土鱉蟲酶解物鎮(zhèn)痛作用的研究*

丁志軍 張后富 羅美蘭#

（1江西省皮膚病?？漆t(yī)院藥劑科 南昌330001；2江西省中醫(yī)藥研究院 南昌330046）

土鱉蟲（Eupolyphaga sinensis Walker）為鱉蠊科昆蟲地鱉雌蟲的干燥體，主產(chǎn)于湖南、湖北和安徽等地，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴藥材，藥用歷史悠久，應(yīng)用范圍廣泛，具有破血逐瘀，續(xù)筋接骨的功效。本品在我院臨床上以土鱉蟲打粉用溫開水泡服用于治療帶狀皰疹（蛇串瘡）、水痘、單純性皰疹（熱瘡）及帶狀皰疹的后遺神經(jīng)痛等疾病，療效確切。依據(jù)土鱉蟲為昆蟲類中藥，其蛋白質(zhì)經(jīng)口服進(jìn)入胃可被胃蛋白酶酶解為多肽，以及多肽的良好水溶性，我們制備了土鱉蟲酶解提取物樣品，送軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所進(jìn)行了鎮(zhèn)痛活性的研究，為將其進(jìn)一步開發(fā)成新藥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 KM種小鼠，SPF級(jí)，雌雄兼用，體質(zhì)量（20±2）g；SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄兼用，體質(zhì)量（200±20）g，均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號(hào)為SCXK-（軍）2007-004，總后衛(wèi)生部。

1.2 藥品與試劑 土鱉蟲，雌性，購自安徽省亳州市中成藥公司。胃蛋白酶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號(hào)F20061108）；碳酸氫鈉（上海虹光化工廠有限公司）；嗎啡（青海制藥廠有限公司）；阿司匹林（南京制藥廠有限公司）；戊巴比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司）；加巴噴?。ńK恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。

1.3 儀器 萬能粉碎機(jī)（江陰市康和機(jī)械制造有限公司）；離心機(jī)（江蘇華大離心機(jī)股份有限公司）；BS224S電子天平（萬分之一）（德國(guó)SARTORIUS）。

2 方法與結(jié)果

2.1 酶解提取物樣品的制備 土鱉蟲蟲體經(jīng)過萬能粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，稱取80 g粉碎后的粉末，混懸于1.5 L純化水中，加入1.5 L模擬胃液（取3.0 g NaCl、10.5 mL濃鹽酸，加入約1.2 L純化水中攪勻后，繼續(xù)加入4.8 g胃蛋白酶，加純化水定容至1.5 L，攪勻，即得。），37℃振蕩培養(yǎng)（200 r/min）4 h，抽濾，固體NaHCO3調(diào)pH值至7.0左右，5 000 r/min離心15 min，取上清液，經(jīng)膜過濾器濃縮至約600 mL，微波干燥（50 ℃、-0.07 MPa），干膏產(chǎn)率約為25%，干膏粉代號(hào)為XCAV706-B-0。

2.2 對(duì)醋酸所致小鼠扭體模型的影響[1]取KM種小鼠80只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、嗎啡陽性對(duì)照組、阿司匹林陽性對(duì)照組、土鱉蟲酶解提取物超高、高、中、低劑量組共7組，每組10只。土鱉蟲酶解提取物超高、高、中、低劑量組分別灌胃給藥160 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg，陽性對(duì)照組分別皮下注射嗎啡2.5 mg/kg、腹腔注射阿司匹林150 mg/kg，空白對(duì)照組給口服同體積生理鹽水，給藥30 min后再給小鼠腹腔注射0.6%醋酸（0.4 mL/20 g體重），致使小鼠產(chǎn)生“扭體”反應(yīng)；注射醋酸5min后，記錄15min內(nèi)小鼠的“扭體”次數(shù)，計(jì)算各組小鼠的扭體抑制率，并與鹽水對(duì)照組進(jìn)行比較。結(jié)果見表1。扭體抑制率=（對(duì)照組平均扭體次數(shù)-用藥組平均扭體次數(shù)）/對(duì)照組平均扭體次數(shù)×100%。

表1 土鱉粉酶解提取物對(duì)醋酸所致小鼠扭體的影響 （±S）

表1 土鱉粉酶解提取物對(duì)醋酸所致小鼠扭體的影響 （±S）

注：與空白對(duì)照組比較，＊P＜0.01，土鱉蟲酶解提取物超高、高、中劑量組能顯著降低醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)（P＜0.01），并與劑量呈一定的依賴關(guān)系。

藥物 n 劑量（mg/kg） 扭體次數(shù)（次） 抑制率（%）空白對(duì)照組Morphine（嗎啡）Aspirin（阿司匹林）XCAV706-B-0（低）XCAV706-B-0（中）XCAV706-B-0（高）XCAV706-B-0（超高）10 10 10 10 10 10 10 2.5（sc）150（ip）10（op）20（op）40（op）160（op）49.3±10.9 0.0＊0.5±1.3 40.1±13.6 38.9±12.5 32.9±10.3＊22.8±10.1＊100 99 18.7 21.1 33.3 53.8

2.3 對(duì)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性神經(jīng)病理性疼痛模型的影響

2.3.1 模型的建立 取SD大鼠40只，腹腔注射戊巴比妥鈉55 mg/kg（ip）麻醉，在左后側(cè)大腿中段分離坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)即將分叉的前段，用無菌玻璃鉤將坐骨神經(jīng)與周圍組織分離，用無菌鉻腸線（4號(hào)，直徑0.15 mm）結(jié)扎4個(gè)環(huán)，每個(gè)環(huán)間距1～2 mm，局部撒青霉素鈉消毒，分別縫合肌肉組織與皮膚，置于鋪有軟木屑的籠中。假手術(shù)組只暴露坐骨神經(jīng)，不進(jìn)行結(jié)扎，其余處理同神經(jīng)結(jié)扎組。在術(shù)后14 d，測(cè)定CCI大鼠壓力痛閾值，篩選出疼痛癥狀的大鼠。測(cè)定基礎(chǔ)痛閾，淘汰基礎(chǔ)痛閾大于8 g或小于0.6 g的大鼠（正常痛閾15 g）。

2.3.2 分組及給藥 根據(jù)基礎(chǔ)痛閾將大鼠隨機(jī)均分為加巴噴丁對(duì)照組、土鱉蟲酶解提取物超高、高劑量組共3組。土鱉蟲酶解提取物超高、高劑量組分別灌胃給藥160 mg/kg、40 mg/kg（相當(dāng)于臨床用量的8倍、2倍），加巴噴丁對(duì)照組灌胃給藥60 mg/kg，測(cè)定給藥后 0.5 h、1 h、2 h、4 h，8 h 的壓力痛閾值。結(jié)果見表2。

表2 土鱉蟲酶解提取物對(duì)CCI大鼠痛覺的影響 （±S） g

表2 土鱉蟲酶解提取物對(duì)CCI大鼠痛覺的影響 （±S） g

注：與給藥前比較，＊P＜0.01，土鱉蟲酶解提取物超高、高劑量組能顯著提高大鼠壓力痛閾。

藥物(mg/kg) n 基礎(chǔ)壓力痛閾 給藥后機(jī)械壓力痛閾0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h加巴噴丁（60）XCAV706-B-0（40）XCAV706-B-0（160）888 3.83±1.47 3.99±1.52 4.00±1.66 17.10±3.56＊ 21.18±5.39＊ 17.70±6.63＊ 16.51±6.64＊ 15.13±6.61＊7.34±3.58＊ 10.87±3.28＊ 10.20±4.59＊ 9.81±2.40＊ 11.34±5.38＊11.19±5.98＊ 15.62±6.41＊ 16.0±4.56＊ 11.67±7.01＊ 12.14±6.54＊

2.3.3 壓力痛閾測(cè)定 將大鼠置于金屬籠中，用不同克重的纖維絲（Von Frey Hair）刺激其足底足心部位，持續(xù)刺激5 s，每次刺激間隔5 s，找到10次刺激中引起4次到6次大鼠抬足反應(yīng)的纖維絲，記錄其克重，此克重即為壓力痛閾值（單位：g）。在某一克重的毛刷無反應(yīng)，而另一克重的毛刷達(dá)到最大抬足次數(shù)，則取兩者的平均值。

3 討論

雖然目前有許多止痛藥物可用于鎮(zhèn)痛，如阿片類藥物，非甾體類抗炎藥[2]，但這些藥物并不能治愈疼痛，且易產(chǎn)生耐受性。所以鎮(zhèn)痛藥物的研發(fā)一直是熱點(diǎn)，開發(fā)出鎮(zhèn)痛效果好、無成癮性的新型鎮(zhèn)痛藥變得日益重要。本研究采用腹腔注射醋酸建立動(dòng)物扭體模型，采用無菌鉻腸線結(jié)扎制備坐骨神經(jīng)慢性壓迫性神經(jīng)病理性疼痛模型，對(duì)土鱉蟲酶解提取物進(jìn)行了鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究，其結(jié)果顯示，土鱉蟲酶解提取物對(duì)兩種疼痛模型均有顯著鎮(zhèn)痛作用，且呈明顯量效關(guān)系。此研究為土鱉蟲酶解提取物臨床治療疼痛提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但關(guān)于其藥理作用機(jī)制可能是多方面的，尚有待于進(jìn)一步探討。

[1]范文昌，梅全喜，高玉橋.12種廣東地產(chǎn)清熱解毒藥的鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)研究[J].今日藥學(xué)，2010，20(2):12-15

[2]Holtman JR，Dwoskin LP，Dowell C，et al.The novel small molecule α9α10 nicotinic acetylcholine receptor antagonist ZZ-204G is analgesic[J].Eur J Pharmacol，2011，670(2-3):500-508