逐級(jí)提取-高效液相色譜法快速測(cè)定植物組織中8 種有機(jī)酸

黃天志， 王世杰 ， 劉秀明， 劉 虹， 吳沿友， 羅緒強(qiáng)

（1. 中國(guó)科學(xué)院地球化學(xué)研究所，環(huán)境地球化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)550002；2. 中國(guó)科學(xué)院普定喀斯特生態(tài)系統(tǒng)觀測(cè)研究站，貴州 安順562100；3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049；4. 貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)550018）

草酸是廣泛存在于植物體中的簡(jiǎn)單二元羧酸，參與植物體內(nèi)多種生理代謝過(guò)程，主要以水溶態(tài)和不溶于水的結(jié)晶態(tài)形式存在，其中以結(jié)晶態(tài)存在的草酸可以固定植物體內(nèi)高達(dá)90% 的鈣［1，2］。研究表明，植物體內(nèi)草酸可能的來(lái)源包括乙醇酸、乙醛酸氧化、L-抗壞血酸裂解氧化、草酰乙酸裂解等途徑，但參與草酸鈣晶體形成的草酸具體來(lái)自于哪條途徑卻并不清楚［1，3，4］。因此，建立一種簡(jiǎn)單高效的方法測(cè)定乙醇酸、乙醛酸等草酸合成前體及不同形態(tài)草酸的含量，對(duì)研究草酸合成途經(jīng)及其對(duì)應(yīng)的生理功能具有重要的意義。

草酸等有機(jī)酸常用的分析方法有毛細(xì)管電泳法［5-7］、離子排斥色譜法［8］以及最常用的高效液相色譜法［9，10］。采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定樣品（食品、飲料、發(fā)酵產(chǎn)品及植物組織等）中的草酸及其他多種有機(jī)酸的方法常有報(bào)道，但同時(shí)測(cè)定草酸、乙醇酸及乙醛酸的方法還鮮有報(bào)道。目前有機(jī)酸的測(cè)定方法中，針對(duì)同一樣品分形態(tài)提取并測(cè)定草酸等有機(jī)酸的研究還很少，僅側(cè)重于水溶性有機(jī)酸的提取測(cè)定［11，12］，或者用鹽酸、硝酸等無(wú)機(jī)酸提取測(cè)定不同形態(tài)有機(jī)酸的總含量［3，13］。在需要不同形態(tài)草酸等有機(jī)酸的含量時(shí)，往往需要建立兩種不同的色譜條件，分別測(cè)定酸溶態(tài)含量和水溶態(tài)含量，然后計(jì)算獲得所需形態(tài)有機(jī)酸含量，這種方法在準(zhǔn)確性和操作簡(jiǎn)便性方面都有待提高。此外，在同時(shí)測(cè)定草酸、酒石酸、乙醇酸、乙醛酸等的過(guò)程中，也存在一些需要解決的問(wèn)題，例如以鹽酸和硝酸等無(wú)機(jī)酸作為提取介質(zhì)時(shí)，無(wú)機(jī)酸本身的吸收容易干擾測(cè)定的結(jié)果［13］；草酸、酒石酸獲得基線(xiàn)分離的難度較大［11］；乙醇酸、乙醛酸需要先衍生后測(cè)定［10，14］等。本方法首先以水為提取介質(zhì)，提取了水溶態(tài)草酸等8 種有機(jī)酸，而以草酸鈣結(jié)晶等形態(tài)存在的草酸不溶于水，保留在固態(tài)殘?jiān)?；然后以稀鹽酸為提取介質(zhì)提取了酸溶性結(jié)晶態(tài)草酸。測(cè)定時(shí)采用磷酸二氫鉀水溶液作為流動(dòng)相，通過(guò)控制不同測(cè)定時(shí)段流動(dòng)相的流速，在5 min 內(nèi)完成了8 種有機(jī)酸的分離測(cè)定，并且在水溶態(tài)有機(jī)酸獲得基線(xiàn)分離的同時(shí)，相同色譜條件下測(cè)定酸溶態(tài)草酸，較好地去除了鹽酸對(duì)酸溶態(tài)草酸測(cè)定的干擾。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1290 UPLC 液相色譜系統(tǒng)，配備二元泵（G4220B）、高性能自動(dòng)進(jìn)樣器（G4226A）、柱溫箱（G1316C）、二極管陣列檢測(cè)器（G4212A）；pHS-3C型精密酸度計(jì)（上海雷磁）；超微量天平Cubis（德國(guó)Sartorius）；0.22 μm 有機(jī)系濾膜（美國(guó)Whatman公司）。

8 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，草酸、乙酸、一水乙醛酸為Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品，乙醇酸、酒石酸、琥珀酸為Fluka 公司產(chǎn)品，蘋(píng)果酸、檸檬酸為Supelco 公司產(chǎn)品；甲醇、乙腈為色譜純，Dikma 公司出品；磷酸為色譜純，磷酸二氫鉀、鹽酸、草酸鈣為優(yōu)級(jí)純，均為天津科密歐公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（18.2 MΩ·cm，Millipore）。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取一水乙醛酸124.4 mg，草酸、乙醇酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、琥珀酸、檸檬酸各100 mg，用超純水分別溶解并定容到50 mL；準(zhǔn)確量取191 μL 乙酸，用超純水定容到100 mL。由此獲得2 g／L 的單一有機(jī)酸儲(chǔ)備液，4 ℃下避光保存。使用時(shí)根據(jù)所需濃度用超純水稀釋?zhuān)蚧旌吓渲苹旌纤帷Ａ硗?，?zhǔn)確量取鹽酸4.106 mL，用超純水定容到100 mL，配制成0.5 mol／L（18.23 g／L）的鹽酸溶液備用。

1.2.2 樣品前處理

所使用的植物樣品為溫室水培獲得的諸葛菜（十字花科諸葛菜屬，又名二月蘭，學(xué)名Orychophragmus violaceus）的葉片和根。將葉片和根鮮樣用超純水沖洗干凈，吸盡表面水分，各稱(chēng)取1.00 g。加入5 mL 超純水研磨勻漿，將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管，30 ℃下振蕩提取15 min，提取液于12 000 r／min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，收集上清液。加入5 mL超純水沖洗離心管中殘?jiān)?，同條件提取并離心收集上清液，該過(guò)程重復(fù)3 次。用超純水將收集到的上清液定容到25 mL，此過(guò)程提取液為8 種水溶態(tài)有機(jī)酸樣品（提取液Ⅰ）。向上述提取殘?jiān)屑尤? mL 0.5 mol／L HCl 溶液，80 ℃水浴振蕩提取1 h，12 000 r／min 離心10 min 后收集上清液。采用5 mL 0.5 mol／L HCl 溶液沖洗殘?jiān)?，同條件提取，重復(fù)3 次，用超純水定容提取液至25 mL，此提取液為不溶于水的草酸樣品（提取液Ⅱ）。分別取1.5 mL上述兩種提取液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，測(cè)定提取液Ⅰ中8 種可溶性有機(jī)酸的含量，在相同色譜條件下測(cè)定提取液Ⅱ中酸溶態(tài)草酸的含量。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

Hypersil ODS （200 mm ×4.6 mm，5 μm）色譜柱，柱溫30 ℃；KH2PO4水溶液（5 mmol／L，用H3PO4調(diào)pH 為2.8）作為流動(dòng)相；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。流速控制:0 ～1.4 min，1.4 mL／min；1.4 ～1.9 min，0.5 mL／min；1.9 ～5.0 min，1.4 mL／min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動(dòng)相組成

硫酸［15，16］和磷酸鹽緩沖體系［9-13，17-20］是有機(jī)酸分離常采用的流動(dòng)相。因本實(shí)驗(yàn)使用HCl 作為提取介質(zhì)，為避免其他無(wú)機(jī)酸的干擾，選擇磷酸鹽緩沖體系作為流動(dòng)相，其中磷酸二氫鉀因其較高的分離效率和極低的本底吸光度而被廣泛采用。在采用KH2PO4溶液作為流動(dòng)相分離有機(jī)酸時(shí)，其濃度從10 mmol／L 到36.7 mmol／L（0.5%）［9，11-13，17-19］均有報(bào)道，但用于分離草酸、乙醇酸和乙醛酸的KH2PO4溶液的濃度還少有報(bào)道。為尋找有效分離的最適KH2PO4溶液濃度，本實(shí)驗(yàn)配制了0、3、5、7、10、15、20、30、40 mmol／L 的KH2PO4溶 液（用H3PO4調(diào) pH 為2.7）。色譜分離結(jié)果表明，KH2PO4溶液的濃度對(duì)蘋(píng)果酸、琥珀酸、檸檬酸和乙酸的保留時(shí)間影響較小，在不同濃度的KH2PO4溶液條件下這4 種有機(jī)酸都能得到較好的分離。而草酸、鹽酸、乙醛酸、酒石酸、乙醇酸保留時(shí)間接近，當(dāng)KH2PO4溶液濃度大于10 mmol／L 時(shí)，草酸、鹽酸、乙醛酸不能實(shí)現(xiàn)有效分離；當(dāng)流動(dòng)相中KH2PO4溶液濃度小于5 mmol／L 時(shí)，乙醇酸、酒石酸的分離效果受到鹽酸干擾；KH2PO4溶液濃度介于5 mmol／L至10 mmol／L 之間時(shí)，8 種有機(jī)酸能較好地實(shí)現(xiàn)分離且不受鹽酸干擾。從節(jié)約成本和環(huán)保的角度考慮，本實(shí)驗(yàn)最終選擇5 mmol／L KH2PO4溶液作為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)還考察了在磷酸鹽緩沖體系中加入有機(jī)相對(duì)分離效果和峰形的影響。結(jié)果表明，在5 mmol／L KH2PO4水溶液中加入甲醇會(huì)使草酸和HCl 的出峰時(shí)間延遲，當(dāng)甲醇的體積比大于5% 時(shí)，草酸和乙醛酸不能有效分離，且甲醇的加入并沒(méi)有顯著地改善峰形，故本實(shí)驗(yàn)使用的流動(dòng)相僅為KH2PO4溶液。

2.1.2 流動(dòng)相pH 的選擇

有機(jī)酸為弱酸，流動(dòng)相pH 的大小直接影響其在磷酸鹽緩沖體系中的解離程度。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定以H3PO4調(diào)節(jié)流動(dòng)相為不同pH 條件下的各有機(jī)酸保留時(shí)間（見(jiàn)圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各有機(jī)酸保留時(shí)間對(duì)流動(dòng)相pH 變化非常敏感，pH ＜2.6 時(shí)酒石酸、乙醇酸、乙醛酸分離效果不理想；pH 2.8 時(shí)各有機(jī)酸獲得了最佳分離效果；pH ＞2.8 時(shí)乙醛酸、乙醇酸和酒石酸的分離度降低，且鹽酸的干擾不能去除。因此選擇pH 值為2.8 的KH2PO4溶液。

圖1 流動(dòng)相pH 對(duì)有機(jī)酸保留時(shí)間的影響Fig.1 Effect of pH value of mobile phase on the retention times of the organic acids

2.1.3 流速對(duì)分離效果的影響

流速直接影響各有機(jī)酸的保留時(shí)間。以5 mmol／L 的KH2PO4溶液（pH 2.8）為流動(dòng)相，草酸、鹽酸、乙醛酸、酒石酸都能有效分離但保留時(shí)間較為接近，需要控制較低流速來(lái)獲得基線(xiàn)分離；而酒石酸、乙醇酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸、檸檬酸和乙酸峰形很好且保留時(shí)間間隔較大，因此需要調(diào)節(jié)不同的流速使所有組分獲得基線(xiàn)分離的同時(shí)縮短分離時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)采用分段控制流速的方法實(shí)現(xiàn)。0 ～1.4 min，流速1.4 mL／min，此時(shí)沒(méi)有出峰；1.4 ～1.9 min，流速為0.5 mL／min，草酸、鹽酸、乙醛酸和酒石酸實(shí)現(xiàn)較好的分離；1.9 ～5 min，流速為1.4 mL／min，其余5種有機(jī)酸得到快速且完全的分離。結(jié)果表明采用分段控制流速的方法，5 min 內(nèi)能夠完成8 種有機(jī)酸的有效分離，同時(shí)有效去除了鹽酸對(duì)酸溶態(tài)草酸測(cè)定的干擾。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖2 所示。

2.1.4 檢測(cè)波長(zhǎng)及柱溫、柱壓條件

圖2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of organic acid standard mixtures

采用二極管陣列檢測(cè)器掃描了各有機(jī)酸在190～400 nm 范圍內(nèi)的吸收，發(fā)現(xiàn)各有機(jī)酸在210 nm處有最大吸收，確定210 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)測(cè)試了25、30、35 ℃3 個(gè)柱溫，發(fā)現(xiàn)柱溫對(duì)有機(jī)酸的分離沒(méi)有顯著影響，綜合考慮設(shè)定柱溫箱溫度為30℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因?yàn)榉謺r(shí)段控制流速，因此柱壓隨流速的變化而變化。在流速為1.4 mL／min 時(shí)，柱壓范圍為11 ～12 MPa；流速為0.5 mL／min 時(shí)，柱壓范圍為7 ～8 MPa。本實(shí)驗(yàn)所用UPLC 色譜系統(tǒng)柱壓的高壓限值為40 MPa，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中柱壓均保持在低于限值的合理范圍內(nèi)。

2.2 方法的線(xiàn)性范圍和檢出限

在1 ～2 000 mg／L 之間設(shè)置了10 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度，重復(fù)進(jìn)樣3 次，以峰高Y（mAU）對(duì)質(zhì)量濃度X（mg／L）進(jìn)行線(xiàn)性回歸得出各有機(jī)酸的線(xiàn)性方程及線(xiàn)性范圍。選擇線(xiàn)性范圍下限濃度的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品重復(fù)進(jìn)樣7 次，并以信噪比為3（S／N ＝3）確定檢出限，以線(xiàn)性范圍下限濃度作為本實(shí)驗(yàn)實(shí)測(cè)樣品的定量限。除乙醇酸、乙醛酸未能找到類(lèi)似測(cè)定方法的檢出限數(shù)據(jù)進(jìn)行比較外，其他各目標(biāo)有機(jī)酸在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下的檢出限均有不同程度降低，其中乙酸和琥珀酸的檢出限水平略微高于文獻(xiàn)［9，12］可查的最低值，但仍然處于較低水平。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 回收率和精密度

回收率試驗(yàn)所用植物樣品為供鈣實(shí)驗(yàn)中供鈣水平接近正常植物生境的一組樣品。取相同根和葉片樣品各3 份，其中一份作本底，測(cè)定各有機(jī)酸的含量和不同形態(tài)草酸的含量；另外兩份分別添加兩種水平的8 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mg 草酸鈣（用以計(jì)算以稀鹽酸為介質(zhì)提取的酸溶態(tài)草酸的回收率）。按照1.2.2 節(jié)所述提取方法進(jìn)行前處理，每份樣品進(jìn)行7 次平行測(cè)定。為了研究葉片和根可能存在的吸附效應(yīng)的差異對(duì)回收率的影響，本實(shí)驗(yàn)分別計(jì)算了葉片和根的加標(biāo)回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 8 種有機(jī)酸的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍和檢出限Table 1 Regression equations，correlation coefficients （R2），linear ranges and LODs of the eight organic acids

表2 植物葉片與根中有機(jī)酸的回收率及精密度（n ＝7）Table 2 Recoveries and precisions of organic acids from plant leaves and roots （n ＝7）

表2 （續(xù)）Table 2 （Continued）

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

水培實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了梯度供鈣水平，用以研究不同鈣營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)諸葛菜有機(jī)酸組成和分布特征的影響。因?yàn)殁}是植物生長(zhǎng)的必需元素，所以本實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有設(shè)置鈣的空白對(duì)照，而是設(shè)置了正常土壤供鈣水平和極端高鈣土壤的供鈣水平，分別對(duì)應(yīng)低供鈣水平（5 mmol／L）和高供鈣水平（50 mmol／L）。

采集不同供鈣處理的樣品，按1.2.2 節(jié)方法完成前處理，進(jìn)樣5 μL 測(cè)試分析，樣品測(cè)定色譜圖見(jiàn)圖3，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 實(shí)際樣品中有機(jī)酸的含量Table 3 Contents of organic acids in real samples

結(jié)果表明:（1）葉片中水溶態(tài)有機(jī)酸含量與供鈣水平有良好的響應(yīng)關(guān)系；根組織中除乙醛酸和草酸外，其他水溶態(tài)有機(jī)酸含量對(duì)供鈣水平不敏感；（2）不同組織中不同形態(tài)草酸的含量均與供鈣水平具有良好的響應(yīng)關(guān)系。

3 結(jié)論

本文建立了逐級(jí)提取、一步測(cè)定的方法，快速準(zhǔn)確地提取測(cè)定了植物組織中不同形態(tài)的草酸以及和草酸合成相關(guān)的8 種有機(jī)酸?；厥章试囼?yàn)和實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果表明，本方法準(zhǔn)確可靠，顯著降低了目標(biāo)有機(jī)酸測(cè)定的最低檢出限，提高了方法的靈敏度，可以應(yīng)用到草酸等有機(jī)酸的相關(guān)研究中。本方法避免了不同介質(zhì)提取、不同色譜條件測(cè)定帶來(lái)的誤差，有效去除了無(wú)機(jī)酸對(duì)測(cè)定的干擾，5 min 內(nèi)完成測(cè)定，提高了測(cè)定效率。同時(shí)，本方法測(cè)定酸溶態(tài)有機(jī)酸時(shí)，考慮到以無(wú)機(jī)酸作為提取介質(zhì)所提取的成分較以水為提取介質(zhì)提取的成分更為復(fù)雜，可能會(huì)干擾在本實(shí)驗(yàn)所采用的色譜條件下除草酸外的其他目標(biāo)有機(jī)酸的測(cè)定，因此本方法只使用草酸數(shù)據(jù)，不使用其他有機(jī)酸的數(shù)據(jù)。在今后的工作中，隨著測(cè)定儀器的不斷升級(jí)，有機(jī)酸的測(cè)定方法仍然需要不斷地改進(jìn)和完善，需發(fā)展更加靈敏準(zhǔn)確、方便快捷的分析測(cè)定方法。

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