究中，5～10 mM的外源H2O2處理能夠顯著提高銀杏細胞總黃酮的含量，特別是6 d時10 mM的外源H2O2處理黃酮含量達到最高，與PAL酶表現(xiàn)出相同的趨勢，說明外源高濃度H2O2能夠激活PAL，促進總黃酮的積累。許多研究表明：H2O2可能介導(dǎo)了NO誘發(fā)次生物質(zhì)的合成[14]，在茅蒼術(shù)懸浮細胞培養(yǎng)中添加H2O2淬滅劑CAT 可顯著抑制AL4 粗誘導(dǎo)子引起的β-桉葉醇積累[28]，H2O2可能通過刺激PAL 活性的啟動調(diào)節(jié)馬鈴薯花青素的合成[15]，過氧化氫對丹參懸浮細胞丹參酚酸和丹參酮含量有明顯的促進作用[13]。這些結(jié)果都表明外源過氧化氫可能通過刺激內(nèi)源過氧化氫積累到一定程度進而參入了細胞次生代謝物的合成。

SOD、POD、CAT被稱為植物體內(nèi)的抗氧化保護酶，主要作用是清除細胞內(nèi)的活性氧（ROS）[29]。植物細胞中的活性氧產(chǎn)生于葉綠體、線粒體、過氧化物酶體等細胞器的有氧代謝中，植物光合作用電子傳遞鏈運轉(zhuǎn)時可產(chǎn)生O2.-（Mehler反應(yīng)）[30]，而SOD催化O2.-發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2，H2O2再被CAT和POD轉(zhuǎn)化成無害的分子氧和水[31]。在適度逆境脅迫情況下，3種抗氧化酶的活性會升高，表現(xiàn)出對植物本身的保護作用。但當(dāng)脅迫強度持續(xù)增大，抗氧化酶的活性會降低，說明植物對環(huán)境脅迫的忍受能力是有限的。Sekmen等[32]研究發(fā)現(xiàn)Gypsophila oblanceolata幼苗在低鹽脅迫下的抗氧化酶SOD、CAT活性上升，高鹽處理下POD活性增加。本研究結(jié)果與其一致，銀杏細胞SOD和CAT活性在不同濃度H2O2處理時都表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，都在1 mM時活性達到最高，表明外源低濃度H2O2（＜5 mM）對SOD、CAT有一定的激活作用,高度時酶活性受到顯著地抑制。這從內(nèi)源H2O2和MDA含量的變化得到證實，在低濃度時（0～5 mM）銀杏內(nèi)源H2O2和MDA的含量都沒有明顯的增加，而在高于5 mM時兩者急劇增加（第6 d 20 mM處理的MDA除外），說明低濃度H2O2處理下銀杏細胞能夠通過自身抗氧化酶的活性提高、避免ROS在植物體內(nèi)過度積累來防御環(huán)境的脅迫。而在高濃度時（＞ 5 mM），銀杏細胞隨能通過POD活性的提高來消除過高H2O2濃度的影響和增加脯氨酸含量進行滲透調(diào)節(jié)，但這種消除能力和滲透調(diào)節(jié)能力是有限的，在20 mM時已失去這種能力而導(dǎo)致褐化。

黃酮化合物作為抗氧化物質(zhì)在植物逆境脅迫適應(yīng)和防御中扮演重要的角色，它們能夠抑制和減少活性氧的產(chǎn)生[33]，同時黃酮還可以作為一個協(xié)同信號分子干預(yù)植物激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[34-35]。因此在銀杏細胞內(nèi)可能存在一個黃酮（抗氧化物質(zhì)）-活性氧-保護酶的動態(tài)平衡系統(tǒng)，一定濃度的過氧化氫（5～10 mM）刺激了黃酮的合成，黃酮的積累又反過來對多余的ROS（包括H2O2）加以清除來減輕過氧化氫的傷害，這可能是銀杏細胞對高濃度過氧化氫脅迫的一個積極響應(yīng)和防御機制。

綜上所述，外源H2O2對銀杏懸浮細胞生長和生理代謝存在濃度效應(yīng)，低濃度（0.5～1.0 mM）通過刺激SOD、CAT的活性，有效抑制內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生，減少膜酯過氧化MDA的積累；中等濃度（5～10 mM）通過提高POD活性和脯氨酸含量，刺激PAL活性、積累黃酮化合物來抵御過氧化氫對細胞的傷害作用，維持生存；過高的過氧化氫（20 mM）嚴重影響了細胞的生長，氧化脅迫加重導(dǎo)致細胞的褐化死亡。 5～10 mM）過氧化氫能夠有效對促進銀杏總黃酮的合成。

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Effects of exogenous hydrogen peroxide on fl avonoid content and antioxidant enzyme activities in suspension cells of Ginkgo biloba L.

CHEN Yinga, YANG Huaa, YUE Lia, LIN Fang-zhia, LUO Yong-yaa, WANG Jun-lina, CAO Fu-liangb
(a. College of Forest Resource and Environment, b. College of Forestry, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China)

Effects of hydrogen peroxide (0, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0 mmol H2O2) on fl avonoid content, antioxidant enzyme activities (SOD,CAT, POD) and reactive oxygen species (ROS) were investigated in Ginkgo biloba L. suspension cells. The results show that exposure to high concentrations of H2O2signif i cantly inhibited cell growth, but increased fl avonoids accumulation (the highest was 18.8 mg/g DW in 10.0 mmol H2O2treatment for 6 days culture) andimprovedthe activity of PAL in all treatments except for 20 mmol treatment in suspension cells; Hydrogen peroxide (0.5～1.0 mmol, 0.5～5.0 mmol and 10～20 mmol) caused an increase in activities of SOD, CAT and POD, respectively; However, thecontent of endogenous H2O2and MDA were not affected at 0.5～1.0 mmol hydrogen peroxide treatments while H2O2at 5～20mmol treatment and MDA at 5～10 mmol treatment signif i cantly increased in Ginkgo cells.Maybe there was a system of dynamic homeostasis between fl avonoids compounds,antioxidant enzymes and reactive oxygen species in Ginkgo cells. The cell could maintain growth or survival in low concentration (0.5～1.0 mmol) and (5.0～10.0 mmol) H2O2through regulating the antioxidant enzyme activities, stimulating the accumulation of fl avonoids and proline to resist the stress of high concentration of endogenous H2O2and active oxygen. The cell would be brown and death in high hydrogen peroxide (20 mmol treatment for 6 days) because of losing this homeostasis in cells.In conclusion, the use of 5～10 mmol H2O2may be desirable for the induction of fl avonoids compounds in Ginkgo suspension cells.

Ginkgo biloba L.; suspension cell; hydrogen peroxide; fl avonoid; antioxidant enzymesactitvty

S792.95

A

1673-923X(2014)12-0040-06

2014-05-24

“十二五”國家科技支撐計劃(2011BAD38B01)；江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（PAPD）

陳 穎，副教授。主要從事生物技術(shù)及抗性生理研究；E-mail：chynjfu@163.com

[本文編校：吳 彬]