反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法鑒定油菜蜂花粉中的蛋白質(zhì)及活性肽

郭 靜， 晏嘉澤， 郭 明， 靳 艷＊

（1.大連大學環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連116622；2.中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室，遼寧 大連116023）

蜂花粉含有蛋白質(zhì)、糖類、脂類、維生素、微量元素等化學成分，被譽為“微型營養(yǎng)庫”和“完全營養(yǎng)品”。蜂花粉作為藥食同源物質(zhì)在我國具有悠久的食用歷史，近年來研究發(fā)現(xiàn)蜂花粉具有清除自由基、提高免疫力、抑制前列腺疾病、改善心血管疾病、抗腫瘤等功能［1］。鄧建軍等［2］分離提取了油菜蜂花粉中的不同蛋白質(zhì)，并研究了其抗氧化活性。張紅城等［3］對6種蜂花粉中不同酶的活性進行了研究。

以動植物蛋白質(zhì)為原料，用酶解法制備具有生物活性的肽是生物活性肽的研究方向之一。蜂花粉中蛋白質(zhì)含量豐富，可達7%～30%，為制備生物活性肽提供了豐富的資源。已有研究發(fā)現(xiàn)由蜂花粉制備的生物活性肽具有抗氧化［4］、抗輻射［5］、抗腫瘤［6］等活性。在生物活性肽的研究中，以抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）為靶標的降血壓肽尤為引人關(guān)注，最早的ACE抑制肽是從蛇毒中發(fā)現(xiàn)的［7］。酶法降解食物源蛋白質(zhì)制備ACE 抑制肽具有安全性高等特點，現(xiàn)已從大豆蛋白質(zhì)、藻蛋白質(zhì)、魚蛋白質(zhì)等蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中分離得到大量的ACE 抑制肽［8-10］。

目前常用的生物活性肽研究方法是通過色譜分離等手段得到單一肽段，再利用質(zhì)譜分析等技術(shù)鑒定肽段氨基酸序列，從而獲得混合肽段中活性肽段的信息。但是傳統(tǒng)的分離方法需要經(jīng)過繁瑣的分離純化步驟才可以得到極少的目標產(chǎn)物，耗時耗力、效率低下。高通量、低損耗是質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展趨勢，相關(guān)行業(yè)研究領(lǐng)域也對此需求迫切［11］?；谝合嗌V-質(zhì)譜技術(shù)的鳥槍法是蛋白質(zhì)組學研究的策略之一，該方法通過直接對蛋白質(zhì)混合物進行酶解，經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜分離，鑒定肽段，繼而推導(dǎo)出樣品蛋白質(zhì)［12］。于海洋等［13］基于質(zhì)譜學技術(shù)對錦燈籠中的蛋白質(zhì)進行了鑒定及功能歸屬，Liu［14］等利用鳥槍法的策略分析了鹿血漿中的蛋白質(zhì)，并結(jié)合ACE抑制肽的構(gòu)效關(guān)系分析得到幾條活性較好的ACE 抑制肽。本文以油菜蜂花粉為對象，利用鳥槍法蛋白質(zhì)組學研究策略直接分析其蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物，研究蛋白質(zhì)組成，并在此基礎(chǔ)上篩選具有ACE抑制活性的肽段，極大地縮短了活性肽的研究周期。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

RPLC-MS／MS系統(tǒng)由Finnigan Surveyor液相色譜泵、線性離子阱（LTQ）質(zhì)譜組成（美國Thermo公司）；紫外／可見分光光度計（日本JASCO 公司）；機械式攪拌器（德國IKA 公司）；Magic C18AQ 反相色譜填料（5μm，12 nm，美國Michrom BioResources公司）；石英毛細管（75μm×120 mm，美國Polymicro Technologies公司）；Milli-Q 超純水一體機（美國Millipore公司）。

胰蛋白酶、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（EC3.4.14.1）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）、三氟乙酸（TFA）、牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、蛋白酶抑制劑（cocktail）均購自美國Sigma-Aldrich公司。二硫蘇糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAA）購自美國Bio-Rad公司。乙腈（ACN，HPLC 級）購自德國Merck 公司。乙二胺四乙酸（EDTA）、乙 二 醇 雙（2-氨 基 乙 基 醚）四 乙 酸（EGTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）購自美國Amresco公司。油菜蜂花粉由寬甸萬鈞蜂業(yè)有限公司提供。其他藥品和試劑均為國產(chǎn)分析純或色譜純。

1.2 蛋白質(zhì)含量的測定

委托中國科學院沈陽生態(tài)所農(nóng)產(chǎn)品安全與環(huán)境質(zhì)量檢測中心根據(jù)國家標準GB／T5009.5-2003 進行測定。

1.3 樣品前處理

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取

向10 mL 50 mmol／L Tris-HCl緩 沖 液（pH 7.4，含8 mol／L 尿 素、1 mmol／L EDTA 和1 mmol／L EGTA）中加入0.1 g DTT，使其終濃度為65 mmol／L；再加入100μL Triton X-100，冰浴5～10 min 后，加 入100 μL cocktail 和100 μL 100 mmol／L的PMSF。將1.5 g經(jīng)液氮環(huán)境中研磨破壁的油菜蜂花粉分散其中，超聲提取3次（每次程序為：400 W 超聲4 s，停4 s，80 個循環(huán)）。于4 ℃25 000 g離心力下離心1 h，吸取上清液，加入4倍體積的沉淀液（丙酮∶乙醇∶乙酸＝50∶50∶0.1，v／v／v），沉 淀 過 夜；于4 ℃25 000 g 離 心 力 下 離 心30 min，棄去上清液；丙酮洗滌脫色，于4 ℃25 000 g離心力下離心15 min，棄去上清液；丙酮反復(fù)洗滌直至上清無色，再用75%（v／v）乙醇洗去丙酮。于4℃25 000 g離心力下離心10 min，棄去上清液，沉淀物冷凍干燥后于-20 ℃保存。

1.3.2 蛋白質(zhì)的酶解

凍干蛋白質(zhì)用100 mmol／L NH4HCO3緩沖液（pH7.4，含8 mol／L尿素）復(fù)溶，Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度。取質(zhì)量濃度為2 mg／mL 的蛋白質(zhì)溶液1 mL，加入DTT 使其終濃度為20 mmol／L，于60℃水浴1 h；加入IAA 使其終濃度為40 mmol／L，室溫避光放置40 min；加入100 mmol／L NH4HCO3，使尿素終濃度為1 mol／L，以酶∶蛋白質(zhì)＝1∶25（w／w）的比例加入胰蛋白酶，于37 ℃酶解20 h。

1.3.3 蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的凈化

C18SPE柱經(jīng)3倍柱體積的乙腈活化，再用3倍柱體積的0.1%（v／v）三氟乙酸溶液洗去乙腈。蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物用50%（v／v）三氟乙酸溶液調(diào)節(jié)pH值至2～3后過柱。經(jīng)3倍柱體積的0.1%（v／v）三氟乙酸溶 液 脫 鹽 后，用1.2 mL 80%（v／v）乙 腈／0.1%（v／v）三氟乙酸溶液分3次洗脫，洗脫液冷凍干燥后于-20 ℃保存。

1.4 RPLC-MS／MS分析

將凍干的酶解樣品用0.1%（v／v）甲酸溶液復(fù)溶至0.4μg／μL，取20μL 進行RPLC-MS／MS 分析，重復(fù)3次。

將毛細管（內(nèi)徑75μm）的一端拉成內(nèi)徑約為5 μm 的尖端，把Magic C18AQ 填料壓入柱內(nèi)，填充柱長度在12 cm 左右，將毛細管柱與質(zhì)譜相連。所用的流動相A 為0.1%（v／v）的甲酸溶液，流動相B為0.1%（v／v）的甲酸／乙腈溶液，流速為200 nL／min。梯度洗脫過程如下：0～2 min，0%B～5%B；2～122 min，5%B～35%B；122～125 min，35%B～80%B；125～135 min，80%B；135～137 min，80%B～0%B；137～150 min，0%B。

設(shè)置離子傳輸毛細管的溫度為200 ℃，電噴霧電壓為1.8 kV，歸一化碰撞能量為35.0%。均使用數(shù)據(jù)依賴模式對MS和MS／MS進行圖譜采集，掃描模式為全掃描。全掃描中豐度最高的6個離子峰進行MS／MS掃描，其中動態(tài)排除設(shè)置為：重復(fù)次數(shù)為2，重復(fù)容忍時間為30 s，動態(tài)排除時間為90 s。利用Xcalibur軟件（Thermo）進行系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)收集。

1.5 數(shù)據(jù)庫檢索

采集的數(shù)據(jù)用SEQUEST 軟件分別在蜜蜂（Apis，蛋 白 質(zhì) 數(shù) 目 為14 295）和 油 菜（Brassica campestris L.，蛋白質(zhì)數(shù)目為41 262）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（http：／／www.uniprot.org／）中進行檢索。檢索參數(shù)為：酶為胰蛋白酶，最高允許漏切位點為2，前體離子的質(zhì)量容忍度為2 Da，碎片離子的質(zhì)量容忍度為1 Da。搜庫結(jié)果通過本實驗室創(chuàng)建的Armone軟件［15］進行優(yōu)化，篩選標準為Xcorr（cross correlation value）不小于1.9、2.2 和3.75（分別對應(yīng)＋1，＋2和＋3價離子），肽段假陽性率（FDR）控制在1%以內(nèi)。

1.6 肽段合成及其ACE抑制活性的檢測

委托杭州中肽公司（浙江杭州）合成肽段，經(jīng)RPLC-MS檢測純度。將Cushman 等［16］的方法改進后 進 行 體 外ACE 抑 制 活 性 測 定：將50 μL 5 mmol／L HHL與50μL50 mmol／L的硼酸鹽緩沖液（pH8.3，含300 mmol／L NaCl）混合均勻，加入50 μL一定濃度的抑制劑溶液，于37 ℃水浴5 min；加入50μL0.1 U／mL的ACE，于37℃水浴30 min，加入200μL 1 mol／L 的HCl終止反應(yīng)；再加入1 mL乙酸乙酯振蕩15 s，于3 500 r／min離心5 min；取0.8 mL上清液，于90 ℃水浴干燥15 min，復(fù)溶于0.8 mL水中，于228 nm 處檢測吸光值。

抑制率計算公式為：

其中R 表示抑制率；A 表示對照組（將抑制劑溶液用緩沖液替代）的吸光度值；A0表示空白對照組（將抑制劑溶液和ACE 均用緩沖液替代）的吸光度值；B 表示樣品組的吸光度值；B0表示空白樣品組（將樣品組的ACE用緩沖液替代）的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 油菜蜂花粉蛋白質(zhì)分析

油菜蜂花粉樣品經(jīng)測定，其蛋白質(zhì)含量為29.1%。油菜蜂花粉按照1.3節(jié)中方法處理后進行RPLC-MS／MS分析，基峰色譜圖如圖1 所示。經(jīng)檢索，在蜜蜂（Apis）蛋白質(zhì)庫中共鑒定到62 條肽段，在油菜（Brassica campestris L.）蛋白質(zhì)庫中共鑒定到291條肽段，油菜蜂花粉中的大部分蛋白質(zhì)來源于油菜。不同物種中鑒定到的相同序列不進行重復(fù)計數(shù)，鑒定到肽段的來源分布見圖2。這353條肽段所歸屬的蛋白質(zhì)，有239個蛋白質(zhì)在Universal Protein數(shù)據(jù)庫中可以查找到其分子生物學功能，主要有結(jié) 合 活 性（binding activity）、酶 活 性（enzyme activity）、運輸活性（transporter activity）、結(jié)構(gòu)組成（structural constituent）、催 化 活 性 （catalytic activity）、抑制活性（inhibitor activity）等。在所鑒定到的蛋白質(zhì)中，有些同時具有多重分子生物學功能，如UvrABC system protein B同時具有催化活性和結(jié)合活性。

圖1 RPLC-MS／MS分析油菜蜂花粉蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的基峰色譜圖Fig.1 Base peak chromatogram of protein degradation from rape bee pollen by RPLC-MS／MS analysis

圖2 鑒定肽段的來源分布Fig.2 Source distribution of the identified peptides

這些蛋白質(zhì)按生物學功能分類情況如圖3 所示，圖中數(shù)值代表具有該功能的蛋白質(zhì)數(shù)量，其中61%的蛋白質(zhì)具有結(jié)合活性或酶活性。結(jié)合活性包括：結(jié)合離子（如鋅離子、鈣離子、鐵離子、鎂離子等）的活性；結(jié)合脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、三磷酸腺苷（ATP）等的活性；結(jié)合脂質(zhì)、鐵血紅素、碳水化合物以及結(jié)合輔助因子的活性。酶活性包括氧化還原酶活性、水解酶活性、異構(gòu)酶活性、合成酶活性等。

圖3 油菜蜂花粉中鑒定到的蛋白質(zhì)的生物學功能分類Fig.3 Biological function distribution of the proteins identified in rape bee pollen

2.2 ACE抑制肽的篩選

ACE抑制肽的生物活性受肽段氨基酸組成、序列結(jié)構(gòu)和長度的影響。大多數(shù)ACE 抑制肽由2～12個氨基酸組成，C 末端氨基酸多為芳香族氨基酸（如Y、F）或疏水氨基酸（如L、I）［17，18］。Cushman等［19］認為肽段C 末端三肽強烈影響其ACE抑制活性，能夠與ACE活性位點相互作用的最為理想的C末端三肽序列為FAP或者WAP，而W、Y、P、F則被認為是C 末端最合適的氨基酸殘基；同時當N 末端為支鏈氨基酸如V、I時，肽段對ACE 活性抑制較強。Meisel等［20］通過計算機分子建模對ACE 抑制肽構(gòu)效關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)抑制肽能與不被底物所占據(jù)的亞活性位點或不同于ACE 催化部位的陰離子抑制劑結(jié)合位點相互作用，ACE抑制肽中相似的正電勢幾乎均位于C 末端的相同區(qū)域。肽段中疏水性氨基酸的含量也會對其活性有較大的影響［21］。根據(jù)以上內(nèi)容推測在本實驗中鑒定到的353條肽段中，AGFAGDDAPR、AELDIVLALFK、LAVNLIPFPR、IIIALLLYK 和LLICGGSAYPR 這5 條 肽 段 可能具有ACE抑制活性。

C 末端以P、F結(jié)束的肽段對ACE 具有很強的抑 制活 性［22，23］。Ghassem 等［24］從 魚 類 蛋 白 質(zhì) 中 分離出以P結(jié)束的肽段NGTVVFEPP，該肽段具有較高的ACE抑制活性。Saiga等［25］從雞胸肉中分離純化出P4肽（GFHypGTHypGLHypGF），并對其氨基酸序列結(jié)構(gòu)與ACE 抑制活性之間的關(guān)系進行了研究，發(fā)現(xiàn)當移除C 末端的F后，對ACE 的抑制活性大大降低，半數(shù)抑制濃度（IC50）由46μmol／L 升至25 000 μmol／L。鑒 于 以 上 報 道，將 篩 選 到 的AELDIVLALFK 和LAVNLIPFPR肽段C 端的K、R去掉，序列變?yōu)锳ELDIVLALF 和LAVNLIPFP，推測其會具有更高的ACE抑制活性。

2.3 ACE抑制活性測定

化學合成2.2節(jié)中推測具有ACE 活性的肽段并測定其ACE 抑制活性，結(jié)果見表1。其中AGFAGDDAPR來源于蜜蜂，其對ACE 活性抑制的IC50值為（202.48±9.60）μmol／L。該肽段C 末端三肽中有A、P兩個疏水性氨基酸，N 末端為支鏈氨基酸A，符合ACE抑制肽的構(gòu)象特征。其他4條肽段均來源于花粉，其中肽段AELDIVLALF對ACE活性的抑制效果最好，其IC50值為（10.65±0.50）μmol／L。在ACE 抑 制 肽 數(shù) 據(jù) 庫（http：／／www.cftri.com／pepdb／index.php）中，已知抑制ACE 活性IC50值的肽段有619條，將AELDIVLALF的IC50值與之比較后排序，結(jié)果位于第147位，抑制活性居數(shù)據(jù)庫中前24%。肽段AELDIVLALF的C 末端三肽均為疏水性氨基酸，分別是A、L 和F，C 末端為F，且整條肽段含有較多的疏水性氨基酸，包括A、V、L、F和I。LAVNLIPFP的抑制活性位于數(shù)據(jù)庫中前34%，其IC50值為（23.66±1.08）μmol／L。其C 末端三肽含芳香族氨基酸F、疏水性氨基酸P，N末端為支鏈氨基酸L，且含有2／3的疏水性氨基酸，包括A、V、L、F、I和P，具有良好的ACE 抑制肽的結(jié)構(gòu)。LLICGGSAYPR 和IIIALLLYK 也表現(xiàn)出較好的ACE 抑制活性，IC50值分別為（43.58±1.96）μmol／L和（28.61±1.37）μmol／L，這兩條肽段C末端三肽均含有兩個疏水性氨基酸，N 末端均為支鏈氨基酸，且疏水性氨基酸在整條肽鏈中比例均在50%以上。本方法基于蛋白質(zhì)組學分析，結(jié)合構(gòu)效關(guān)系篩選生物活性肽，通過化學合成肽段后進行生物活性驗證，相比需要經(jīng)繁復(fù)的分離過程才能得到極少產(chǎn)物的常規(guī)生物活性肽鑒定、純化方法，大大縮短了鑒定周期。

表1 源于油菜蜂花粉的ACE抑制肽Table 1 ACE inhibitory peptides from rape bee pollen

表2是上述ACE 抑制肽所屬蛋白質(zhì)的分子生物學功能描述，5條肽段所屬的蛋白質(zhì)具有結(jié)合功能、酶催化活性以及結(jié)構(gòu)組成等功能。細胞膜上Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶活性降低引起的細胞內(nèi)Ca2＋濃度升高是高血壓發(fā)病的關(guān)鍵機制［26］，三磷酸鳥苷（GTP）在GTP酶的催化作用下先轉(zhuǎn)化為二磷酸鳥苷（GDP），之后轉(zhuǎn)化成ATP。GTP酶活性及GTP 結(jié)合功能將直接或間接影響Na＋-K＋-ATP酶和Ca2＋-ATP酶的活性，從而影響高血壓發(fā)病。ABC（ATP-binding cassette transporter）家族是一組ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，主要從事細胞內(nèi)外的物質(zhì)轉(zhuǎn)運，早期認為該家族主要與腫瘤細胞的多藥耐藥性有關(guān)，近年來發(fā)現(xiàn)其在各個器官及疾?。ㄓ绕涫切难芗膊。┲斜憩F(xiàn)出多種其他重要病理和生理功能［27］。從篩選出的肽段所屬蛋白質(zhì)的生物功能上分析，這些肽段均與高血壓存在一定的相關(guān)性。

表2 ACE抑制肽所屬蛋白質(zhì)的分子生物學功能Table 2 Molecular biological functions of the proteins that ACE inhibitory peptides belong to

3 結(jié)論

本文基于鳥槍法蛋白質(zhì)組學策略，利用蛋白質(zhì)組學分析平臺對油菜蜂花粉蛋白質(zhì)進行研究，共鑒定到353條肽段，其所屬蛋白質(zhì)具有結(jié)合活性、酶活性及運輸活性等分子生物學功能。根據(jù)ACE 抑制肽的構(gòu)效關(guān)系進行篩選及修飾，得到AGFAGDDAPR、AELDIVLALF、LAVNLIPFP、IIIALLLYK 和LLICGGSAYPR這5條可能具有ACE 抑制活性的肽段。化學合上述成肽段并進行ACE 抑制活性驗證，結(jié)果顯示這5條肽段均具有良好的活性，其中肽段AELDIVLALF和LAVNLIPFP 表現(xiàn)出較高的抑制活 性，IC50值 分 別 為（10.65±0.50）μmol／L 和（23.66±1.08）μmol／L。以上結(jié)果表明，將蛋白質(zhì)組學分析平臺與活性肽構(gòu)效相結(jié)合可用于快速、高效篩選ACE抑制肽。

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