基于LUX引物的HBV實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法的建立＊

李桂民

(臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276005)

在世界范圍內(nèi)，特別是亞洲、非洲、南歐和拉丁美洲，HBV是導(dǎo)致病毒性肝炎發(fā)生的重要因素。據(jù)估計(jì)約有20億人曾感染過(guò)HBV，其中近4億人成為慢性乙肝病毒攜帶者［1］。

大約三分之一的HBV攜帶者會(huì)發(fā)展為肝硬化，25%的會(huì)發(fā)展為肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)［2］。研究表明，血清中HBV DNA水平的檢測(cè)可作為鑒定個(gè)體病毒復(fù)制、監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展和抗病毒的效果、檢測(cè)耐藥性突變的發(fā)生和檢測(cè)停止抗病毒治療后復(fù)發(fā)的重要手段［3-5］。

近幾年來(lái)，因檢測(cè)快速、靈敏、重復(fù)性好等特點(diǎn)，實(shí)時(shí)PCR已被廣泛接受并成為病毒核酸定量的金標(biāo)準(zhǔn)［6，7］。目前幾種檢測(cè) HBV DNA 的實(shí)時(shí) PCR 方法已經(jīng)建立［8-11］，其中多數(shù)使用SYBR green嵌入染料或者是帶有一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)的Taqman探針。但是，前者特異性較低，而后者的費(fèi)用較高。最近一種基于LUX引物的新的實(shí)時(shí)PCR建立起來(lái)，與其它熒光定量PCR相比其成本更低［12，13］。

LUX檢測(cè)技術(shù)是一種序列特異性的檢測(cè)，它無(wú)需使用探針。每一套LUX引物包括一個(gè)單一熒光標(biāo)記的引物(既可以是正向引物，也可是反向引物)和另一個(gè)對(duì)應(yīng)的非標(biāo)記引物。就其本身而言，熒光引物設(shè)計(jì)為自我淬滅的形式，不會(huì)發(fā)出顯著的熒光。而當(dāng)這一引物摻入到雙鏈PCR產(chǎn)物中，即可觀察到熒光信號(hào)顯著增加(http://www.invitrogen.com/lux)。

本研究的目的是建立一種基于LUX平臺(tái)的成本低、特異性強(qiáng)、高度靈敏的HBV實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。

1 材料

血清樣品:本研究的樣品為HBsAg陽(yáng)性樣品，健康獻(xiàn)血者的血清樣品，所有血清樣品使用前在－70℃冷柜中保存。試劑:質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、Taq DNA聚合酶、EcoR I(大連寶生物公司);UDG酶(MBI公司);QIAamp DNA Blood Mini kit(QIAgene公司);LUX引物(Invitrogen公司)。

儀器:核酸蛋白測(cè)定儀、IQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 病毒DNA的提取

從每份血清樣品中取200 μL提取HBV DNA，病毒DNA的提取按照QIAamp DNA Blood Mini kit說(shuō)明書進(jìn)行。用50 μL的 AE緩沖液洗脫硅膠柱上的DNA，其中的25 μL用來(lái)作為L(zhǎng)UX實(shí)時(shí)PCR分析的模板。提取的HBV DNA直接用于檢測(cè)或保存在－20℃中以備將來(lái)檢測(cè)使用。

2.2 HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備

用大連寶生物公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取含HBV全序列(pHBV-adr)的質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒DNA用限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I消化，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳。然后在長(zhǎng)波紫外光下用手術(shù)刀片切下大小約為3200 bp的亮帶，用凝膠回收試劑盒回收目的片段?；厥债a(chǎn)物用H2O適當(dāng)稀釋后，用核酸蛋白測(cè)定儀(Bio-Rad，USA)測(cè)定260 nm和280 nm吸光值，計(jì)算A260/A280，判斷提取DNA的純度。根據(jù)A260值，以A260=1時(shí)，雙鏈DNA濃度為50 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算樣品DNA濃度及拷貝數(shù)。計(jì)算公式為:DNA 納克數(shù)/(660×3200)×6.02×1014。然后依次進(jìn)行10倍稀釋，獲得多個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)品(2×107～2×10-1)，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物

利用 NCBI Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)獲得HBV聚合酶基因的保守序列，以保證覆蓋所有的亞型。根據(jù)保守序列利用Invitrogen公司LUXTM在線設(shè)計(jì)的軟件設(shè)計(jì)正向的熒光引物和非熒光標(biāo)記的反向引物。正向的熒光引物序列為5'-cggaaCCCCTATCTTATCAACACTTCC(FAM)G-3'，反向引物(無(wú)熒光標(biāo)記)序列為5'-CGAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'。

2.4 HBV LUX 實(shí)時(shí)分析

實(shí)時(shí)PCR在50 μL的反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)體系包括200 nmol/L的引物(FAM標(biāo)記的熒光引物和未標(biāo)記的引物)，500 ng/μL 的 BSA，200 μmol/L 的dGTP，dATP，dCTP 和 400 μmol/L dUTP，5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，50 mmol/L KCl，1.25 U 的熱啟動(dòng) Taq DNA 聚合酶，0.5 U 的UDG酶和25 μL DNA樣品。使用美國(guó)伯樂(lè)公司的iCycler iQ5進(jìn)行PCR，反應(yīng)程序?yàn)?50℃ UDG酶作用2 min;95℃ UDG酶失活，預(yù)變性5 min;95℃變性10 s，60 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，45 個(gè)循環(huán)。在擴(kuò)增反應(yīng)的末尾設(shè)置熔解曲線分析的程序:95℃變性1 min，55 ℃退火1 min，每10 s增加0.5 ℃，共80個(gè)循環(huán)。在每次反應(yīng)中，系列稀釋的HBV標(biāo)準(zhǔn)品(5-5×108拷貝/管)與樣品一起平行擴(kuò)增，所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品都設(shè)兩個(gè)重復(fù)孔。

2.5 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)

使用伯樂(lè)iQ5第2版的光學(xué)系統(tǒng)軟件分析Ct值和擴(kuò)增數(shù)據(jù)。熒光數(shù)據(jù)在每個(gè)循環(huán)的延伸階段(72℃)收集，Ct值由軟件確定，并自動(dòng)生成Ct值對(duì)模板拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知樣品HBV DNA的定量可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將HBV DNA進(jìn)行10倍系列稀釋，獲得系列標(biāo)準(zhǔn)品，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR，獲得了擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)。由圖可知，循環(huán)閾值(Ct值)和初始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)具有良好的相關(guān)性，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為 R2=1.000，y-截距為 39.291，斜率為-3.309，擴(kuò)增效率接近理論值100%(斜率為-3.32)。該標(biāo)準(zhǔn)曲線有9個(gè)log10的動(dòng)態(tài)范圍，可用于待測(cè)樣品中HBV DNA的定量。定量的低限可達(dá)5拷貝HBV DNA/反應(yīng)。

圖1 HBV DNA標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Amplification plots and standard curves of standard HBV DNA

3.2 敏感性分析

為了評(píng)估LUX實(shí)時(shí)PCR的敏感性，將HBV DNA 5倍系列稀釋(1，5，25拷貝/反應(yīng))，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)反應(yīng)設(shè)10個(gè)重復(fù)。同時(shí)建立一個(gè)9個(gè)log10動(dòng)態(tài)范圍(5-5×104拷貝/反應(yīng))的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)對(duì)HBV DNA進(jìn)行定量。如圖2所示，LUX實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)低限可至1拷貝/反應(yīng)。但是，這一濃度的擴(kuò)增反應(yīng)并不穩(wěn)定，有的反應(yīng)不能獲得擴(kuò)增曲線，而5拷貝/反應(yīng)的PCR均可穩(wěn)定地獲得擴(kuò)增曲線，因此將HBV DNA定量低限確定為5拷貝/反應(yīng)。

圖2 HBV DNA擴(kuò)增曲線和線性關(guān)系Fig.2 Amplification plots and linear relationship of HBV DNA

3.3 重復(fù)性分析

為了評(píng)價(jià)LUX技術(shù)的重復(fù)性，從91份陽(yáng)性樣品中隨機(jī)抽取10份，連續(xù)4天分別進(jìn)行LUX檢測(cè)(見(jiàn)表1)。結(jié)果表明，SD值不高于0.26×108，%CV在10.77到26.53的范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法具有很高的重復(fù)性。

3.4 特異性分析

對(duì)48個(gè)健康獻(xiàn)血者的血清樣品進(jìn)行分析，并且還將健康獻(xiàn)血者全血基因組DNA摻入到PCR反應(yīng)中，以確定LUX實(shí)時(shí)檢測(cè)方法的特異性(見(jiàn)表2)。結(jié)果表明，所有反應(yīng)均無(wú)陽(yáng)性信號(hào)。對(duì)91份HBV陽(yáng)性樣品進(jìn)行LUX檢測(cè)，并通過(guò)熔點(diǎn)曲線分析來(lái)確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性(見(jiàn)圖3)。特異序列擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)具有相同的解鏈溫度(82℃)，而非特異序列(如引物二聚體)的解鏈溫度一般為78℃左右。圖3表明，無(wú)論標(biāo)準(zhǔn)品還是陽(yáng)性樣品在熔點(diǎn)曲線中只出現(xiàn)一個(gè)峰，Tm值為82℃左右，而陰性樣品沒(méi)有峰出現(xiàn)，這說(shuō)明該方法具有很高的特異性。

表1 HBV DNA LUX實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的重復(fù)性Tab.1 Repeatability of LUX real time PCR assay for HBV DNA

表2 91份陽(yáng)性樣品和48份陰性樣品的定量結(jié)果Tab.2 Quantitation results of 91 positive samples and 48 negative samples

4 討論

HBV DNA的定量對(duì)于監(jiān)測(cè)疾病的發(fā)展和慢性HBV感染治療的效果具有十分重要的意義［14］?；颊逪BV DNA的水平＜105拷貝/mL時(shí)說(shuō)明HBV復(fù)制不活躍［15］。此外，低水平HBV DNA的檢測(cè)對(duì)于臨床醫(yī)師是非常必要的，它可作為評(píng)價(jià)治療效果和做出治療決策的依據(jù)，還可對(duì)抗病毒治療停藥后的復(fù)發(fā)迅速做出判斷［1］。因此，建立一種高度靈敏的HBV實(shí)時(shí)檢測(cè)平臺(tái)對(duì)于檢測(cè)慢性乙肝患者低水平的HBV DNA具有十分重要的意義。

圖3 HBV標(biāo)準(zhǔn)品、陽(yáng)性陽(yáng)品和陰性樣品的熔解曲線和熔解峰圖Fig.3 Melt curve and melt peak charts of HBV standard，positive and negative samples.

LUX實(shí)時(shí)PCR是新型的檢測(cè)方法，目前已用于多種病原體的檢測(cè)［16-19］。本研究之所以選擇LUX技術(shù)來(lái)檢測(cè)病毒載量，是因?yàn)榕c雙標(biāo)記的探針相比具有較高的靈敏度，也顯著優(yōu)于DNA結(jié)合染料［12，20-22］。最近研究表明LUX方法可檢測(cè)到100或更低拷貝的目的基因［12，20，21］。與商品化的檢測(cè)方法比較，本研究建立的HBV LUX方法具有更高的靈敏度，可檢測(cè)到1個(gè)拷貝HBV DNA/反應(yīng)。但是，該濃度不能被穩(wěn)定的檢測(cè)，而5個(gè)拷貝HBV DNA/反應(yīng)的可以100%進(jìn)行定量，因此將該濃度確定為L(zhǎng)UX技術(shù)HBV DNA的定量低限，當(dāng)從200 μL血清中提取HBV DNA 并且50 μL 洗脫的DNA 的一半(25 μL)進(jìn)行LUX實(shí)時(shí)檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)低限相當(dāng)于50個(gè)拷貝的HBV DNA/mL血清。另外，許多商品化的HBV檢測(cè)方法的線性范圍只有3-4個(gè)log10，而本研究HBV LUX檢測(cè)有9個(gè)log10的線性范圍(見(jiàn)圖1)。

Vilcek等研究認(rèn)為，LUX實(shí)時(shí) PCR與 TaqMan PCR具有相似的特異性，但比SYBR Green PCR特異性更強(qiáng)［23］。LUX 檢測(cè)支持熔點(diǎn)曲線分析［12，13，24］，根據(jù)熔點(diǎn)曲線分析可判斷非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體是否存在，因此對(duì)于設(shè)計(jì)一個(gè)特異性強(qiáng)的定量PCR檢測(cè)、對(duì)于實(shí)時(shí)PCR的優(yōu)化都具有十分重要的意義。

Taqman探針需要標(biāo)記兩個(gè)熒光基團(tuán)，而LUX引物只需標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)，因此LUX方法可降低常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷的費(fèi)用［12，24，25］，因而具有商業(yè)化的潛力。

LUX方法還有其它的一些優(yōu)點(diǎn)，如熒光引物易于設(shè)計(jì)和合成［12］。本研究表明LUX方法中非熒光標(biāo)記的引物可以在線設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上重新設(shè)計(jì)以獲得更高的特異性和覆蓋更多的亞型。這一特點(diǎn)為多重實(shí)時(shí)PCR的優(yōu)化提供了更多的選擇。此外，LUX方法還支撐多重實(shí)時(shí)PCR并且適用于多種實(shí)時(shí)PCR儀［12，20，24］。這些優(yōu)點(diǎn)都決定了 LUX 方法可用于傳染病的診斷和病毒載量的測(cè)定。

綜上所述，本研究提供了一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的HBV實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)方法，在科研和臨床檢測(cè)的應(yīng)用方面具有很高的潛力。

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