西沙野生諾尼果內(nèi)生菌的分離與鑒定*

李金霞，曹艷花，白飛榮，程池，譚望橋，肖冬光

1(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津，300457)

2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100027)

3(海南諾尼生物工程開發(fā)有限公司，海口，570125)

諾尼果是一種安全的可食用熱帶水果，在熱帶地區(qū)有著悠久的食用歷史，最早可追溯到17世紀(jì)晚期。1943年，美國政府將這種水果認(rèn)定為可食用植物資源;2003年，歐盟委員會提名諾尼果汁為一種新資源食品;2010年5月，中國衛(wèi)生部批準(zhǔn)諾尼果漿為新資源食品?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究證明，諾尼果和果汁對某些疾病具有一定的治療和輔助治療作用，如抗腫瘤、提高免疫力、抗氧化、護(hù)肝、抗菌消炎、改善糖尿病、抗血脂、降血壓、改善痛風(fēng)等。近幾年來，隨著研究的不斷深入和新功能的不斷發(fā)現(xiàn)，諾尼果已經(jīng)成為世界藥用植物和保健飲料的新寵。

諾尼成熟的果實呈橢圓形，肉質(zhì)肥厚，外觀有浮雕感，有12 cm或者更大，表面凹凸不平，有一種腐熟的氣味。目前已從諾尼果中已分離得到許多不同種類的化合物，包括氨基酸類、蒽醌類、香豆素類、脂肪酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類、多糖、甾醇類、糖類、含硫化合物、萜類和著名的賽洛寧原［1］。這些化合物當(dāng)中有些已經(jīng)被證實與其功能相關(guān)聯(lián)，如多糖被認(rèn)為與其提高免疫力和抗腫瘤活性有關(guān)［2－3］，木脂素類化合物與抗氧化活性有關(guān)［4］。

植物內(nèi)生菌(Plant Endophyte)是指在其生活史中的某一段時期生活在健康植物組織內(nèi)部，不引起植物組織明顯侵染及癥狀改變的一類菌，包括真菌、細(xì)菌、放線菌［5］。1993年，Strobel首次報道從短葉紫杉(Taxus brevifolia)的樹皮中分離出1株內(nèi)生真菌(Taxomyces andreanae)能產(chǎn)生紫杉醇后［6］，掀起了在藥用植物中尋找功能性植物內(nèi)生菌的研究熱潮。諾尼果作為一種新興的保健食材，前期本課題組已對其種子內(nèi)生菌進(jìn)行過一些初探，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)生細(xì)菌與真菌群落結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)明顯的多樣性，并首次分離獲得了一批諾尼種子內(nèi)生菌資源［7－9］，在此基礎(chǔ)上，本研究采集了我國三沙市永興島的野生諾尼果，對其果實內(nèi)生菌進(jìn)行系統(tǒng)的分離與鑒定，為下一步研究這些內(nèi)生菌與諾尼果功效性成分之間的相關(guān)性及功能性菌種的篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 諾尼果實樣品的采集

西沙野生諾尼成熟果實，于2012年12月采集自中國海南省三沙市永興島，具體位置為北緯16.83°，東經(jīng)112.34°。無菌袋密封冷藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB及R2A成品培養(yǎng)基，購自北京陸橋公司;玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，購自北京三藥科技開發(fā)公司。

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒及相關(guān)分子生物學(xué)試劑均購自TIANGEN公司;PCR引物由北京諾賽生物公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 諾尼果表面滅菌

將諾尼果用無菌水徹底清洗干凈表面，然后依次用70%乙醇浸泡3 min，2.6%次氯酸鈉浸泡5 min，70%乙醇清洗30 s，最后用無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸取表面多余水分。將最后一次清洗的水少量涂布于R2A檢測平板上作為對照用于表面滅菌效果的檢測，要求對照平板無菌落生長，確保表面滅菌徹底［10］。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量測定及菌株分離

采用稀釋平板涂布法分離測定諾尼果內(nèi)生菌。將10 g表面滅菌干凈的樣品剪碎，于無菌研缽中加入少量滅菌的石英砂和碳酸鈣及少量無菌水充分研磨，然后依次用無菌水稀釋成濃度為10－1、10－2、10－3懸液。分別取100 μL涂布于R2A、LB和玫瑰紅鈉平板(含100 mg/L氯霉素)上，每個稀釋度3個平行。細(xì)菌28℃培養(yǎng)3 d，真菌28℃培養(yǎng)3～5 d。對平板上的單菌落進(jìn)行計數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)(大小、形狀、顏色、表面光澤度、邊緣整齊度、透明度等)，隨機(jī)挑取平板上具有差異的代表性菌落，純化后將其接種于相對應(yīng)斜面培養(yǎng)基4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列分析

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN)提取菌株基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板。采用細(xì)菌通用引物27F(5’-AGAGTTTCATCTGGCTCAG-3’)和 1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)對菌株16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR 反應(yīng)體系(50 μL):10 × buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)4 μL、引物 27F(10 mmol/L)1 μL、引物 1492R(10 mmol/L)1 μL、Taq 酶(5U/L)0.25 μL、DNA 模板3 μL、ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。PCR 反應(yīng)程序:94℃ 5 min;94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán);72℃ 10 min。1%瓊脂糖檢測凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。采用ABI 3730型DNA測序儀測序(ABI，USA)，將序列信息提交至NCBI，并將測序得到的結(jié)果在EzTaxon server 2.1進(jìn)行比對，確定與已知序列的同源關(guān)系。

1.2.4 內(nèi)生真菌的ITS rDNA和26S rDNA D1/D2序列分析

采用CTAB法提取內(nèi)生真菌基因組DNA［11］，霉菌采用通用引物:ITS1(5'-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')擴(kuò)增 ITS rDNA基因序列;酵母采用通用引物:NL1(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')和NL4(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')擴(kuò)增26S rDNA D1/D2區(qū)基因。

PCR反應(yīng)體系同1.5.1。

1.2.5 諾尼果內(nèi)生菌rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

將獲得的所有諾尼果內(nèi)生菌進(jìn)行rDNA部分序列測定，并將測定的諾尼果內(nèi)生菌序列提交至Gen-Bank。真菌序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行BLAST比對分析，細(xì)菌序列利用EzBioCloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)進(jìn)行序列比對分析，確定與已知模式菌株序列同源性關(guān)系。用ClustalX 1.83軟件對測定序列及其模式菌株序列進(jìn)行比對，并用MEGA 4.0軟件以鄰接法(Neighbor-Joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［12］，自展值(Bootstrap values)設(shè)定為1000，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾尼果內(nèi)生菌菌落計數(shù)結(jié)果

諾尼果樣品中內(nèi)生菌菌落總數(shù)、酵母菌和霉菌總數(shù)測定結(jié)果見表1。

表1 諾尼果內(nèi)生菌計數(shù)結(jié)果Table 1 Count results of endophytes in Noni fruit

由結(jié)果可以看出，諾尼果內(nèi)生菌主要以細(xì)菌為主，達(dá)到(0.7～1.0)×105CFU/g;而真菌則以酵母為主，達(dá)到7.9×103CFU/g，占總內(nèi)生菌總數(shù)量的1%左右;霉菌數(shù)量最少，只能達(dá)到9.0×102CFU/g，占內(nèi)生菌總數(shù)量的0.1%左右。

2.2 諾尼果內(nèi)生菌的分離純化及形態(tài)描述

通過傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)共獲得諾尼果內(nèi)生菌45株，其中細(xì)菌22株，酵母14株和霉菌9株。其代表性菌落形態(tài)特征如表2所示。

2.3 內(nèi)生菌的PCR擴(kuò)增和序列測定

用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取諾尼果內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA，以菌株基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物條帶單一，大小約為1 500bp，將PCR產(chǎn)物測序，并將測得的序列登錄GenBank并獲得登錄號(KC841436－KC841445)。

成功提取14株內(nèi)生酵母菌和9株內(nèi)生霉菌基因組DNA，PCR擴(kuò)增得到酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)和霉菌ITS rDNA的序列片段條帶大小均為500－600bp。將PCR產(chǎn)物測序并將測得的序列提交至GenBank并獲得登錄號(KC845929－KC845934、KC845936、KC845937、KC845939 及 KC845940)。

2.4 諾尼果內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

諾尼果內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列比對分析結(jié)果如表3所示，通過16S rDNA序列比對分析結(jié)果和構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)可以得出，22株諾尼果內(nèi)生細(xì)菌分屬于α變形菌綱(α-Proteobacteria)、β變形菌綱(β-Proteobacteria)、γ 變形菌綱(γ-Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和放線菌門(Actinobacteria)5個類群。

表3 培養(yǎng)方法分離諾尼果實內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列相似性分析Table 3 Sequence analysis of 16S rDNA of endophytic bacteria from the Noni fruit

屬于變形菌門(Proteobacteria)中α變形菌綱的有3株，分別為亞西亞菌屬(Asaia sp.)和根瘤菌屬(Rhizobium sp.)，其中CICC 10562與茂物亞西亞菌(Asaia bogorensis)模式菌株的相似性最高為99.93%，CICC 10564同Asaia spathodeae模式菌株的相似性最高為99.93%，CICC 10579同多寄生根瘤菌(Rhizobium multihospitium)模式菌株的相似性最高為98.81%。

屬于變形菌門(Proteobacteria)中β變形菌綱的有1株，為伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia sp.)，CICC 10574與唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)模式菌株的相似性最高為99.62%。

屬于變形菌門(Proteobacteria)中的γ變形菌綱的有3株，分別為泛菌屬(Pantoea sp.)和藤黃色桿菌屬(Luteibacter sp.)。其中CICC 10575與斯氏泛菌產(chǎn)吲哚亞種(Pantoea stewartii subsp.indologenes)模式菌株的相似性最高為99.71%，CICC 10576與分散泛菌(Pantoea dispersa)模式菌株的相似性最高為100.0%，CICC 10591與人類藤黃色桿菌(Luteibacter anthropi)模式菌株的相似性最高為99.57%。

圖1 鄰接法構(gòu)建的諾尼果內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed with endophytic bacteria isolated from the fruit of Noni

屬于厚壁菌門(Firmicutes)的菌種有1株，為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)，CICC 10580與多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)模式菌株的相似性最高為98.98%。

屬于放線菌門(Actinobacteria)的菌種有2株，分別為黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)和短小桿菌屬(Curtobacterium sp.)，其中CICC 10572與海泥黃桿菌(Flavobacterium oceanosedimentum)模式菌株的相似性最高為99.85%，CICC 10583與檸檬色短小桿菌(Curtobacterium citreum)模式菌株的相似性最高為100.0%。

2.5 諾尼果內(nèi)生真菌的26S rDNA D1/D2區(qū)和ITS rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

諾尼果內(nèi)生真菌的ITS rDNA序列和26S rDNA D1/D2區(qū)比對分析結(jié)果如表4所示，通過26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對分析結(jié)果和構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)可以得出，14株酵母菌屬于擔(dān)子菌門 (Basidiomycota)中的 Tremellomycetes(銀耳綱)、黑粉菌綱(Ustilaginomycetes)和外擔(dān)菌綱(Exobasidiomycetes);通過ITS rDNA區(qū)序列比對分析結(jié)果和構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)可以得出9株霉菌屬于子囊菌門(Ascomycota)的糞殼菌綱(Sordariomycetes)和散囊菌綱 (Eurotiomycetes)。

圖2 鄰接法構(gòu)建的諾尼果內(nèi)生酵母26S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed with endophytic yeast isolated from the Noni fruit

圖3 鄰接法構(gòu)建的諾尼果內(nèi)生真菌ITS rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree constructed with endophytic mold isolated from the Noni fruit

屬于Tremellomycetes(銀耳綱)的酵母菌有1株，為隱球酵母菌屬(Cryptococcus sp.)，CICC 32979與淺黃隱球酵母(Cryptococcus flavescens)相似性為99%。屬于黑粉菌綱(Ustilaginomycetes)的酵母菌有2株，為Pseudozyma sp.，其中 CICC 32967與 Pseudozyma hubeiensis同源性為99%，CICC 32971與Pseudozyma aphidis同源性為99%;屬于外擔(dān)菌綱(Exobasidiomycetes)有2株，分別為Sympodiomycopsis sp.和假囊酵母屬(Eremothecium sp.)，其中CICC 32978與Sympodiomycopsis kandeliae同源性為99%，CICC 32989與Eremothecium coryli同源性為99%。

屬于糞殼菌綱(Sordariomycetes)的霉菌有4株，分別為赤霉菌屬(Gibberella sp.)、枝孢菌屬(Cladosporium sp.)、Nemania sp.和Daldinia sp.。其中CICC 2499與串珠赤霉菌(Gibberella moniliformis)同源性為100%，CICC 2507與球孢枝孢 (Cladosporium sphaerospermum)同源性為100%，CICC 2513與Nemania primolutea同源性為 99%，CICC 2517與 Daldinia eschscholzii同源性為99%;屬于散囊菌綱(Eurotiomycetes)有1株，為青霉屬(Penicillium sp.)，CICC 2515與橘青霉(Penicillium citrinum)同源性為100%。

3 討論

目前的研究已發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌廣泛分布于植物的根、莖、葉、花、果實和種子等器官組織中，其種類、數(shù)量、分布與植物的種類有關(guān)。內(nèi)生菌不僅能夠參與植物次生成分的合成或?qū)χ参锎紊x產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而且還能夠獨立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物，是天然產(chǎn)物的重要來源。因此對諾尼果內(nèi)生菌的研究具有重要的科學(xué)和應(yīng)用價值。

諾尼果含有蛋白質(zhì)、還原糖、脂肪、維生素C等營養(yǎng)成份和黃酮、皂甙、多糖等功能性成份［13］，同時還含有豐富的鉀、鎂、磷、銅、鐵等礦物質(zhì)，成熟時果肉多汁，呈凝膠狀。豐富的化學(xué)成份為內(nèi)生菌的生長和繁殖提供良好的生存環(huán)境，本研究發(fā)現(xiàn)諾尼果中內(nèi)生菌種資源非常豐富，總量達(dá)到(0.7～1.0)×105，主要以細(xì)菌為主，也分離出了酵母和霉菌等內(nèi)生真菌，酵母菌總量為7.9×103CFU/g，霉菌數(shù)量較少，為9.0×102CFU/g。進(jìn)一步通過分離和鑒定，共得到22株細(xì)菌，14株酵母和9株霉菌，涉及17個屬20個種。

內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)形態(tài)分析和分子鑒定確定分屬于亞西亞菌屬(Asaia sp.)、泛菌屬(Pantoea sp.)、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia sp.)、根瘤菌屬(Rhizobium sp.)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)、黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)、短小桿菌屬(Curtobacterium sp.)、藤黃色桿菌屬(Luteibacter sp.)等8個屬，這些菌種均屬于常見的植物促生細(xì)菌。其中，亞西亞菌屬(Asaia sp.)和泛菌屬(Pantoea sp.)為諾尼果中的優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌，據(jù)報道，亞西亞菌屬(Asaia sp.)的一些菌種具有固氮活性，本研究中分離的2株菌種分別與茂物亞西亞菌(Asaia bogorensis)和Asaia spathodeae菌種同源性最高，茂物亞西亞菌具有纖維素生物合成活性［14］，Asaia spathodeae為2010年從非洲郁金香中分離的一株新種［15］，在國內(nèi)屬首次發(fā)現(xiàn)。泛菌屬(Pantoea sp.)是水稻、黃瓜、香蕉、黃花蒿等植物的常見內(nèi)生菌，具有拮抗多種植物病原真菌、促生、固氮、抑菌等多種特性，其中分散泛菌(Pantoea dispersa)對水稻白葉枯病菌具有良好的拮抗作用［16］。伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia sp.)中唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)對辣椒疫霉、大麗輪枝菌、煙草疫霉和立枯絲核菌等植物病原菌都有一定的拮抗作用，且該菌還具有溶磷的特性［17］。根瘤菌屬(Rhizobium sp.)是目前研究最多的植物固氮菌［18］。類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)中的多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)對植物具有促進(jìn)光合作用、防治胡椒瘟?。?9］等作用。黃桿菌屬(Flavobacterium sp.)菌種具有產(chǎn)脂肪酶、纖維素酶等用途，有研究表明在藥用植物黃花蒿存在［20］。短小桿菌屬(Curtobacterium sp.)為黃瓜初花期葉片內(nèi)優(yōu)勢內(nèi)生細(xì)菌［21］，在馬鈴薯組培苗上也曾分離出該菌種，對馬鈴薯組培苗生長有促進(jìn)作用［22］。有研究表明，來源于紅豆杉植物的枝葉及其生長周圍的土壤中的1株藤黃色桿菌屬(Luteibacter sp.)菌種對三尖杉寧堿具有轉(zhuǎn)化作用［23］。

14株內(nèi)生酵母中，包括隱球酵母菌屬(Cryptococcus sp.)和Pseudozyma sp.、Sympodiomycopsis sp. 和假囊酵母屬(Eremothecium sp.)4個屬。隱球酵母菌屬(Cryptococcus sp.)和Pseudozyma sp.為優(yōu)勢菌種，這兩種菌種是目前常用的生物防治菌種，其中淺黃隱球酵母(Cryptococcus flavescens)可用于小麥和大麥等赤霉病的生物防治［24］。Pseudozyma sp.可以產(chǎn)生脂肪酸類衍生物，具有廣譜抗菌活性［25］。Sympodiomycopsis sp.屬中Sympodiomycopsis kandeliae為2011年從秋茄花中分離出來的一個內(nèi)生真菌新種［26］。

9株霉菌均屬于子囊菌門(Ascomycota)，包括枝孢屬(Cladosporium sp.)、赤霉菌屬(Gibberella sp.)、輪層炭菌屬(Daldinia sp.)、Nemania sp.和青霉屬(Penicillium sp.)。其中枝孢屬(Cladosporium sp.)、赤霉菌屬(Gibberella sp.)為優(yōu)勢菌種。枝孢屬(Cladosporium sp.)中球孢枝孢(Cladosporium sphaerosper-mum)曾被報道具有產(chǎn)耐高溫、堿性纖維素酶活［27］，也有報道發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液具有抗腫瘤活性［28］。赤霉菌屬(Gibberella sp.)中串珠赤霉菌(Gibberella moniliformis)為常見植物病害菌，產(chǎn)生的赤霉菌素為植物激素，具有打破種子休眠、促進(jìn)發(fā)芽、刺激生長、增加產(chǎn)量等作用［29］。

通過本研究的實施，獲得了一批內(nèi)生菌菌種資源，這些資源中有些菌種可能具有良好的代謝性能，如分離出的幾株酵母菌，其菌落形態(tài)為粘稠狀，可能具有產(chǎn)多糖性能，而有報道顯示，諾尼中的多糖具有抗腫瘤和抗氧化等功效［30］，因此這些菌種具有潛在的應(yīng)用和開發(fā)價值。目前諾尼果汁生產(chǎn)過程的一個重要環(huán)節(jié)是果實的后熟，此階段諾尼果由硬變軟，并伴隨著滲出液產(chǎn)生，是諾尼果自身所含有的內(nèi)生菌與果相互作用的過程，因此分析諾尼果的內(nèi)生菌組成，進(jìn)而研究內(nèi)生菌的代謝性能，為更好地利用和開發(fā)諾尼這種藥食同源的保健食材具有重要的意義。

［1］ 張偉敏，魏靜，施瑞誠，等．Noni果的活性成分和生理功能的研究進(jìn)展［J］．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2007，19:1 087－1 091．

［2］ Hirazumi A，F(xiàn)urusawa E．An immunomodulatory polysaccharide-rich substance from the fruit juice of Morinda citrifolia(noni)with antitumor activity［J］．Phytother Res，1999，13(15):380－387．

［3］ Furusawa E，HirazumiA，Story S，et al．Antitumour potential of a polysaccharide-rich substance from the fruit juice of Morinda citrifolia(Noni)on sarcoma 180 ascites tumour in mice ［J］．Phytother Res，2003，17(10):1 158－1 164．

［4］ Kamiya K，Tanaka Y，Endang H，et al．Chemical constituents of Morinda citrifolia fruits inhibit copper-induced lowdensity lipoprotein oxidation［J］．J Agric Food Chem，2004，52(19):5 843－5 848．

［5］ 趙旭，常思靜，景春娥，等．我國植物內(nèi)生菌研究進(jìn)展［J］．中國沙漠，2010，30(1):87－90．

［6］ Stierle A，Strobel G，Sterle D．Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophylic fungus of Pacific yew［J］．Science，1993，260(5105):214 －216．

［7］ 程池，劉洋，曹艷花，等．西沙野生諾尼種子內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選［J］．生物技術(shù)通報，2013(9):142－145．

［8］ 劉洋，李輝，李金霞，等．西沙野生諾尼種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的初步研究［J］．生物技術(shù)通報，2013(10):142－147．

［9］ 程池，李輝，劉洋，等．西沙野生諾尼種子內(nèi)生真菌的群落多樣性［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(9):7－10．

［10］ 劉洋，左山，鄒媛媛，等．雜交玉米農(nóng)大108及其親本種子內(nèi)生細(xì)菌群落多樣性的研究［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44(23):4 763－4 771．

［11］ 易潤華，朱西儒，周而勛．簡化CTAB法快速微量提取絲狀真菌DNA［J］．湛江海洋大學(xué)學(xué)報，2003，23(6):72－73．

［12］ Tamura K，Dudley J，Nei M，et al．MEGA4:molecular evolutionary genetics analysis(MEGA)software version 4.0［J］．Molecular Biology and Evolution，2007，24(8):1 596－1 599．

［13］ 張偉敏，符文英，施瑞，等．諾麗果實和葉中主要功能性物質(zhì)的分布與營養(yǎng)評價［J］．食品科學(xué)，2008，29(10):575－577．

［14］ Kumagai A，Mizuno M，Kato N，et al．Ultrafine cellulose fibers produced by Asaia bogorensis，an acetic acid bacterium［J］．Biomacromolecules，2011，12(7):2 815 －2 821．

［15］ Jintana Kommanee，Somboon Tanasupawat，Pattaraporn Yukphan，et al．Asaia spathodeae sp．nov．，an acetic acid bacterium in the α-Proteobacteria［J］．J Gen Appl Microbiol，2010，56:81 －87．

［16］ 洪永聰，胡方平，陳慶河，等．從稻谷上分離、篩選用于拮抗水稻白葉枯病的泛菌［J］．福建農(nóng)業(yè)科技，2011(4):1－3．

［17］ 胡曉峰，郭晉云，張楠，等．一株溶磷抑病細(xì)菌的篩選及其溶磷特性［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(11):2 253－2 260．

［18］ 陳文新，汪恩濤，陳文峰．根瘤菌-豆科植物共生多樣性與地理環(huán)境的關(guān)系［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37(1):81－86．

［19］ 史應(yīng)武，婁愷，李春，等．內(nèi)生多粘類芽孢桿菌S-7對甜菜光合作用及產(chǎn)量和品質(zhì)的影響［J］．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2009，20(3):597－ 602．

［20］ 劉金花，吳玲芳，章華偉．黃花蒿內(nèi)生菌的分離與初步鑒定［J］．氨基酸和生物資源，2011，33(4):27－30．

［21］ 孫占斌，袁行方，王音嫻．黃瓜初花期與結(jié)瓜期葉片可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌多樣性研究［J］．微生物學(xué)通報，2012，39(6):764－772．

［22］ 沈麗珍，梁峰，王忠，等．馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌StC01的鑒定與促生作用［J］．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008(1):143－146．

［23］ 李建華．三尖杉寧堿的微生物轉(zhuǎn)化與10-去乙酰紫杉醇的酶法合成［D］．北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2007．

［24］ 韓青梅，曹麗華．小麥赤霉病的生物防治研究進(jìn)展［J］．麥類作物學(xué)報，2003，23(3):128－131．

［25］ 馬格尼特·萊維，阿維娃·加夫尼．PSEUDOZYMA APHIDIS as a biocontrol agent against various plant pathogens［P］．CN，103025170 A．2013 －04 －03．

［26］ Yu-Hui Wei，Guey-Yuh Liou，Hsin-Yi Liu，et al．Sympodiomycopsis kandeliae sp．nov．，a basidiomycetous anamorphic fungus from mangroves，and reclassification of Sympodiomycopsis lanaiensis as Jaminaea lanaiensis comb．nov．［J］．International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2011，61(2):469－473．

［27］ 甄靜，王繼雯，謝寶恩，等．一株纖維素降解真菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)分析［J］．微生物學(xué)通報，2011，5:709－714．

［28］ 王鴻，謝燕瑾，葉建軍，等．一株海洋真菌分枝孢子菌屬真菌球孢枝孢及其應(yīng)用［P］．CN，201210308285．2013－02－06．

［29］ 郝燕芳，張俊國．淺談赤霉素在蔬菜上的使用技術(shù)［J］．農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2012(14):38－39．

［30］ Eiichi Furusawa，Anne Hirazumi，Stephen Story，et al．Antitumour potential of a polysaccharide-rich substance from the fruit juice of Morinda citrifolia(Noni)on sarcoma 180 ascites tumour in mice ［J］．Phytother Res，2003，17(10):1 158－1 164．