王琪煒,陳寶俊,強(qiáng)倩,李淑鋒
(1.東南大學(xué)生命科學(xué)研究院,江蘇南京 210018;2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院心胸外科,江蘇南京 210008;3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,江蘇南京 210009)
許多重要的生命活動(dòng)是由含有鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger motif)的轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的[1-2],sp1(specific protein 1)就是這種類型的一種重要轉(zhuǎn)錄因子[3]。sp1蛋白的C端區(qū)域含有3個(gè)連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)域,這一區(qū)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合GC-rich的啟動(dòng)子區(qū)域,從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。它識(shí)別的DNA核心結(jié)合序列為 GGCGGGG[4]。
sp1最初是作為Hela細(xì)胞抽提物中具有體外轉(zhuǎn)錄活性的組分而被發(fā)現(xiàn)的[5],后來的研究證明sp1在組織中的分布很廣泛而且能夠調(diào)控許多的靶基因[6-7]。通常情況下,受其調(diào)控的靶基因多為細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長等相關(guān)的基因[8-10]。更為重要的是,sp1在一些腫瘤中的表達(dá)水平明顯異常[11-13]。
為了研究sp1在基因表達(dá)中的調(diào)控作用,我們在原核系統(tǒng)中表達(dá)sp1蛋白并進(jìn)行純化。
pET-28b質(zhì)粒,大腸桿菌Top10、BL21(DE3)菌株由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存;含人sp1 cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-sp1購自Addgene;DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司;PCR試劑及Agarose Gel快速純化試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司;IPTG、尿素、蔗糖等化學(xué)試劑購自上海生工生物工程股份有限公司;Ni-IDA親和層析填料購自Pharmarcia公司。
1.2.1 重組質(zhì)粒的亞克隆 將人源sp1真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-SP1用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ-XhoⅠ進(jìn)行雙酶切,瓊脂糖凝膠電泳后,回收約2 200 bp的片段,即為sp1-699c(88-786 aa)的cDNA。再用T4DNA連接酶將回收后的雙酶切片段連接到用Eco RⅠ-XhoⅠ雙酶切并回收后的pET-28b質(zhì)粒,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)菌株,卡那霉素抗性LB平板篩選陽性克隆,挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定后送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。用經(jīng)測序后完全正確的菌落提取重組質(zhì)粒。
1.2.2 融合蛋白在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)與菌體收集 用經(jīng)測序后確認(rèn)正確的重組質(zhì)粒pET28b-sp1-699c轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)菌株,卡那霉素抗性LB平板篩選陽性克隆,挑取單克隆于含有卡那霉素的3 ml LB培養(yǎng)基,37℃振蕩過夜,吸取1 ml過夜培養(yǎng)菌液于100 ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37℃繼續(xù)搖菌,培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.8時(shí),加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG,18℃誘導(dǎo)12 h,離心收集菌體,與0 h時(shí)的菌體同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE分析。將表達(dá)菌體重懸于5 ml預(yù)冷的裂解緩沖液(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl,30 mmol·L-1NaCl,0.05 mmol·L-1ZnCl2),冰上超聲破碎,4℃ 12 000 r·min-1離心30 min,將離心后的上清和沉淀取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。
1.2.3 包涵體中目的蛋白的變復(fù)性 將超聲離心后的沉淀重懸于5 ml預(yù)冷的1 mol的蔗糖溶液,反復(fù)吹打,充分混勻,4℃ 12 000 r·min-1離心30 min,棄上清,再將沉淀重懸于10 ml預(yù)冷的Triton-EDTA洗滌液(2%Triton X-100,10 mmol·L-1EDTA),反復(fù)吹打,充分混勻,4℃放置12 h后,4℃ 12 000 r·min-1離心30 min,棄上清,用5 ml 8 mol的尿素溶液重懸沉淀,用1 L 透析液 A(4 mol·L-1尿素,30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl,30 mmol·L-1NaCl,0.05 mmol·L-1ZnCl2,1 mmol·L-1DTT)攪拌透析12 h,再用1 L透析液B(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl,30 mmol·L-1NaCl,0.05 mmol·L-1ZnCl2,1 mmol·L-1DTT)攪拌透析12 h。收集袋內(nèi)液,4℃ 12 000 r·min-1離心30 min,取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。
1.2.4 可溶性目的蛋白的純化 裝填Ni-IDA層析柱,當(dāng)柱床約2 cm高時(shí),用3 ml緩沖液D(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl,30 mmol·L-1NaCl,0.05 mmol·L-1ZnCl2,500 mmol·L-1咪唑)洗去 Ni-IDA 上的雜蛋白,再用15 ml的緩沖液A(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl,30 mmol· L-1NaCl,0.05 mmol· L-1ZnCl2,10 mmol·L-1咪唑)平衡柱床,之后將透析后的袋內(nèi)液上清上樣,用4 ml的緩沖液B(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl,30 mmol·L-1NaCl,0.05 mmol· L-1ZnCl2,50 mmol·L-1咪唑)洗去雜蛋白,最后用緩沖液C(30 mmol· L-1pH 7.5 Tris-HCl,30 mmol· L-1NaCl,0.05 mmol·L-1ZnCl2,250 mmol·L-1咪唑)洗脫含His-tag的目的蛋白,收集洗脫峰。取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。
sp1的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-sp1圖譜如圖1所示,pCMV-sp1可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)1-87aa deleted的sp1蛋白,即C端699aa的sp1變體蛋白。我們將這一段編碼序列用Eco RⅠ和XhoⅠ切開連入pET-28b載體。
圖1 sp1真核表達(dá)質(zhì)粒p CMV-sp1圖譜Fig 1 Schematic diagram of the sp1's eukaryotic expression plasmid
重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果如圖2所示,其中長度約5.3 kb的片段為pET28b載體,長度約2.2 kb的片段為人源sp1-699c的cDNA片段。
圖2 重組質(zhì)粒p ET28b-sp1-699c酶切鑒定電泳結(jié)果Fig 2 Electrophoresis result of double-enzyme-cutting identification about recombination plasmid M.DNA marker;1.Recombination plasmid;2.Double-enzyme-cutting fragments
經(jīng)SDS-PAGE分析,如圖3所示,融合蛋白的分子質(zhì)量約為91 kD,與理論值相符,且在菌體中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá),但是主要仍為不可溶的包涵體形式,欲獲得較高濃度的目的蛋白,還需將包涵體經(jīng)高濃度尿素變性,使之溶解,再通過透析去除尿素,使目的蛋白復(fù)性,最后利用融合蛋白N端的His-Tag與鎳柱親和層析,一步純化獲得目的蛋白。
圖3 大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白SDS-PAGEFig 3 SDS-PAGE of fusion protein expressed by E.coli M.Protein marker;1.Total protein before IPTG induction;2.Total protein after IPTG induction;3.Supernatant after ultrasonication;4.Precipitation after ultrasonication
融合蛋白親和層析后的SDS-PAGE如圖4所示,經(jīng)透析去除尿素后,絕大多數(shù)目的蛋白變?yōu)榭扇苄问?,透析后袋?nèi)液的上清用Ni-IDA親和層析純化過程簡單、高效,獲得了高濃度的融合蛋白(圖4泳道5),且純化后的樣品純度也可達(dá)到85%左右,達(dá)到了進(jìn)行DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的純度標(biāo)準(zhǔn)。
sp1是一種在體內(nèi)各種組織中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,其C端區(qū)域含有3個(gè)連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA的識(shí)別與結(jié)合結(jié)構(gòu)域,這些鋅指結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域GC-rich的位點(diǎn),從而對基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn),sp1參與調(diào)控多種重要的組成型基因[7,14],在維持機(jī)體正常發(fā)育及生命活動(dòng)的過程中起重要作用,同時(shí)其作為體內(nèi)廣泛表達(dá)并發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子,機(jī)體對sp1的表達(dá)水平也有嚴(yán)格的調(diào)控[15-17]。通常情況下,受sp1調(diào)控的下游基因多為細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長以及促進(jìn)腫瘤的侵襲與遷移等相關(guān)的基因。sp1作為轉(zhuǎn)錄因子,自身表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)能夠激活或者抑制這些基因的表達(dá),從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移以及血管生成等過程,在腫瘤的發(fā)生過程中扮演了非常重要的角色。而且,它在許多惡性腫瘤中表達(dá)明顯升高,與腫瘤的惡化及轉(zhuǎn)移程度相關(guān)[18]。因此,了解sp1的調(diào)控機(jī)制,不但有助于了解腫瘤的發(fā)生機(jī)制,還可為治療提供潛在的靶點(diǎn)。
在本研究中,我們使用了大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng),經(jīng)過一系列條件的探索,尋找到一種能夠快速、高效地表達(dá)并且純化出人轉(zhuǎn)錄因子sp1蛋白的方法,為
圖4 融合蛋白親和層析后SDS-PAGEFig 4 SDS-PAGE after affinity chromatography of fusion protein M.Protein marker;1.Sample of the affinity chromatography;2.Liquid that flows though;3.Eluate of other protein;4-7.Eluate of target protein(the elution peak is lane 5)
其下游靶基因的調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。
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