流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)風(fēng)濕性心臟病合并心房顫動(dòng)患者HCN2蛋白的表達(dá)

趙春鶴+周華富+張博+孫宇+劉文洲

【摘要】 目的 對(duì)風(fēng)濕性心臟病合并心房顫動(dòng)患者右心耳組織超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子通道-2（HCN2）蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析和研究。方法 風(fēng)濕性心臟病患者84例分為研究組（心房顫動(dòng)）和對(duì)照組（竇性心律）， 每組42例， 對(duì)兩組臨床資料進(jìn)行回顧性分析。結(jié)果 研究組患者的左心房?jī)?nèi)徑（LAD）、右心房?jī)?nèi)徑（RAD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）明顯高于對(duì)照組， 右心室內(nèi)徑（RVD）明顯小于對(duì)照組， 兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；且研究組HCN2蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組。結(jié)論 風(fēng)濕性心臟病合并心房顫動(dòng)患者HCN2蛋白的表達(dá)與患者的心房顫動(dòng)具有相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 心房顫動(dòng)；右心耳組織超級(jí)化激活環(huán)核苷酸門(mén)控陽(yáng)離子蛋白通道-2；表達(dá)

心房顫動(dòng)（房顫）是最常見(jiàn)的持續(xù)性心律失常。隨著年齡增長(zhǎng)房顫的發(fā)生率不斷增加， 75歲以上人群可達(dá)10%。房顫時(shí)心房激動(dòng)的頻率達(dá)300～600次/min， 心跳頻率往往快而且不規(guī)則， 有時(shí)候可達(dá)100～160次/min， 不僅比正常人心跳快得多， 而且絕對(duì)不整齊， 心房失去有效的收縮功能[1]。房顫患病率的增長(zhǎng)還與冠心病、高血壓病和心力衰竭等疾病的增長(zhǎng)密切相關(guān)。本文主要就風(fēng)濕性心臟病合并心房顫動(dòng)患者HCN2蛋白的表達(dá)進(jìn)行分析和研究， 以期能夠進(jìn)一步提高患者的生命質(zhì)量， 現(xiàn)作報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 隨機(jī)選取2013年2月～2014年2月本院收治的風(fēng)濕性心臟病患者84例， 分為研究組（心房顫動(dòng)）和對(duì)照組（竇性心律）， 每組42例。對(duì)照組年齡16～76歲， 平均年齡（40±6.75）歲；研究組年齡18～78歲， 平均年齡（40±6.78）歲；兩組患者性別、年齡等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法

1. 2. 1 培養(yǎng)心房肌鑒定

1. 2. 1. 1 免疫熒光法 ①滴加0.01 mol/L， pH 7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上， 10 min后棄去， 使標(biāo)本保持一定濕度。②滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液， 置于有蓋搪瓷盒內(nèi)， 保溫30 min。③取出玻片， 置玻片架上， 先用0.01 mol/L， pH 7.4的PBS沖洗后， 再按順序過(guò)0.01 mol/L， pH 7.4的PBS三缸浸泡， 每缸3～5 min， 不時(shí)振蕩。④取出玻片， 用濾紙吸去多余水分。⑤立即用熒光顯微鏡觀察。即可判定為陽(yáng)性。

1. 2. 1. 2 免疫組化 ①石蠟切片脫蠟至水。②3% 室溫孵育5～10 min。③蒸餾水沖洗， PBS浸泡5 min×2次。④5%～10%正常山羊血清封閉， 室溫孵育10 min， 傾去血清， 勿洗。滴加一抗工作液， 37℃孵育1～2 h或4℃過(guò)夜。⑤PBS沖洗， 5 min×3次。⑥滴加適量生物素標(biāo)記二抗工作液， 37℃ 孵育10～30 min。⑦PBS沖洗， 5 min×3次。⑧滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液， 37℃孵育10～30 min。⑨顯色劑顯色3～15 min。⑩自來(lái)水充分沖洗， 復(fù)染、脫水、透明、封片。

1. 2. 2 培養(yǎng) 取風(fēng)濕性心臟病患者手術(shù)常規(guī)切除右心耳組織約300 mg， 10例無(wú)房顫史， 10例有房顫史， 10 min送至培養(yǎng)室， 在無(wú)菌操作臺(tái)下將右心耳組織剪碎約1.3 mm大小， 迅速將剪碎組織貼壁細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁， 加入含10%的胎牛血清， 倒置約1 h后待組織貼壁緊密后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織碎塊浸沒(méi)在培養(yǎng)液中， 培養(yǎng)3～6 d可見(jiàn)組織塊周邊細(xì)胞生長(zhǎng)， 10 d左右待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶底約80%可傳代。取第三代傳代細(xì)胞， 做細(xì)胞爬片， 用人抗兔&-肌動(dòng)蛋白抗體， 兔抗鼠fitc標(biāo)記的二抗用免疫熒光法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為人心房肌細(xì)胞， 免疫組化法鑒定人心房肌細(xì)胞：人抗兔&-肌動(dòng)蛋白抗體。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第三代細(xì)胞， 將貼壁細(xì)胞消化下來(lái)做流式樣品管， 檢測(cè)風(fēng)濕性心臟病房顫史患者HCN2基因蛋白表達(dá)高于風(fēng)濕性心臟病無(wú)房顫患者[2]。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩組臨床相關(guān)因素對(duì)照 研究組患者的左心房?jī)?nèi)徑（LAD）、右心房?jī)?nèi)徑（RAD）、左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）明顯高于對(duì)照組， 右心室內(nèi)徑（RVD）明顯小于對(duì)照組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。兩組患者的左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 左心房?jī)?nèi)徑與心房顫動(dòng)的發(fā)生成正比， 左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室射血分?jǐn)?shù)與心房顫動(dòng)成負(fù)相關(guān)， 見(jiàn)表1。

2. 2 兩組患者臨床資料比較 兩組臨床資料比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）， 研究組患者的HCN2蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組， 見(jiàn)表2。

3 討論

風(fēng)濕性心臟病簡(jiǎn)稱(chēng)風(fēng)心病， 是指由于風(fēng)濕熱活動(dòng)， 累及心臟瓣膜而造成的心臟瓣膜病變。表現(xiàn)為二尖瓣、三尖瓣、主動(dòng)脈瓣中有一個(gè)或幾個(gè)瓣膜狹窄和（或）關(guān)閉不全。臨床上狹窄或關(guān)閉不全常同時(shí)存在， 但常以一種為主?；疾〕跗诔３o(wú)明顯癥狀， 后期則表現(xiàn)為心慌氣短、乏力、咳嗽、下肢水腫、咳粉紅色泡沫痰等心功能失代償?shù)谋憩F(xiàn)。本病多發(fā)于冬春季節(jié)， 寒冷、潮濕和擁擠環(huán)境下， 初發(fā)年齡多在5～15歲， 復(fù)發(fā)多在初發(fā)后3～5年內(nèi)。由于心臟瓣膜的病變， 使得心臟在運(yùn)送血液的過(guò)程中出現(xiàn)問(wèn)題， 如瓣膜狹窄， 使得血流阻力加大， 為了射出足夠的血液， 心臟則更加費(fèi)力地舒張和收縮， 這樣使心臟工作強(qiáng)度加大， 效率降低， 心臟易疲勞， 久而久之造成心臟肥大。如二尖瓣狹窄到一定程度時(shí)由于左心房壓力的增高， 導(dǎo)致肺靜脈和肺毛細(xì)血管壓力增高， 形成肺淤血， 肺淤血后容易引起以下癥狀：①呼吸困難；②咳嗽；③咳血， 有的還會(huì)出現(xiàn)聲音沙啞和吞咽困難， 嚴(yán)重的影響著人們的健康生活以及生活質(zhì)量[3]。

流式細(xì)胞術(shù)是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段， 它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞， 并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)， 與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比， 具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)， 成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。其在液流系統(tǒng)中， 快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)， 并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類(lèi)收集的技術(shù)。其特點(diǎn)是通過(guò)快速測(cè)定庫(kù)爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞 DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)。根據(jù)這些參數(shù)將不同性質(zhì)的細(xì)胞分開(kāi)， 以獲得供生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究用的純細(xì)胞群體， 目前最高分選速度已達(dá)到每秒鐘3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞[4-6]。

研究表明， 研究組患者的左房?jī)?nèi)徑、左室舒張末期內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑均明顯增大， 然而右室內(nèi)徑減小， 左室射血分?jǐn)?shù)降低；且研究組HCN2蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組， 兩組比較， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述， 風(fēng)濕性心臟病合并心房顫動(dòng)患者HCN2蛋白的表達(dá)與患者的心房顫動(dòng)具有相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)

[1] 張復(fù)貴， 朱小琴， 李元紅， 等.風(fēng)濕性心臟病患者發(fā)生心房顫動(dòng)的臨床因素分析.中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志， 2011， 25（6）：520-521.

[2] 任宇超， 張嵐， 劉靖童.風(fēng)濕性心臟病患者發(fā)生心房顫動(dòng)的臨床因素分析.當(dāng)代醫(yī)學(xué)， 2013， 19（31）：80-82.

[3] 劉雄濤， 蘇菲菲， 尚福軍， 等.人類(lèi)心房肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定.科學(xué)技術(shù)與工程， 2014， 14（2）：6-7.

[4] 劉慧， 于風(fēng)旭， 毛亮.風(fēng)濕性心臟病心房顫動(dòng)患者 HCN2蛋白 的表達(dá).中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志， 2013， 27（1）：36-38.

[5] 劉文洲， 孫宇王， 俊龍.二尖瓣狹窄合并心房顫動(dòng)患者HCN2表達(dá)與測(cè)序.臨床心血管病雜志， 2014， 1（25）：56-57.

[6] 李勇， 馬瑞彥， 肖穎彬， 等. 風(fēng)濕性二尖瓣病變并發(fā)心房顫動(dòng)患者483例臨床分析. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 33（10）：1048-1051.

[收稿日期：2014-09-03]

流式細(xì)胞術(shù)是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段， 它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞， 并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)， 與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比， 具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)， 成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。其在液流系統(tǒng)中， 快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)， 并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類(lèi)收集的技術(shù)。其特點(diǎn)是通過(guò)快速測(cè)定庫(kù)爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞 DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)。根據(jù)這些參數(shù)將不同性質(zhì)的細(xì)胞分開(kāi)， 以獲得供生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究用的純細(xì)胞群體， 目前最高分選速度已達(dá)到每秒鐘3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞[4-6]。

研究表明， 研究組患者的左房?jī)?nèi)徑、左室舒張末期內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑均明顯增大， 然而右室內(nèi)徑減小， 左室射血分?jǐn)?shù)降低；且研究組HCN2蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組， 兩組比較， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述， 風(fēng)濕性心臟病合并心房顫動(dòng)患者HCN2蛋白的表達(dá)與患者的心房顫動(dòng)具有相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)

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[2] 任宇超， 張嵐， 劉靖童.風(fēng)濕性心臟病患者發(fā)生心房顫動(dòng)的臨床因素分析.當(dāng)代醫(yī)學(xué)， 2013， 19（31）：80-82.

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[4] 劉慧， 于風(fēng)旭， 毛亮.風(fēng)濕性心臟病心房顫動(dòng)患者 HCN2蛋白 的表達(dá).中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志， 2013， 27（1）：36-38.

[5] 劉文洲， 孫宇王， 俊龍.二尖瓣狹窄合并心房顫動(dòng)患者HCN2表達(dá)與測(cè)序.臨床心血管病雜志， 2014， 1（25）：56-57.

[6] 李勇， 馬瑞彥， 肖穎彬， 等. 風(fēng)濕性二尖瓣病變并發(fā)心房顫動(dòng)患者483例臨床分析. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 33（10）：1048-1051.

[收稿日期：2014-09-03]

流式細(xì)胞術(shù)是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測(cè)手段， 它可以高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞， 并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)， 與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比， 具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)， 成為當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)。其在液流系統(tǒng)中， 快速測(cè)定單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞器的生物學(xué)性質(zhì)， 并把特定的細(xì)胞或細(xì)胞器從群體中加以分類(lèi)收集的技術(shù)。其特點(diǎn)是通過(guò)快速測(cè)定庫(kù)爾特電阻、熒光、光散射和光吸收來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞 DNA含量、細(xì)胞體積、蛋白質(zhì)含量、酶活性、細(xì)胞膜受體和表面抗原等許多重要參數(shù)。根據(jù)這些參數(shù)將不同性質(zhì)的細(xì)胞分開(kāi)， 以獲得供生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究用的純細(xì)胞群體， 目前最高分選速度已達(dá)到每秒鐘3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞[4-6]。

研究表明， 研究組患者的左房?jī)?nèi)徑、左室舒張末期內(nèi)徑、右房?jī)?nèi)徑均明顯增大， 然而右室內(nèi)徑減小， 左室射血分?jǐn)?shù)降低；且研究組HCN2蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組， 兩組比較， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述， 風(fēng)濕性心臟病合并心房顫動(dòng)患者HCN2蛋白的表達(dá)與患者的心房顫動(dòng)具有相關(guān)性。

參考文獻(xiàn)

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[3] 劉雄濤， 蘇菲菲， 尚福軍， 等.人類(lèi)心房肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)與鑒定.科學(xué)技術(shù)與工程， 2014， 14（2）：6-7.

[4] 劉慧， 于風(fēng)旭， 毛亮.風(fēng)濕性心臟病心房顫動(dòng)患者 HCN2蛋白 的表達(dá).中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志， 2013， 27（1）：36-38.

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[6] 李勇， 馬瑞彥， 肖穎彬， 等. 風(fēng)濕性二尖瓣病變并發(fā)心房顫動(dòng)患者483例臨床分析. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 33（10）：1048-1051.

[收稿日期：2014-09-03]