內(nèi)生真菌提高禾草耐重金屬脅迫的研究進(jìn)展

張興旭，南志標(biāo)，李春杰

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅蘭州730020)

通常把密度大于5 g·cm-3的金屬稱為重金屬，目前自然界中存在的90種元素中有53種是重金屬［1］，主要包括金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、鋅(Zn)、鋁(Al)、鉛(Pb)和鎘(Cd)等。隨著全球工業(yè)化和地球化學(xué)活動(dòng)的日益頻繁，地表和地下水中重金屬污染已經(jīng)成為一個(gè)嚴(yán)重的環(huán)境問題［2-3］。重金屬污染限制作物生產(chǎn)，在食物鏈中通過生物富集來威脅人類的健康［4-6］。Cd是眾多環(huán)境污染中對(duì)植物有毒害效應(yīng)的重金屬之一，可以影響植物一系列的生物化學(xué)和生理代謝過程，包括光合作用、呼吸作用、氮循環(huán)、蛋白質(zhì)新陳代謝以及營(yíng)養(yǎng)元素的吸收［3，7］。目前一些研究表明，重金屬Zn脅迫能夠影響植物體內(nèi)的卡爾文循環(huán)［8］和光合作用的活性［9-11］。

禾草內(nèi)生真菌(Fungal Endophyte or Endophytic Fungi)是指能夠在禾草中度過大部分或全部的生命周期，但不使宿主植物顯示任何外部癥狀的一大類真菌［12］，包括香柱菌屬(Epichloё)及其無性階段 Neotyphodium屬的真菌［13-14］。已經(jīng)在很多冷季型禾草中發(fā)現(xiàn)了Neotyphodium屬及其有性階段Epichloё屬的內(nèi)生真菌［12-13，15］，這些內(nèi)生真菌可以賦予宿主植物很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)能力，主要因?yàn)槠涮岣吡思闹髦参飳?duì)各種生物脅迫［16-21］和非生物脅迫［15，22-23］的耐受性。

通過一系列物理和化學(xué)手段來改善和消除局部地區(qū)的土壤重金屬污染費(fèi)時(shí)、費(fèi)力［24］，特別是對(duì)大面積污染而言更是杯水車薪，而且往往會(huì)導(dǎo)致土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)、生物區(qū)系的改變和土壤功能的退化［25］。植物修復(fù)技術(shù)是一種對(duì)環(huán)境友好的、投入高效的選擇，但是受到諸多因素的限制［26］。植物能夠進(jìn)行土壤修復(fù)的前提條件是該植物對(duì)重金屬污染具有極強(qiáng)的耐受能力［27］。因此，可以通過提高植物對(duì)重金屬污染的耐受性從而提高其修復(fù)能力［28］。研究已經(jīng)證實(shí)，應(yīng)用叢枝菌根和植物共生體進(jìn)行土壤修復(fù)是一種提高植物修復(fù)的新型而高效的方法［29-32］。與叢枝菌根相類似，Neotyphodium屬內(nèi)生真菌也能夠提高寄主禾草對(duì) Al［33］、Zn［34-35］和Cu［15］的耐受性。內(nèi)生真菌還可以影響宿主禾草對(duì)Fe、Zn、Cu、Ca和 P等礦質(zhì)元素的吸收和運(yùn)輸［33，36］。Ren 等［37］的研究表明，與不帶內(nèi)生真菌的植株相比，帶菌多年生黑麥草(Lolium perenne)可以積累更多的Cd元素。

本文綜述目前有關(guān)重金屬脅迫對(duì)禾草生長(zhǎng)和生理生化的影響、禾草對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)以及內(nèi)生真菌的侵染在禾草耐重金屬中調(diào)節(jié)的作用，以期為耐重金屬脅迫禾草品種的選育和植物修復(fù)機(jī)制的研究提供新的方法手段和理論基礎(chǔ)。

1 重金屬脅迫對(duì)禾草形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

有關(guān)重金屬離子脅迫主要有金屬離子的不足和過量?jī)煞N情況，在長(zhǎng)期的共同進(jìn)化過程中，植物已經(jīng)發(fā)展了一些策略來應(yīng)對(duì)金屬離子的脅迫［38］。

1.1 重金屬對(duì)禾草種子萌發(fā)的影響

重金屬離子能夠在高濃度條件下抑制多年生黑麥草的種子萌發(fā)，其中Cd和Pb的抑制作用較Cu和Zn顯著［39］。低濃度的Cd和Pb對(duì)多年生黑麥草(Lolium perenne)的種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用，而高濃度的Cd和Pb抑制了其萌發(fā)［40］。低濃度的Cd對(duì)醉馬草(Achnatherum inebrians)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，而高濃度的Cd明顯抑制了其種子萌發(fā)，內(nèi)生真菌的侵染有效緩解了Cd毒害對(duì)醉馬草種子萌發(fā)的影響［41］。隨后，在對(duì)重金屬Cd脅迫下帶與不帶內(nèi)生真菌的披堿草(Elymus dahuricus)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的研究中也得到了相同的結(jié)論［42］。

1.2 重金屬對(duì)根系活力的影響

植物暴露于有毒重金屬中通常發(fā)生一些很明顯的外部病癥如缺綠病、壞死以及根的生長(zhǎng)抑制［43-44］。蘇丹草(Sorghum sudanense)和多年生黑麥草的根系活力均隨著Cd濃度的升高而逐漸降低［45］，黑麥草、高羊茅(Festuca arundinacea)和匍匐剪股穎(Agrostis stolonifera)在重金屬Zn脅迫下根系活力降低［46］。但是，多年生黑麥草和匍匐剪股穎的根系活力在低濃度Pb脅迫下比對(duì)照有顯著提高［47］，相同的植物物種對(duì)不同種類重金屬脅迫的響應(yīng)不同，可能跟植物的生育期、品種和環(huán)境條件等有關(guān)。內(nèi)生真菌可以增加寄主植物的根冠比、須根數(shù)目及根毛長(zhǎng)度，但是根直徑減?。?3］。Cd脅迫對(duì)胚根生長(zhǎng)的影響大于胚芽生長(zhǎng)，特別是在高濃度鎘脅迫條件下［48-50］。在重金屬Cu脅迫條件下，內(nèi)生真菌侵染的高羊茅具有相對(duì)較多須根數(shù)［15］。隨著Cd脅迫濃度的增加，醉馬草［23］、披堿草［42］和野大麥(Hordeum brevisubulatum)［51］的幼苗均呈現(xiàn)出胚芽長(zhǎng)度顯著降低，葉片失綠黃化、出現(xiàn)紅褐色斑點(diǎn)，胚根褐變的現(xiàn)象，這些癥狀與其他研究報(bào)道相同［3，50］，伴隨著這些癥狀而來的就是植物干物質(zhì)產(chǎn)量的減少［50］，而內(nèi)生真菌的侵染可以顯著緩解Cd對(duì)其幼苗胚根的傷害。很多研究表明，高濃度Cd脅迫對(duì)胚根生長(zhǎng)的影響大于胚芽生長(zhǎng)［48-50］。Cd脅迫對(duì)胚根生長(zhǎng)的影響相對(duì)較大，是因?yàn)橹参锷L(zhǎng)過程中根是植物直接接觸生長(zhǎng)基質(zhì)中Cd元素的器官，根部可能積累了相對(duì)含量較高的Cd元素［52-53］。

1.3 重金屬對(duì)生物量的影響

一年生黑麥草(L.multiflorum)地上部分的干生物量隨著Zn濃度的增加，呈先增后減的變化規(guī)律［46］。在5.0 ×10-4mol·L-1的 Cd 脅迫下，多年生黑麥草、高羊茅、匍匐剪股穎生物量均明顯下降，且地上部分生物量的下降幅度大于地下部分［47］。與未被侵染植株相比，內(nèi)生真菌的侵染可以提高細(xì)羊茅(F.stapfii)對(duì)Al脅迫的耐受性，明顯促進(jìn)宿主植物干物質(zhì)的積累［54］。內(nèi)生真菌可以提高紫羊茅(F.rubra)對(duì) Al脅迫的耐受性，增加其生物量［55］，也可以提高黑麥草對(duì)Zn脅迫的適應(yīng)能力從而增加植株干質(zhì)量和分蘗數(shù)［11，34］。在重金屬Cu脅迫下，內(nèi)生真菌侵染的高羊茅具有相對(duì)較多的地下生物量［15］。Cd脅迫會(huì)顯著降低高羊茅和草地羊茅(F.pratensis)生物量、分蘗數(shù)和綠葉數(shù)，內(nèi)生真菌可以緩解Cd對(duì)羊茅屬植物的毒害，與不帶菌植株相比，帶菌植株具有較高的生物量和生長(zhǎng)指數(shù)［25］。與E-植株相比，E+植株具有較多的分蘗數(shù)和生物量，內(nèi)生真菌的侵染可以提高Cd在高羊茅植株中的積累并且改善 Cd在根部和地上部的運(yùn)輸［56］。醉馬草［23，41］、披堿草［42］和野大麥［51］的生物量均隨著 Cd脅迫濃度的增加而逐漸減少，內(nèi)生真菌的侵染可以顯著緩解Cd毒害，表現(xiàn)為相對(duì)較高的干、鮮質(zhì)量。隨著Mn、Zn和Fe 3種重金屬脅迫濃度的增加，醉馬草地上生物量積累、株高和分蘗數(shù)均顯著降低［57］(表1)。

表1 內(nèi)生真菌對(duì)重金屬離子脅迫的響應(yīng)Table 1 Response of endophyte to heavy metal stress

2 禾草對(duì)重金屬脅迫的生理生化響應(yīng)

植物在水分脅迫條件下，重金屬脅迫往往能夠誘導(dǎo)植物一系列的生化反應(yīng)和生理變化［7］。內(nèi)生真菌侵染可以提高高羊茅［33］及其他5種羊茅屬植物［55］對(duì)重金屬Al的耐受程度。同時(shí)，內(nèi)生真菌會(huì)影響高羊茅對(duì)礦質(zhì)元素(Fe、Zn、Cu、Ca、P)的吸收和體內(nèi)的轉(zhuǎn)移運(yùn)輸［33］。盡管內(nèi)生真菌可以增加寄主植物對(duì)各種脅迫的抗逆性，但是即便是單一脅迫對(duì)植物生理功能的影響也各不相同［11］。如，Cd通過影響植物一系列的生物化學(xué)和生理代謝過程，包括光合作用、呼吸作用、氮循環(huán)、蛋白質(zhì)新陳代謝以及營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，進(jìn)而對(duì)植物產(chǎn)生有毒害效應(yīng)［3，7］;而鉻(Cr)使植物細(xì)胞器的超微結(jié)構(gòu)改變，擾亂代謝活動(dòng)，抑制生長(zhǎng)，加劇細(xì)胞膜脂過氧化以及蛋白質(zhì)和核酸含量和功能的改變［58］;Pb可以直接和間接地作用于植物，通過影響葉片的表面形態(tài)及結(jié)構(gòu)［59-60］和內(nèi)在的物質(zhì)系統(tǒng)、分子基礎(chǔ)［61］來改變植物的光合作用，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)和代謝［3，58，62］。

2.1 光合作用

目前一些研究表明，重金屬Zn脅迫能夠影響植物體內(nèi)的卡爾文循環(huán)［8］以及光合作用的活性［9-11］;N.lolii內(nèi)生真菌可以提高多年生黑麥草對(duì)重金屬Zn脅迫的耐受性，促進(jìn)地上生物量的積累和分蘗的增加，同時(shí)還增強(qiáng)其光合作用［34］。Cd脅迫顯著降低了高羊茅和草地羊茅光系統(tǒng)Ⅱ的最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)，但內(nèi)生真菌侵染的植株下降的幅度要小于不帶菌植株［25］。Cd脅迫的毒性可使大麥(H.vulgare)成熟葉片產(chǎn)生紅褐色邊紋枯死斑［50］，從而影響其光合作用。多年生黑麥草的凈光合速率和最大光化學(xué)效率隨著Cd濃度的增加而降低，高濃度Cd脅迫條件下內(nèi)生真菌可以顯著緩解其下降趨勢(shì)［56］。

2.2 脯氨酸的積累

脯氨酸在植物適應(yīng)干旱和不良環(huán)境中起著重要作用，通過溶質(zhì)積累達(dá)到滲透調(diào)節(jié)的目的和作用。在重金屬脅迫下，植物脯氨酸通常發(fā)生積累現(xiàn)象，但是如何產(chǎn)生這種應(yīng)激反應(yīng)到目前學(xué)術(shù)界一直沒有達(dá)成一致的意見［63-66］。最初的研究發(fā)現(xiàn)，植物遭受重金屬脅迫后體內(nèi)產(chǎn)生并積累了大量的脯氨酸［63-64］，其實(shí)脯氨酸累積并不是植物受重金屬損傷的癥狀［67］，相反，脯氨酸被認(rèn)為是保護(hù)植物免受重金屬毒害的［65，68］，當(dāng)植物受到各種壓力時(shí)脂質(zhì)過氧化和脯氨酸積累之間存在一種關(guān)系［69］。Mn、Zn和Fe脅迫下醉馬草植株中脯氨酸含量會(huì)積累增加［57］。

在田間干旱條件下，E+高羊茅植株中脯氨酸含量的積累低于E-植株，但在室內(nèi)條件下，200 μmol·L-1CdCl2濃度脅迫條件下，E+植株脯氨酸積累高于E-植株，這可能是由于Cd脅迫壓力過大以至于E+植株維持正常的生理代謝過程所致［70］。但是，有關(guān)脯氨酸研究結(jié)論的不一致，可能歸因于不同的逆境脅迫作用于不同的品種和不同環(huán)境。紙上芽床發(fā)芽試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)的結(jié)果均表明，重金屬Cd脅迫下，醉馬草、披堿草和野大麥3種禾草體內(nèi)脯氨酸的積累均顯著增加，E+禾草體內(nèi)脯氨酸含量增加要大于 E- 植株［23，41-42，51］。

2.3 抗氧化酶系統(tǒng)

許多Cd脅迫植物中均有H2O2和·O2-積累的報(bào)道［71-72］，Cd脅迫通過影響質(zhì)膜上膜脂和膜蛋白的相互作用，傷害細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的同時(shí)誘導(dǎo)·O2-的產(chǎn)生從而激發(fā)質(zhì)膜上NADPH-氧化酶的活性［73-76］。在水稻(Oryza sativa)根部［77］和葉部［71］，Cd 脅迫可以增加·O2-的產(chǎn)生，從而激發(fā)了NADPH-氧化酶的活性，被認(rèn)為是Cd誘導(dǎo)·O2-形成的原因。很多研究表明，植物可以通過誘導(dǎo)抗氧化防御體系來增強(qiáng)對(duì)Cd 脅迫的耐受性［3，7，53］。內(nèi)生真菌的侵染可以提高重金屬Cd在高羊茅植株中的積累和抗氧化物酶活性［56］。Zn脅迫下，內(nèi)生真菌侵染(E+)的多年生黑麥草中抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbic acid，APX)的活性低于野生型植株［34］。

目前廣泛認(rèn)為，Cd毒害能夠使植物產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)植物體內(nèi)產(chǎn)生一些與氧化相關(guān)的活性氧自由基［3，53，75］。Cd 脅迫處理的植物中 H2O2積累，可能是由于植物體內(nèi)H2O2產(chǎn)生和清除之間的動(dòng)態(tài)平衡被打亂的結(jié)果［3，53］。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是植物體內(nèi)將活性氧自由基清除并將·O2-自由基轉(zhuǎn)化成H2O2的解毒過程中起首要作用的酶。此外，過氧化氫酶(Catalase，CAT)、過氧化物酶(Peroxidas，POD)和 APX也都能夠防止體內(nèi)H2O2的積累。當(dāng)植物體內(nèi)H2O2含量增加，如果SOD酶活性被抑制，其他酶將會(huì)被激發(fā)來分解和清除這些自由基。因此，有理由認(rèn)為，CAT與APX在配合SOD清除H2O2的過程中發(fā)揮著重要作用［3］。內(nèi)生真菌可以提高醉馬草、披堿草和野大麥在重金屬Cd脅迫下的抗氧化酶系統(tǒng)，在長(zhǎng)期Cd脅迫環(huán)境下CAT、SOD、POD和APX的活性都顯著增加［23，41-42，51］。王萍等［57］研究表明，CAT、SOD 和POD活性均隨著Mn、Zn和Fe 3種重金屬脅迫濃度的增加而顯著上升。丙二醛(MDA)作為機(jī)體受到逆境脅迫后膜脂過氧化的產(chǎn)物，其含量的高低反映了機(jī)體細(xì)胞受損傷的程度。醉馬草［23，41，51，57］、披堿草［42］和野大麥［51］遭受重金屬脅迫后體內(nèi) MDA 含量均明顯升高。

3 植物耐重金屬的機(jī)理

重金屬脅迫與其他各種形式的非生物脅迫相似，也能夠?qū)е麓罅康幕钚匝踝杂苫a(chǎn)生，這些自由基損傷蛋白質(zhì)和DNA等遺傳物質(zhì)并且引起膜脂過氧化，而植物自身的抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)能夠清除自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受傷害［3］，這是植物抗重金屬脅迫的主要機(jī)理之一。

3.1 抗氧化酶

與干旱脅迫相似，重金屬脅迫也能夠通過誘導(dǎo)植物體內(nèi)的一系列生理生化變化來緩解脅迫程度或者提高植物適應(yīng)脅迫的能力［7］。重金屬(如Cd)能誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基和活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)，從而破壞植物主要細(xì)胞大分子，如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和脫氧核糖核酸(DNA)。重金屬脅迫能夠激發(fā)或誘導(dǎo)植物抗氧化酶體系的表達(dá)，具體表現(xiàn)在SOD、CAT和POD活性有不同程度的變化［3］。內(nèi)生真菌可以提高醉馬草、披堿草和野大麥在重金屬Cd脅迫下的抗氧化酶系統(tǒng)，與不帶菌植株相比，帶菌植株的 CAT、SOD、POD和 APX活性均有顯著增加［23，41-42，51］，然而，Cd 脅迫誘導(dǎo)植株 ROS 含量的分子基礎(chǔ)以及內(nèi)生真菌的調(diào)控作用機(jī)制，仍然需要通過將來的研究來進(jìn)一步闡明。

3.2 抗氧化物質(zhì)

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)參與植物抗氧化代謝途徑中活性氧的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)和清除，寄主植物可以通過APX-谷胱甘肽循環(huán)來參與活性氧解毒［78-80］。當(dāng)植物遭受重金屬脅迫時(shí)，液泡膜內(nèi)積累的金屬離子與谷胱甘肽發(fā)生螯合反應(yīng)并形成復(fù)合體隱含于液泡中［81］。由于谷胱甘肽在植物抗活性氧反應(yīng)中具有重要作用，目前已經(jīng)通過轉(zhuǎn)基因手段等分子生物學(xué)的方法來調(diào)控谷胱甘肽的表達(dá)，從而提高目標(biāo)植物的耐重金屬能力［82］。

3.3 重金屬螯合物

當(dāng)植物遭受重金屬脅迫時(shí)，植物螯合肽及其復(fù)合物將金屬離子螯合并且誘發(fā)相關(guān)酶活性的啟動(dòng)，從而在植物應(yīng)對(duì)金屬脅迫的過程中發(fā)揮功能性作用［2，83］。目前，僅見有關(guān)擬南芥(Arabidopsis thaliana)中植物螯合物與重金屬Cd螯合成重金屬?gòu)?fù)合體并將其隔離在液泡中［84］。此外，植物螯合態(tài)還可以作用于谷胱甘肽，通過對(duì)Pb的螯合及形成Pb的螯合物來降低重金屬毒害［85］。內(nèi)生真菌也可能通過與寄主互作分泌一系列的酚類化合物使其結(jié)合可溶性的Al、Fe和Mn來降低金屬離子的脅迫［86-87］。

3.4 植物自我修復(fù)

內(nèi)生真菌侵染的高羊茅在溫室［88］和田間［89］試驗(yàn)中均積累了較低濃度的Cu含量。Neotyphodium屬內(nèi)生真菌的侵染提高了高羊茅和草地羊茅植株地上和地下部分對(duì)重金屬鎘Cd的積累和體內(nèi)運(yùn)輸從而減輕了其對(duì)宿主的傷害，內(nèi)生真菌侵染的植株具有相對(duì)較高的干物質(zhì)，植株地上部和根部積累重金屬Cd的潛能也要高于不帶菌植株。這兩種草類植物對(duì)Cd具有超積累效應(yīng)，而內(nèi)生真菌的侵染增強(qiáng)了這一效應(yīng)［25］。與E-植株相比，E+植株具有較多的分蘗數(shù)和生物量，內(nèi)生真菌的侵染可以提高重金屬Cd在高羊茅植株中的積累并且改善Cd在根部和地上部的運(yùn)輸，帶菌植株對(duì)重金屬的提取和吸收能力強(qiáng)于不帶菌植株的［56］。

4 展望

綜上所述，微量的重金屬作為植物生長(zhǎng)的有益元素，能夠促進(jìn)植物正常的生長(zhǎng)和生理代謝，但是重金屬濃度過高會(huì)嚴(yán)重影響禾草類植物的生長(zhǎng)、生理和生化代謝途徑。通過微生物接種和植物組織培養(yǎng)等方法，能夠成功轉(zhuǎn)接內(nèi)生真菌從而獲得一些新的帶菌禾草新品系。用內(nèi)生真菌侵染禾草來增加寄主植物對(duì)Cd元素的耐受性，可以篩選一些具有優(yōu)良耐受性、更加有效的菌株和禾草新品種(系)用于重金屬污染環(huán)境中的植物修復(fù)。但是，各種重金屬在誘導(dǎo)植物自由基產(chǎn)生過程中的角色和地位以及內(nèi)生真菌在禾草耐重金屬中的調(diào)控作用及其機(jī)理仍然需要進(jìn)一步研究。

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