癌蛋白PRC17與人肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈相互作用的初步鑒定

何澤，陳洋，張永臣，萬青，趙虎子，趙蕾，沈傳陸

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇南京 210009;2.東南大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇南京 210009)

PRC17即前列腺癌基因17，也稱TBC1D3，是人類特有的基因，該基因在15%的前列腺癌中高擴(kuò)增，并且在50%轉(zhuǎn)移性前列腺癌中過表達(dá)。因?yàn)镻RC17促進(jìn)細(xì)胞增殖并且能使NIH3T3細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而被鑒定為癌基因［1］。最近的研究發(fā)現(xiàn)，PRC17能夠延遲表皮生長因子受體(EGFR)和胰島素受體底物-1(IRS-1)的降解，增強(qiáng)和延長信號(hào)活性來促進(jìn)細(xì)胞增殖。PRC17能抑制EGFR對(duì)C-卡西塔斯B細(xì)胞淋巴瘤蛋白(c-Cbl)的募集，減少EGFR的多泛素化，從而延遲EGFR降解［2］。PRC17對(duì)胰島素信號(hào)的調(diào)節(jié)通過激活蛋白磷酸酶2(PP2A)途徑完成。激活的PP2A通過抑制核糖體蛋白S6激酶活性，而下調(diào)IRS-1上能夠被Cul7泛素連接酶識(shí)別的磷酸化位點(diǎn)，最終延遲IRS-1的降解［3］。另外，PRC17能與 ADP核糖基化因子6(Arf6)一起同時(shí)結(jié)合高爾基關(guān)聯(lián)的含γ銜接蛋白耳的ARF結(jié)合蛋白3(GGA3)，一起協(xié)作促進(jìn)細(xì)胞的巨胞飲內(nèi)吞［4］。

為了進(jìn)一步研究PRC17的功能，我們嘗試尋找新的與PRC17結(jié)合的蛋白。前期的實(shí)驗(yàn)工作證明MLC2能夠與轉(zhuǎn)染重組轉(zhuǎn)化因子(Tre17)結(jié)合［5］，而Tre17與PRC17具有相似的TBC結(jié)構(gòu)域，并且PRC17與Tre17氨基端的序列達(dá)到了89%的一致性［6］，推測PRC17與MLC2很可能相互作用。鑒定PRC17與MLC2之間的相互作用將為進(jìn)一步研究PRC17及MLC2的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 SMMC-7721細(xì)胞為作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 菌種E.coli DH 5a和BL21、原核表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-6P-1、真核表達(dá)載體pcDNA-3.0-HA為作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。重組載體pcDNAHA-PRC17、pcDNA-HA-PRC17(353)和 pcDNA-HAPRC17(251)由作者所在實(shí)驗(yàn)室以前成功構(gòu)建并保存，分別用于SMMC7721細(xì)胞表達(dá)PRC17、PRC17氨基末端的353和251個(gè)氨基酸片段。pcDNA-HA-PRC17(164)和pcDNA-HA-PRC17(Δ164)為本次構(gòu)建，分別用于細(xì)胞表達(dá)PRC17氨基端的164個(gè)氨基酸或氨基端164個(gè)氨基酸缺失的PRC17突變體。

1.1.3 試劑與抗體 限制性內(nèi)切酶(Bam HⅠ、Eco RⅠ等)、T4DNA連接酶、PrimeSTARTMHS DNA聚合酶購自大連TaKaRa生物有限公司，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自金斯瑞生物科技有限公司，蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自Fermentas公司，凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒購自Axygen公司，抗生素、異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自南京鼎國生物工程公司，Glutathione Sepharose 4B購自GE Healthcare公司，抗-GST抗體購自Cell Signal公司，抗-HA抗體和HRP(辣根過氧化物酶)標(biāo)記的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG購自Santa Cruz公司，化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購自Thermo SIENTIFIC公司，轉(zhuǎn)染試劑 LipoD293TMReagent購自 SignaGen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721細(xì)胞用含10%小牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、100 U·L-1青霉素和100μg·L-1鏈霉素的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，于體積分?jǐn)?shù)5%的CO2中37℃培養(yǎng)。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)PRC17基因全長cDNA序列(GeneID:729873)，以pcDNA-HA-PRC17為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增 PRC17(164)和 PRC17(Δ164)的引物:PRC17(164)上游引物ATGTTCCAGATTACGCTTCTA，PRC17(164)下游引物 CTGAATTCCGTATCGATCCCTG，PRC17(Δ164)上游引物TAGGATCCACCACCATGACC AAGCAGCGGGAAC，PRC17(Δ164)下游引物 CTGGCA ACTAGAAGGCACAGTCGAGGCTGATCA。擴(kuò)增條件:預(yù)變性94℃ 2 min;變性98℃ 10 s，退火55℃ 10 s，延伸72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);總延伸72℃ 7 min。

1.2.3 PRC17突變體表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物PRC17(164)和PRC17(Δ164)經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，然后通過凝膠回收試劑盒回收，PRC17(164)、PRC17(Δ164)和載體pcDNA-HA分別經(jīng)過相應(yīng)的雙酶切后用凝膠回收試劑盒回收，然后載體與目的DNA片段按照1∶3的比例混合，用T4DNA連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH 5a感受態(tài)細(xì)胞后，置于搖床，37℃、250 r·min-1振蕩培養(yǎng)1 h，涂布于含100μg·min-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒DNA，酶切鑒定正確后對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序鑒定。

1.2.4 GST融合蛋白的原核表達(dá)和純化 GSTMLC2融合蛋白的原核表達(dá)和純化主要見參考文獻(xiàn)［7-9］。即挑取表達(dá)GST-MLC2的單菌落于氨芐青霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基37℃ 振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按照1∶100比例轉(zhuǎn)接種于10 ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)基OD600nm為0.6～0.8之間，用 0.1 mmol·L-1的 IPTG，在 30 ℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)6 h。經(jīng)過裂解液及超聲處理，離心后通過 Glutathione Sepharose 4B吸附上清液中的GST融合蛋白，裂解液清洗3遍并離心棄上清獲得純化蛋白。SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色，拍照后通過灰度分析確定目的蛋白的純度。

1.2.5 GST沉淀實(shí)驗(yàn)分析 在每35 mm皿中接種3×105SMMC-7721細(xì)胞培養(yǎng)20 h，pcDNA-HA-PRC17、pcDNA-HA-PRC17(353)、pcDNA-HA-PRC17(251)、pcDNA-HA-PRC17(164)和 pcDNA-HA-PRC17(Δ164)被分別轉(zhuǎn)染到SMMC-7721細(xì)胞，24 h后將細(xì)胞于冰上，PBS洗2遍后每皿加150μl裂解液(20 mmol·L-1Tris-Cl，pH 7.5，0.5%Triton X-100，150 mmol·L-1氯化鈉，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸，10 mmol·L-1氟化鈉，1 mmol·L-1正釩酸鈉，1 mmol·L-1PMSF，5μg·ml-1抑肽素，5 μg·ml-1亮抑酶肽，2 μg·ml-1抑蛋白酶肽)裂解10 min。4℃、12 000 r·min-1離心20 min得上清液，留取上清液的1/10作為全細(xì)胞裂解物(WCL)，剩下的裂解物上清分別與5μg純化的GST-MLC2樹脂混合，4℃旋轉(zhuǎn)混勻4 h，GST則作為陰性對(duì)照。然后裂解液洗3遍后，離心棄上清，沉淀用1倍的樣品緩沖液重懸后于沸水中煮5 min，樣品通過蛋白質(zhì)印跡法檢測分析。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測 蛋白樣品通過SDSPAGE電泳分離后，用250 mA恒流轉(zhuǎn)PVDF膜1 h，然后PVDF膜用含2%BSA的TBST室溫封閉1 h，加一抗抗體4℃過夜標(biāo)記，TBST洗膜3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫標(biāo)記1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，ECL顯色觀察分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 PRC17截短突變體的構(gòu)建和鑒定

構(gòu)建的pcDNA-HA-PRC17(164)質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切后，出現(xiàn)502 bp大小的特征性片段;pcDNA-HA-PRC17(Δ164)質(zhì)粒經(jīng)Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切后出現(xiàn)1 173 bp大小的特征性片段(圖1)。DNA序列測定證實(shí)上述PRC17截短突變體序列無誤。

圖1 PRC17截短突變體重組表達(dá)載體的酶切鑒定Fig 1 Identification of recombinant plasmid expressing truncated PRC17 mutant by restriction enzyme digestion M.DNA ladder;Lane 1.pcDNA-HA-PRC17 digested with Bam HⅠand Eco RⅠ;Lane 2.pcDNA-HA-PRC17(164)digested with Bam HⅠ and Eco RⅠ;Lane 3.pcDNA-HA-PRC17(Δ164)digested with Bam HⅠ and XhoⅠ

2.2 GST-MLC2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

轉(zhuǎn)化pGEX-MLC2或空載體pGEX-6p-1的BL21細(xì)菌經(jīng)0.1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)6 h后細(xì)菌裂解，裂解物上清經(jīng)Glutathione Sepharose 4B親和層析純化。SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，純化的GST和GST-MLC2蛋白分子質(zhì)量分別約為28.4 kD和46.6 kD，符合預(yù)期;兩種蛋白的純度均在95%以上(圖2)，GST和GST-MLC2蛋白均得到了很好的表達(dá)與純化。

2.3 PRC17與MLC2相互作用的分析

為了分析PRC17與MLC2之間的相互作用，我們將PRC17及其一系列氨基酸片段缺失突變體分別轉(zhuǎn)染SMMC-7721細(xì)胞，以GST蛋白為對(duì)照，與純化的GST-MLC2進(jìn)行GST沉淀分析。結(jié)果顯示，PRC17及其突變體都能在SMMC-7721中表達(dá)(圖3、圖4B)。并且PRC17明顯結(jié)合MLC2而不結(jié)合陰性對(duì)照GST(圖4C)，說明PRC17能特異性結(jié)合MLC2。與全長PRC17相似，突變體PRC17(353)和PRC17(251)均能有效結(jié)合MLC2，相反，PRC17(164)和PRC17(Δ164)都不能與MLC2結(jié)合(圖4)。這些結(jié)果提示PRC17蛋白序列上與MLC2結(jié)合的部位位于其氨基端251位氨基酸之內(nèi)，可能在164位氨基酸附近。

圖2 GST和GST-MLC2純化蛋白的SDS-PAGE分析Fig 2 SDS-PAGE analysis of purified GST-MLC2andGST protein M.protein marker;Lane 1.purified GST-MLC2;Lane 2.purified GST

圖3 PRC17及其截短突變體示意圖Fig 3 Schematic illustration of full-length wild type PRC17 truncated mutant

圖4 PRC17與MLC2相互作用及PRC17蛋白序列上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定Fig 4 Identification of the interaction between PRC17 and MLC2 and the MLC2-binding site on PRC17 A.Western blot analysis of purified GST and GST-MLC2;B.Whole cell lysate of SMMC-7721 cells expressing PRC17 mutants respectively were tested by Western blot;C.GST-pull down was performed to test the interaction between MLC2 and PRC17 or its truncated mutants

3 討 論

人類的DNA中有一些基因是其它物種所沒有的，這些獨(dú)有的基因是區(qū)別人類與其它物種的基礎(chǔ)，但是人們對(duì)他們還了解甚少。PRC17作為一個(gè)人類特有的癌基因，相關(guān)的研究雖然已經(jīng)有所進(jìn)展，但它的功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制都不清楚。我們通過PRC17與TRE17的同源性預(yù)測與TRE17結(jié)合的MLC2可能也與PRC17相互作用，并通過實(shí)驗(yàn)證明PRC17與MLC2之間結(jié)合，為下一步研究它們相互作用的功能打下了基礎(chǔ)。

首先，PRC17參與了對(duì)細(xì)胞巨胞飲的調(diào)節(jié)。巨胞飲是在某些因素刺激下，細(xì)胞膜皺褶形成直徑為0.5～2μm大的內(nèi)吞泡的過程，是非選擇性內(nèi)吞細(xì)胞外液相大分子和營養(yǎng)物質(zhì)的有效途徑。最新的研究顯示，巨胞飲途徑可能是腫瘤細(xì)胞獲得氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)腫瘤生長的重要途徑，通過藥物抑制巨胞飲途徑可以切斷腫瘤的營養(yǎng)供給，阻礙腫瘤的生長［10］。巨胞飲整個(gè)過程需要肌動(dòng)蛋白的參與［11］。肌球蛋白Ⅱ由一對(duì)重鏈和兩對(duì)輕鏈組成，輕鏈在肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)的作用下發(fā)生磷酸化，使重鏈的構(gòu)象變化暴露出與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)等生理功能。研究表明，MLCK抑制劑ML-7能顯著抑制細(xì)胞膜皺褶的運(yùn)動(dòng)及巨胞飲體的產(chǎn)生［12］，這也意味著肌球蛋白輕鏈參與了細(xì)胞巨胞飲的過程。PRC17與MLC2之間的相互作用在細(xì)胞巨胞飲過程中的功能和機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。

另外，作為肌球蛋白的重要組成部分，肌球蛋白輕鏈參與了許多重要的生理功能，包括細(xì)胞的遷移、細(xì)胞質(zhì)分裂及細(xì)胞形態(tài)的改變［13-17］。研究顯示，MLC2也參與了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化可以阻擾癌細(xì)胞的侵襲［18-20］。一些蛋白通過與MLCK或MLC的相互作用影響肌球蛋白輕鏈磷酸化，從而參與對(duì)癌細(xì)胞侵襲的調(diào)節(jié)。人ARD1(hARD1)與MLCK相互作用后能使激活的MLCK被乙?；Щ?，導(dǎo)致MLC磷酸化的減弱，并抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲［21］。肌纖維生成調(diào)節(jié)因子-1(MR-1)則與MLC2相互作用，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移［19］。PRC17與MLC2之間的相互作用是否調(diào)節(jié)著MLC2的磷酸化并繼而影響細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移有待進(jìn)一步研究。

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