不同蛋白酶的豬、兔骨酶解液對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的比較

曾 珍， 李 誠(chéng)， 付 剛， 蘇 趙， 楊 勇， 何 利， 胡 濱

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

我國(guó)是各類動(dòng)物骨生產(chǎn)的大國(guó)，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年約有2 183萬t的各類動(dòng)物骨骼產(chǎn)生[1]，但絕大多數(shù)骨頭都沒有得到充分利用。骨頭含有大量的骨膠原蛋白，這些蛋白質(zhì)所含氨基酸種類較為豐富[2]，是一種良好的蛋白源。近年來針對(duì)動(dòng)物骨的利用開發(fā)引起了科研人員的關(guān)注，特別是通過水解動(dòng)物骨獲得功能肽成為了研究的熱點(diǎn)。趙玲等人從鱈魚骨里提取出具有抗氧化作用的膠原蛋白肽[3]。Saiga等人也從雞腿骨里提取出了具有抗高血壓活性的多肽，其氨基酸序列為Gly-Ala-Hyp-Gly-Leu-Hyp-Gly-Pro，且其活性較高（IC50=29 mmoL/L）[4]。YANG Hua等人用木瓜蛋白酶從羊骨里提取出免疫活性肽[5]。免疫活性肽通常被認(rèn)為是一種能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力[6]、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能[7]、提高機(jī)體抵御外界病原體感染能力[8]，因其相對(duì)分子質(zhì)量低、活性強(qiáng)、用量少、穩(wěn)定性強(qiáng)、生物活性高的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)受到了人們的重視。作者采用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶分別水解豬骨、兔骨，研究各水解產(chǎn)物的對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性，為利用豬、兔骨制備免疫活性肽提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬骨（豬后腿股骨頭）、兔骨（除頭骨以外的全身骨骼）：市售；昆明種小鼠：5周齡，體重18 g，雌性，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院提供；胰蛋白酶（7.8×104U/g）、木瓜蛋白酶（13×104U/g）：廣西南寧龐博生物有限公司；Alcalase 堿性蛋白酶（11.5×104U/g）：丹麥NOVO公司；其它試劑：均為分析純。

1.2 主要儀器

BR4i型多功能冷凍離心機(jī)：法國(guó)THERMO JOUAN公司；iMark酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)伯樂公司；311型CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)Thermo Scientific公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市富華儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì)：方舟科技公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 酶解工藝流程 豬、兔骨（剔凈殘肉、皮、腱、軟骨及其它非骨骼成分）→宰碎至5～6 cm→脫脂（1∶1 甲醛/氯仿 37 ℃，浸泡 24 h）[9]→蒸餾水清洗（除去殘?jiān)邏赫糁? h（0.1 MPa，121℃）→常溫干燥→粉碎→過篩（80目）→加入100 mL蒸餾水→混勻→預(yù)處理（90℃熱處理10 min）→冷卻至常溫→調(diào)節(jié)pH到指定值→加入一定量的酶在指定溫度下酶解指定的時(shí)間→滅酶 （100℃、10 min）→離心過濾（8 000 g 20 min），取上清液測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖率。

1.3.2 豬、兔骨酶解工藝參數(shù)的單因素實(shí)驗(yàn)

1）底物濃度對(duì)酶解效果的影響：用胰蛋白酶（溫度50℃、pH 8、酶底比5 000 U/g、水解時(shí)間4 h）、木瓜蛋白酶（pH 7、酶底比 5 000 U/g、水解時(shí)間4 h，水解溫度60℃）和Alcalase堿性蛋白酶（pH 9、酶底比6 000 U/g、水解時(shí)間2 h、溫度55℃）酶解不同底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、4%、6%、8%、10%的豬、兔骨，測(cè)定其對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率。

2）溫度對(duì)酶解效果的影響：以小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率為指標(biāo)，在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、pH 8、酶底比5 000 U/g、水解時(shí)間4 h的條件下研究不同水解溫度 30、40、50、60、70 ℃對(duì)胰蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、pH 7、酶底比5 000 U/g、水解時(shí)間4 h條件下，研究不同水解溫度 50、55、 60、65、70 ℃對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、pH 9、酶底比6 000 U/g、水解時(shí)間 2 h下研究40、45、50、55、60 ℃對(duì) Alcalase 堿性蛋白酶酶解效果的影響。

3）pH值對(duì)酶解效果的影響：以小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率為指標(biāo)，在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、水解溫度50℃、酶底比5 000 U/g、水解時(shí)間4 h條件下，研究pH 7、7.5、8、8.5對(duì)胰蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、水解溫度60℃、酶底比5 000 U/g、水解時(shí)間5 h條件下，研究不同 pH 5、5.5、6、6.5、7 對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、水解溫度50℃、酶底比6 000 U/g、水解時(shí)間2 h條件下研究 pH 8、8.5、9、9.5、10 對(duì) Alcalase 堿性蛋白酶酶解效果影響。

4）酶與底物蛋白濃度比對(duì)酶解效果的影響：以小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率為指標(biāo)，在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量濃度6%、水解溫度50℃、pH 8、水解時(shí)間4 h條件下，研究不同酶底比 4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g對(duì)胰蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、水解溫度60℃、pH 7、水解時(shí)間4 h條件下，研究不同酶底比4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 U/g 對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%、水解溫度50℃、pH 9、水解時(shí)間2 h的條件下研究不同的酶與底物比 2 000、4 000、6 000、8 000、10 000 U/g對(duì)Alcalase堿性蛋白酶酶解效果的影響。

5）時(shí)間對(duì)酶解效果的影響：以小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率為指標(biāo)，在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，pH 8，溫度50℃，酶底比5 000 U/g條件下，研究不同水解時(shí)間 3、4、5、6、7 h 對(duì)胰蛋白酶酶解效果的影響。在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，pH 7，溫度60℃，酶底比5 000 U/g條件下，研究不同水解時(shí)間2、3、4、5、6 h對(duì)木瓜蛋白酶酶解效果的影響；在豬、兔骨底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，pH 9，溫度50℃，酶底比 6 000 U/g 條件下研究不同酶解時(shí)間 2、3、4、5、6 h對(duì)Alcalase堿性蛋白酶酶解效果的影響。

1.3.3 優(yōu)化豬、兔骨酶解工藝參數(shù)的正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定酶解的底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，選用Alcalase堿性蛋白酶水解豬骨，選用木瓜蛋白酶水解兔骨，選擇水解溫度（℃）、pH值、水解時(shí)間（h）、酶/底物（U/g）作為實(shí)驗(yàn)因子，采用 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。以脾淋巴細(xì)胞增殖率為主要指標(biāo)，確定蛋白酶酶解豬、兔骨蛋白的最佳工藝參數(shù)。

1.3.4 檢測(cè)方法

1）酶活性測(cè)定：福林酚法SB/T 10317-1999。

2）蛋白質(zhì)的測(cè)定：凱氏定氮法（GB5009.5—2010）。

3）水解度的測(cè)定：采用雙指示劑甲醛滴定法[10]。

4）無菌小鼠脾淋巴細(xì)胞制備：小鼠禁食12 h，摘眼球放血后脫頸處死，浸泡在75%的乙醇中3～5 min，于超凈工作臺(tái)上無菌打開腹腔，取出小鼠脾臟置于含有無菌Hanks液的平皿中，去除外周結(jié)締組織，并用無菌Hanks液清洗脾臟，去除血液。用無菌注射器芯擠壓研磨，制成細(xì)胞懸液。用Hanks液洗3次，然后于1 500 r／min離心8 min，棄上清液。然后將細(xì)胞懸浮于2 mL的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中。調(diào)整細(xì)胞濃度為 2.0×106個(gè) ／mL[11-12]。

5）MTT法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞增殖：設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。在96孔板中每孔加入已制備好的小鼠脾細(xì)胞懸液100 μL。對(duì)照組加入RPMI 1640完全培養(yǎng)液 100 μL，實(shí)驗(yàn)組加入 100 μL 酶解液，置于 37℃下5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，再加入MTT 50 μL，4 h培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。室溫下放置15 min后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，于570 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 底物蛋白質(zhì)量濃度對(duì)酶解效果的影響 由圖1可知，隨著底物蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶解液的脾細(xì)胞增殖率也在升高，在6%時(shí)脾細(xì)胞增殖率達(dá)到最高，而后脾細(xì)胞增殖率開始下降。因此6%為最適的底物濃度。

圖1 底物蛋白濃度對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響Fig.1 Effect of Substrate concentration on proliferative activity of spleen cells

2.1.2 溫度對(duì)酶解效果的影響 由圖2可知，隨著溫度的升高，酶解液的脾細(xì)胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢(shì)。胰蛋白酶最適溫度范圍為50～60℃，木瓜蛋白酶的最適溫度范圍為55～65℃，Alcalase堿性蛋白酶最適溫度為45～55℃。

2.1.3 pH值對(duì)酶解效果的影響 由圖3可知，隨著pH值的升高，酶解液的脾細(xì)胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢(shì)。胰蛋白酶最適pH值范圍為7.5～8，木瓜蛋白酶的最適pH至范圍為5.5～65，Alcalase堿性蛋白酶最適pH值范圍為8.5～9.5。

圖2 溫度對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響Fig.2 Effect of temperature on proliferative activity of spleen cells

圖3 pH值對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響Fig.3 Effect of pH on proliferative activity of spleen cells

2.1.4 酶與底物蛋白濃度比對(duì)酶解效果的影響由圖4可知，隨著酶底比的升高酶解液的脾細(xì)胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢(shì)。胰蛋白酶最適酶底比范圍為6 000～7 000 U/g，木瓜蛋白酶的最適酶底比范圍為5 000～7 000 U/g，Alcalase堿性蛋白酶最適酶底比范圍為4 000～8 000 U/g。

2.1.5 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響 由圖5可知，隨著水解時(shí)間的增加酶解液的脾細(xì)胞增殖活性呈先升高后下降的趨勢(shì)。胰蛋白酶最適水解時(shí)間比范圍為4～5 h，木瓜蛋白酶的最適水解時(shí)間范圍為3～5 h，Alcalase堿性蛋白酶最適水解時(shí)間范圍為3～5 h。

圖4 酶底比對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響Fig.4 Effect of E/S on proliferative activity of spleen cells

圖5 水解時(shí)間比對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響Fig.5 Effect of time on proliferative activity of spleen cells

2.2 Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，三種蛋白酶酶解兔骨產(chǎn)物對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖作用的強(qiáng)弱為：木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶＞Alcalase堿性蛋白酶，因此選用木瓜蛋白酶作為酶解兔骨正交實(shí)驗(yàn)的使用酶。

由表1和表2分析知，在Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨正交實(shí)驗(yàn)中，酶與底物比、溫度、pH、時(shí)間四個(gè)因素對(duì)脾細(xì)胞增殖率的影響順序?yàn)椋好概c底物比＞pH＞時(shí)間＞溫度，其中pH、酶與底物比的影響顯著（P＜0.05），最優(yōu)組合為：時(shí)間 4 h、pH 9.5、酶與底物比6 000 U/g、溫度45℃。通過對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的極差和方差分析，選擇脾細(xì)胞增殖能力的最優(yōu)組合為最佳組合，即利用Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨的最佳反應(yīng)條件為：時(shí)間4 h、pH 9.5、酶與底物比6 000 U/g、溫度45℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得在最佳條件下酶解液的水解度為16.82%，脾細(xì)胞增殖率為83.41%。

表1 Alcalase堿性蛋白酶酶解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 1 Results and analysis of alcalase orthogonal test

表2 Alcalase蛋白酶方差分析表Table 2 Analysis of variance from alcalase orthogonal test

2.3 木瓜蛋白酶酶解兔骨實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，而三種蛋白酶酶解豬骨產(chǎn)物對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖作用的強(qiáng)弱為：Alcalase堿性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胰蛋白酶。因此Alcalase堿性蛋白酶作為酶解豬骨正交實(shí)驗(yàn)的使用酶。

由表3和表4分析知，在木瓜蛋白酶酶解兔骨正交實(shí)驗(yàn)中，酶與底物比、溫度、pH、時(shí)間四個(gè)因素的對(duì)對(duì)脾細(xì)胞增殖率的影響順序?yàn)椋簳r(shí)間＞溫度＞酶與底物比＞pH，其中時(shí)間和溫度的影響顯著 （P＜0.05），最優(yōu)組合為：時(shí)間 4 h、pH 5.5、酶與底物比7 000 U/g、溫度65℃。通過對(duì)兩個(gè)指標(biāo)的極差和方差分析，選擇脾細(xì)胞增殖能力的最優(yōu)組合為最佳組合，即利用木瓜蛋白酶酶解兔骨的最佳反應(yīng)條件為時(shí)間4 h、pH 5.5、酶與底物比 7 000 U/g、溫度 65 ℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)測(cè)得在最佳條件下酶解液的水解度為16.25%，脾細(xì)胞增殖率為80.70%。

表3 木瓜蛋白酶酶解正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析Table 3 Results and analysis of Papain orthogonal test

表4 木瓜蛋白酶方差分析表Table 4 Analysis of variance from papain orthogonal test

2.4 水解度對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率的影響

圖6為木瓜酶解兔骨產(chǎn)物和Alcalase堿性蛋白酶酶解豬骨產(chǎn)物的水解度對(duì)脾細(xì)胞增殖活性的影響。在Alcalase堿性蛋白酶酶解條件下，隨著DH的增加，脾細(xì)胞增殖率呈先增加后減小的趨勢(shì)。水解度在15%～18%時(shí)，酶解液對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率最高。而在木瓜蛋白酶酶酶解條件下，隨著DH的增加，脾細(xì)胞增殖率也呈增加的趨勢(shì)，但水解度均沒有超過17%。

圖6 水解度對(duì)脾細(xì)胞增殖活性的影響Fig.6 Effects of degree of hydrolysis on proliferative activity of spleen cells

3 結(jié)語(yǔ)

蛋白質(zhì)中包含有許多生物活性序列，其中包括多種免疫活性肽，這些生物活性肽，均以無活性的形式存在于蛋白前體物中，只有用適當(dāng)?shù)牡鞍酌杆獠牡鞍字嗅尫懦鰜砗螅拍艹蔀榫哂猩砘钚缘碾亩蝃14]。用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和Alcalase堿性蛋白酶分別酶解豬、兔骨，得到的酶解液對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞均有增殖作用，這是因?yàn)樗馕锬苷T導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放，這些細(xì)胞因子能夠激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答[15]。蛋白酶對(duì)水解的肽鍵具有專一性，所以不同蛋白酶對(duì)不同底物的作用結(jié)果不同[16]。胰蛋白酶酶解底物的脾細(xì)胞增殖活性強(qiáng)弱為：兔骨＞豬骨；木瓜蛋白酶酶解酶解底物的脾細(xì)胞增殖活性強(qiáng)弱為：兔骨＞豬骨；Alcalase堿性蛋白酶酶解底物的脾細(xì)胞增殖活性強(qiáng)弱為：豬骨＞兔骨。經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)可知，在豬骨最佳水解條件下得到的小鼠脾細(xì)胞增殖率為83.41%，略高于在兔骨最佳水解條件下得到的小鼠脾細(xì)胞增殖率80.70%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，水解度對(duì)免疫活性影響顯著。隨著DH的增加，脾細(xì)胞增殖率呈先增加后減小的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)殡S著酶解程度的提高，酶解物中有活性的短肽被分解成氨基酸或其活性基團(tuán)被破壞，從而導(dǎo)致產(chǎn)物活性下降[7]。因此水解度在15%～18%時(shí)，酶解液對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖率最高。Hou和Kong等研究發(fā)現(xiàn)，水解度以及影響水解度的各因素如加酶量、底物質(zhì)量濃度、pH、溫度等，對(duì)酶解鱈魚骨架和大豆蛋白質(zhì)得到的多肽的體外免疫活性有顯著影響[17-18]。

研究結(jié)果表明，酶解豬骨的最佳酶為Alcalase堿性蛋白酶，其最佳條件為時(shí)間4 h、pH 9.5、酶與底物比6 000 U/g、溫度45℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，其小鼠脾細(xì)胞增殖率為83.41%；酶解兔骨的最佳酶為木瓜蛋白酶，其最佳條件為時(shí)間4 h、pH 5.5、酶與底物比7 000 U/g、溫度65℃、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%，其小鼠脾細(xì)胞增殖率為80.70%。

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