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    HPLC法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸的含量*

    2014-12-24 05:20:10黃祝剛于亮左琳滿其倩容蓉鞏麗麗蔣海強(qiáng)呂青濤
    化學(xué)分析計(jì)量 2014年6期
    關(guān)鍵詞:白花蛇舌草果酸

    黃祝剛,于亮,左琳,滿其倩,容蓉,鞏麗麗,蔣海強(qiáng),呂青濤

    (山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南 250355)

    白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草(Hedyotis diffusa willd)的干燥全草。近代研究發(fā)現(xiàn),白花蛇舌草具有抗腫瘤、提高機(jī)體免疫功能、抗衰老、抗氧化、保肝利膽、抗化學(xué)誘變等作用[1–3],其中主要的化合物有蒽醌類、烷烴類、萜類、有機(jī)酸類、生物堿類、揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類、甾醇類、氨基酸以及一些微量元素等[4–6]。筆者在對(duì)白花蛇舌草乙酸乙酯部位進(jìn)行抗子宮內(nèi)膜癌活性研究時(shí),通過活性篩選分離得到了對(duì)香豆酸和熊果酸兩種成分。經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),對(duì)香豆酸具有抗癌和抗心血管病的作用[7–8];熊果酸具有多方面的藥理作用,它對(duì)體外革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌均有活性,還有抗?jié)儭㈡?zhèn)咳、抗癌作用,可以抗突變、抗氧化、抗血管瘤生成和誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化[9]。為考察藥材中對(duì)香豆酸和熊果酸的含量及其與抗癌作用的關(guān)系,筆者首次建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸含量的方法,并對(duì)7批白花蛇舌草藥材中對(duì)香豆酸和熊果酸的含量進(jìn)行了測(cè)定及對(duì)比,也為白花蛇舌草藥材活性成分含量測(cè)定提供了參考依據(jù)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與試劑

    高效液相色譜儀:Agilent 1100型,附帶DAD檢測(cè)器、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、在線真空脫氣機(jī),美國(guó)安捷倫公司;

    電子天平:AE240型,瑞士梅特勒公司;

    對(duì)香豆酸、熊果酸化學(xué)對(duì)照品:批號(hào)分別為D–032–140728,X–006–140801–2,經(jīng)HPLC檢測(cè)對(duì)香豆酸和熊果酸純度均在98%以上,北京寶賽希望生物科技有限公司;

    白花蛇舌草藥材:濟(jì)南市漱玉平民大藥房、七星大藥房和康之源大藥房等(產(chǎn)地及批號(hào)分別為江西111201,130301,130612;安徽130906;廣西120908,130911;湖北120618),經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定為茜草科草本植物白花蛇舌草;

    甲醇:色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;

    無水乙醇:分析純,天津市達(dá)森化工產(chǎn)品銷售有限公司;

    實(shí)驗(yàn)用水為純凈水。

    1.2 色譜條件

    色譜柱:Eclipse SB–C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:0.05%甲酸水溶液(A)–甲醇(B),流 量 為1 mL/min;梯 度 洗 脫:0~20 min B為30%~45%,20~21 min B為45%~88%,21~45 min B為88%;柱溫:30℃;檢測(cè)波長(zhǎng):310 nm(對(duì)香豆酸),210 nm(熊果酸);進(jìn)樣體積:20 μL。

    1.3 對(duì)照品溶液的制備

    稱取對(duì)香豆酸標(biāo)準(zhǔn)品適量,精密稱定,用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,配制成0.035 8 mg/mL的對(duì)香豆酸溶液;稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品適量,精密稱定,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,配制成0.426 mg/mL的熊果酸溶液。

    1.4 樣品溶液的制備

    稱取白花蛇舌草粉末(0.84~0.42 mm)約1 g,置于250 mL圓底燒瓶中,加入70%乙醇溶液80 mL,95℃水浴回流提取2.0 h,共提取3次,濾過,合并濾液,減壓干燥蒸干,以甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,用0.45 μm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,制得樣品溶液。

    1.5 色譜圖

    在1.2色譜條件下對(duì)混合對(duì)照品溶液及樣品溶液進(jìn)行測(cè)定,色譜圖見圖1。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 提取溶劑選擇

    以對(duì)香豆酸與熊果酸的含量為指標(biāo),進(jìn)行了白花蛇舌草的提取溶劑考察,比較了一系列不同濃度的乙醇提取物中二者的含量差異,最終選擇70%乙醇對(duì)二者同時(shí)提取較為適宜。

    圖1 310 nm波長(zhǎng)下混合對(duì)照品溶液色譜圖

    圖2 310 nm波長(zhǎng)下樣品溶液色譜圖

    圖3 210 nm波長(zhǎng)下混合對(duì)照品溶液色譜圖

    圖4 210 nm波長(zhǎng)下樣品溶液色譜圖

    2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)考察

    采用DAD檢測(cè)器在190~400 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,采集光譜圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)香豆酸和熊果酸分別在310 nm處和210 nm處有最大吸收,故分別選擇310 nm和210 nm作為對(duì)香豆酸和熊果酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。當(dāng)采用DAD檢測(cè)器時(shí),可以同時(shí)采集多個(gè)波長(zhǎng)下的色譜圖,因此可以一次完成兩個(gè)組分不同波長(zhǎng)下的同時(shí)檢測(cè)。當(dāng)采用普通紫外檢測(cè)器時(shí),可以在工作站軟件中設(shè)置波長(zhǎng)時(shí)間表,在兩組分的出峰時(shí)間分別采用不同波長(zhǎng)檢測(cè),實(shí)現(xiàn)兩個(gè)組分不同波長(zhǎng)下的同時(shí)測(cè)定。

    2.3 流動(dòng)相選擇

    首先采用等度洗脫的方式,結(jié)果發(fā)現(xiàn)目標(biāo)成分很難與干擾峰有效分離,而采用梯度洗脫的方式,可以對(duì)對(duì)香豆酸和熊果酸達(dá)到很好的分離,并且在較短時(shí)間內(nèi)同時(shí)出峰。但是采用梯度洗脫的方式時(shí),條件控制不好會(huì)導(dǎo)致重現(xiàn)性差,解決辦法是延長(zhǎng)每次進(jìn)樣前的平衡時(shí)間,且每次采用相同的條件平衡色譜柱,這樣會(huì)達(dá)到很好的分離效果。實(shí)驗(yàn)過程中比較了乙腈–水、乙腈–0.05%甲酸、甲醇–水、甲醇–2%冰乙酸、甲醇–0.05%甲酸5種流動(dòng)相系統(tǒng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用甲醇–0.05%甲酸溶液梯度洗脫時(shí),對(duì)香豆酸和熊果酸二者分離度均在1.5以上,各指標(biāo)峰峰形良好,基線平穩(wěn),分離度高。

    2.4 線性方程

    精密量取對(duì)香豆酸和熊果酸對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5,1,2,4,6,8 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至標(biāo)線,搖勻,按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)、對(duì)香豆酸和熊果酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得對(duì)香豆酸線性回歸方程為y=20 530x–37.56(r=0.999 8);熊果酸線性回歸方程為y=8 321x+12.81(r=0.999 6)。結(jié)果表明,對(duì)香豆酸在0.001 79~0.028 64 mg/mL、熊果酸在0.021 3~0.340 8 mg/mL時(shí),對(duì)香豆酸和熊果酸的質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

    2.5 精密度試驗(yàn)

    取同一份樣品溶液,按2.1項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)測(cè)定6次,結(jié)果見表1。由表1可知,對(duì)香豆酸和熊果酸測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.37%和0.32%,說明該方法精密度良好。

    表1 白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸的精密度試驗(yàn)(n=6)

    2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

    取同一份樣品溶液,分別在0,2,4,8,12,24 h進(jìn)樣分析,對(duì)香豆酸和熊果酸峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%和1.1%,表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

    取同一批號(hào)白花蛇舌草(0.84~0.42 mm)約1 g,精密稱定6份,按1.4方法制備樣品溶液,在1.2色譜條件下測(cè)定,測(cè)得藥材中對(duì)香豆酸和熊果酸的平均含量分別為0.021%和0.307%,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%和1.8%,說明該方法重復(fù)性良好。

    2.8 加樣回收試驗(yàn)

    取已知含量同一批號(hào)的白花蛇舌草粉末(0.84~0.42 mm)1 g,精密稱量6份,分別精密加入對(duì)香豆酸和熊果酸對(duì)照品溶液,按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定,結(jié)果見表2。由表2可知,對(duì)香豆酸和熊果酸的平均回收率分別為98.59%和98.23%,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.81%和0.94%,表明方法具有較高的準(zhǔn)確度。

    表2 對(duì)香豆酸和熊果酸的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    2.9 樣品測(cè)定

    取7批白花蛇舌草粉末各3份,每份1 g,精密稱定,按1.4方法制備樣品溶液,在1.2色譜條件下測(cè)定對(duì)香豆酸和熊果酸的色譜峰面積,計(jì)算樣品中二者的含量,結(jié)果見表3。由表3可知,不同產(chǎn)地及批號(hào)的白花蛇舌草中二者的差異較大,其中江西產(chǎn)地的白花蛇舌草二者含量均最高,而廣西產(chǎn)地的藥材二者含量均最少。

    表3 白花蛇舌草藥材中對(duì)香豆酸和熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果(n =3)

    3 結(jié)語

    建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸兩種化合物含量的方法,該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度,為白花蛇舌草藥材活性成分含量測(cè)定奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。結(jié)果表明不同產(chǎn)地及批號(hào)的白花蛇舌草中對(duì)香豆酸和熊果酸含量的差異較大,其中江西產(chǎn)白花蛇舌草中的對(duì)香豆酸及熊果酸含量均較高,所以對(duì)白花蛇舌草乙酸乙酯部位進(jìn)行抗子宮內(nèi)膜癌活性研究時(shí),宜采用江西產(chǎn)的藥材。

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