黃嘌呤氧化酶酶學(xué)性質(zhì)及共價交聯(lián)固定化

張玉然， 辛 瑜， 楊海麟， 張 玲， 王 武

（江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD），屬黃素蛋白酶類，可將次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，繼續(xù)氧化黃嘌呤為尿酸，并產(chǎn)生過氧化氫及超氧化物[1]，是嘌呤代謝的關(guān)建酶?？捎糜跈z測血清無機(jī)磷、血清超氧化物岐化酶活力及胞外黃嘌呤、次黃嘌呤水平[2-4]。在核苷類藥物的合成中起到促進(jìn)轉(zhuǎn)化的作用，可用于提高5-甲基尿苷、胸腺嘧啶核苷的合成產(chǎn)量[5-6]。

不同生物來源的黃嘌呤氧化酶酶學(xué)性質(zhì)具有差異性。來源于細(xì)菌的黃嘌呤氧化酶國內(nèi)外研究較少，已報(bào)道黃嘌呤氧化酶的相對分子質(zhì)量及亞基組成差異較大[7-9]，蛋白結(jié)構(gòu)組成的差異將導(dǎo)致酶催化性能及穩(wěn)定性的不同。

黃嘌呤氧化酶作為一種重要的氧化酶，其在醫(yī)學(xué)診斷及工業(yè)催化中有應(yīng)用前景，酶較差的穩(wěn)定性影響其直接應(yīng)用。已報(bào)道的提高酶穩(wěn)定性的方法主要有添加保護(hù)劑、蛋白質(zhì)工程、固定化方法等。其中，固定化方法因具有可連續(xù)反應(yīng)性、可重復(fù)利用性等優(yōu)點(diǎn)，備受關(guān)注?？墒褂玫墓潭ɑd體主要有聚丙烯酰胺[10]、殼聚糖[11-12]、醋酸纖維素薄膜[13]、樹脂[14]等。國內(nèi)外關(guān)于黃嘌呤氧化酶穩(wěn)定性研究，主要集中于改進(jìn)溶液環(huán)境提高酶熱穩(wěn)定性[15-16]，對其固定化研究相對較少。

前期經(jīng)SDS-PAGE電泳分析知，節(jié)桿菌Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶含兩個亞基，相對分子質(zhì)量約為100 000及35 000[17]，與已報(bào)道的黃嘌呤氧化酶均不相同。在此基礎(chǔ)上，作者對此黃嘌呤氧化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)一步分析，并利用修飾的瓊脂糖介質(zhì)及大孔陰離子交換樹脂固定化黃嘌呤氧化酶。提供有效增強(qiáng)黃嘌呤氧化酶穩(wěn)定性的固定化方法，也為其它酶類的穩(wěn)定性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

Arthrobacter M3：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 主要材料

黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品（相對分子質(zhì)量160 000）：近岸蛋白質(zhì)科技有限公司提供；大孔陰離子交換樹脂 （D201、201×4）， 浙江爭光實(shí)業(yè)股份有限公司提供；Sepharose 4B：通用電氣醫(yī)療中國有限公司提供；乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺（EDC）：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供。

1.3 主要儀器

V1100D可見分光光度計(jì)：美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；電熱恒溫水浴鍋：科輝儀器廠產(chǎn)品；蛋白電泳儀：美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；pH計(jì)（PB-10型）：德國賽多利斯股份有限公司產(chǎn)品。

1.4 培養(yǎng)及純化方法

從固體平板挑取單菌落，接入種子培養(yǎng)液，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)12 h。后將種子培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接入60 mL （500 mL錐形瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、220 r/min培養(yǎng)20 h。菌液破壁離心后，取上清酶液進(jìn)行純化，參考文獻(xiàn)[17]。純化后酶液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 XOD酶活測定方法

黃嘌呤氧化酶酶活測定方法詳見參考文獻(xiàn)[18]。酶活力單位定義：在37℃下，每分鐘形成1 μmol過氧化氫所需的酶量定義為1個酶活單位（U）。

1.6 XOD酶學(xué)性質(zhì)分析

1.6.1 凝膠過濾確定XOD相對分子質(zhì)量 以商業(yè)化的黃嘌呤氧化酶（相對分子質(zhì)量160 000）標(biāo)準(zhǔn)品為對照，利用安捷倫 SEC-5（7.5 mm×300 mm，5 μm）凝膠過濾柱測定XOD相對分子質(zhì)量。測定條件：流動相 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.0），流量 0.5 mL/min，進(jìn)樣量 40 μL，檢測波長 280 nm。

1.6.2 酶的最適反應(yīng)溫度及最適反應(yīng)pH 取一定濃度的稀釋酶液，于25～52℃水浴條件下進(jìn)行酶活力測定，以活力最高者為100%，計(jì)算不同溫度下相對酶活。另取一定濃度的稀釋酶液，于37℃、不同pH條件下（5.5～9.0）進(jìn)行酶活力測定，以活力最高者為100%，計(jì)算不同pH條件下相對酶活。

1.6.3 金屬離子對酶活的影響 在pH 7.5酶液中加入不同金屬離子 （Ca2+、Mg2+、Fe3+、Co2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ag+、Hg2+），至終濃度為 2 mmol/L，混勻，測定各組酶活，以未加金屬離子的酶液酶活為100%，計(jì)算各組相對酶活。

1.7 XOD固定化方法比較

1.7.1 大孔陰離子交換樹脂固定化 分別稱取已預(yù)處理的201×4陰離子交換樹脂及D201大孔陰離子交換樹脂各1.0 g于10 mL離心管中，加入pH 7.5的酶液6 mL，4℃、100 r/min下振蕩固定化2 h?；旌衔? 000 g離心5 min，測定上清酶活。后用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌至無酶析出，測定洗滌液酶活性及固定化酶活力，計(jì)算固定化酶載量及酶活回收率。

將固定化的黃嘌呤氧化酶，置于50℃恒溫水浴，2 h后測定酶活力，各組以未加熱處理的固定化酶酶活為100%，計(jì)算各組固定化酶的相對酶活。

1.7.2 瓊脂糖介質(zhì)的修飾及其固定化 參考文獻(xiàn)方法[19]，分別先將間隔臂甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸交聯(lián)于預(yù)處理的瓊脂糖介質(zhì)上，3種修飾后的介質(zhì)分別命名為瓊脂糖-甘氨酸介質(zhì) （Sepharose-Gly）、瓊脂糖-谷氨酸介質(zhì)（Sepharose-Glu）、瓊脂糖-天冬氨酸介質(zhì)（Sepharose-Asp）。稱取不同的羧基載體各1.0 g于10 mL離心管中，添加酶液，調(diào)節(jié)pH至6.5，加入EDC共價交聯(lián)固定化黃嘌呤氧化酶，4℃振蕩固定15 h，混合物8 000 g離心5 min，測定上清酶活。后用0.6 mol/L氯化鈉洗脫非共價交聯(lián)的酶，至洗脫液無酶析出，再用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，測定洗脫液、洗滌液酶活性及固定化酶活力，計(jì)算固定化酶載量及酶活回收率。

將各修飾的瓊脂糖固定化酶置于50℃恒溫水浴，2 h后測定酶活力，各組以未加熱處理的固定化酶酶活為100%，計(jì)算各組固定化酶的相對酶活。

1.8 固定化化酶與游離酶熱穩(wěn)定性的比較

1.8.1 不同溫度下固定化酶與游離酶熱穩(wěn)定性比較 將游離酶與固定化酶置于20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）中，不同溫度下（25、35、45、55、65、75℃）保溫1 h，冷卻至4℃，測定各組酶活。以各組未做處理酶的酶活為100%，計(jì)算相對酶活。

1.8.2 固定化酶與游離酶最適穩(wěn)定pH的比較 將酶液于不同 pH 條件下（5.5～8.5），50 ℃保溫 1 h，冷卻至4℃，測定各組酶活，各組以0 h時酶活為100%，計(jì)算相對酶活。

1.8.3 固定化酶與游離酶存儲穩(wěn)定性的比較 將固定化酶與游離酶置于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.5）中，置于50℃恒溫水浴，定時取樣，冷卻至4℃，測定固定化酶與游離酶酶活力，各組以0 h時酶酶活為100%，計(jì)算各組不同時間處相對酶活。

2 結(jié)果與討論

2.1 XOD酶學(xué)性質(zhì)分析

2.1.1 XOD相對分子量的確定 由前期研究SDSPAGE電泳測得，菌種Arthrobacter M3產(chǎn)的黃嘌呤氧化酶含兩個亞基，相對分子質(zhì)量分別約為100 000及35 000[17]。由圖1凝膠過濾圖譜知，黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品（相對分子質(zhì)量160 000）凝膠過濾出峰時間為11.64 min，Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶出峰時間則為11.98 min，即比黃嘌呤氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品相對分子質(zhì)量略小。綜合判定，節(jié)桿菌Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶為相對分子質(zhì)量約135 000的異質(zhì)二聚體蛋白。

圖1 XOD標(biāo)準(zhǔn)品與來自Arthrobacter M3的XOD凝膠過濾圖譜Fig.1 Elution profile of standards and the XOD from Arthrobacter M3 by size -exclusion chromatography

2.1.2 XOD的最適反應(yīng)溫度及最適反應(yīng) pH溫度是影響酶反應(yīng)效率的重要因素之一，一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)溫度可加快反應(yīng)速率。在25～52℃范圍內(nèi)進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，37℃時測得XOD酶活力最高。

在不同pH值下進(jìn)行酶酶活力測定，結(jié)果見圖3。該酶最適反應(yīng)pH為7.5，溶液pH＜5.5或pH＞9.0時對酶活力測定影響較大。

2.1.3 金屬離子對酶活的影響 如表1所示，不同金屬離子對XOD酶活影響具有差異性。Mn2+對XOD活性具有激活作用，相對酶活提高35.6%，Co2+及Zn2+對XOD酶活具有一定抑制作用，相對酶活分別降低 21.1%和 67.8%，Cu2+、Ag+、Hg2+對 XOD 酶活具有致死作用，這可能是由于3種金屬離子作用于蛋白巰基，導(dǎo)致XOD變性失活。

圖2 溫度對XOD酶活力測定的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of XOD

圖3 pH對XOD酶活力測定的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of XOD

表1 不同金屬離子對XOD活性的影響Table 1 Effect of various metal ions on the activity of XOD

2.2 XOD固定化方法比較

由表2可知，黃嘌呤氧化酶經(jīng)不同方法固定化后，其熱穩(wěn)定性均不同程度的提高。

大孔陰離子交換樹脂固定化，D201樹脂的固定化效率優(yōu)于201×4樹脂，這可能是由于D201樹脂為大孔陰離子交換樹脂，相比于普通201×4樹脂，其顆粒內(nèi)縫隙孔徑較大，有利于蛋白及底物的進(jìn)出。

修飾的瓊脂糖介質(zhì)固定化，3種固定化酶中，瓊脂糖-谷氨酸介質(zhì)固定化酶，酶活回收率及熱穩(wěn)定性最佳，固定化酶載量稍低于瓊脂糖-甘氨酸介質(zhì)固定化的酶。這可能是由于，谷氨酸含有兩個游離羧基，瓊脂糖-谷氨酸介質(zhì)可多點(diǎn)交聯(lián)XOD，使固定化酶更加牢固，穩(wěn)定性增加，這同時也可能引起底物進(jìn)入酶催化中心受阻，使得固定化酶表觀酶活力（載量）下降。

綜合比較，修飾的瓊脂糖介質(zhì)固定效果化優(yōu)于大孔陰離子交換樹脂，D201及201×4為含苯乙烯-二乙烯苯骨架的離子交換樹脂，對XOD的固定化作用主要靠離子鍵及疏水相互作用。而修飾的瓊脂糖介質(zhì)靠共價交聯(lián)的方法固定XOD，結(jié)合作用力強(qiáng)于D201及201×4樹脂，這可能致使其固定化效果優(yōu)于D201及201×4樹脂。

表2 不同載體對XOD固定化的影響Table 2 Effect of different supports on immobilization of XOD

2.3 固定化酶與游離酶熱穩(wěn)定性的比較

2.3.1 固定化酶與游離酶不同溫度下熱穩(wěn)定性比較 由上述固定化結(jié)果可知，瓊脂糖-谷氨酸介質(zhì)固定化效率最佳，因此對其與游離酶的熱穩(wěn)定性性能進(jìn)行比較。由圖4可知，不同溫度下保溫1 h，固定化的黃嘌呤氧化酶熱穩(wěn)定均優(yōu)于游離酶。75℃保溫1 h，游離酶已幾乎無酶活，瓊脂糖-谷氨酸固定化酶仍剩余22.1%。

2.3.2 固定化酶與游離酶最適穩(wěn)定pH分析 由圖5可知，在 pH 5.5～8.5范圍內(nèi)，50℃保溫 1 h，瓊脂糖-谷氨酸固定化酶剩余的相對酶活均高于45%，而游離酶在較低酸堿條件下加熱處理，酶活損失較大。pH 8.5下剩余的相對酶活僅為2.1%。由此可知，瓊脂糖-谷氨酸固定化酶比游離酶具有更強(qiáng)的酸堿抵抗能力。

圖4 不同溫度下游離酶與固定化酶熱穩(wěn)定性比較Fig.4 Comparison of the stability between free and immobilized xanthineoxidaseunderdifferent temperatures

圖5 游離酶與固定化酶的pH穩(wěn)定性Fig.5 pH stability of free and immobilized xanthine oxidase

2.3.3 固定化酶與游離酶存儲穩(wěn)定性的比較 將瓊脂糖-谷氨酸固定化酶與游離酶置于50℃保溫，二者相對酶活隨時間變化曲線見圖6。由圖可知，游離酶放置3 h后，相對酶活僅剩余8.0%，而瓊脂糖-谷氨酸固定化酶仍剩余48.3%，半衰期由游離酶的0.84 h延長至固定化酶的2.2 h，提高了1.6倍。

圖6 固定化酶與游離酶存儲穩(wěn)定性Fig.6 Storage stability of free and immobilized xanthine oxidase

3 結(jié)語

節(jié)桿菌Arthrobacter M3黃嘌呤氧化酶為含兩個不同亞基的異質(zhì)二聚體，相對分子質(zhì)量為135 000，與所報(bào)道文獻(xiàn)中均不同，其最適反應(yīng)溫度為37℃，最反應(yīng)pH為7.5。采用修飾的瓊脂糖介質(zhì)及大孔陰離子交換樹脂對黃嘌呤氧化酶進(jìn)行固定化，發(fā)現(xiàn)以修飾的瓊脂糖介質(zhì)固定化的酶熱穩(wěn)定性較好，其中以瓊脂糖-谷氨酸固定化的酶性能最佳，50℃下半衰期提高了1.6倍，有效提高了黃嘌呤氧化酶穩(wěn)定性，為其在醫(yī)學(xué)診斷及工業(yè)催化中的穩(wěn)定應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，后期將進(jìn)一步探索改造黃嘌呤氧化酶穩(wěn)定性的方法。

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