放牧對松嫩草地羊草群落及土壤微生物群落碳源利用的影響

張建峰，龐思娜，曲同寶

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，吉林長春130118)

松嫩草地作為東北平原的天然生態(tài)屏障，以其土質(zhì)優(yōu)良、水草資源豐富，氣候適宜而馳名，適合放養(yǎng)家畜。羊草(Leymus chinensis)是多年生根莖禾本科牧草，其生態(tài)適應(yīng)性強，對干旱嚴(yán)寒貧瘠等惡劣環(huán)境具有很強的忍耐力，是松嫩草地的優(yōu)勢物種。羊草生長旺盛，草質(zhì)細嫩，具有較高的營養(yǎng)價值，草食牲畜喜食，是畜牧業(yè)的重要原料來源［1］。

放牧是松嫩草地草類資源利用的主要方式之一，放牧可導(dǎo)致植物特征發(fā)生變化，進一步改變土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落功能多樣性［2］。土壤微生物在保持土壤肥力，促進生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定方面起著重要作用［3］。Biolog-ECO法是通過微生物利用31種碳底物時氧化還原反應(yīng)的顏色變化情況來反映微生物碳源利用活性的方法［4-5］。本研究主要利用Biolog-ECO法分析放牧方式對松嫩草地羊草群落土壤微生物群落碳源利用的影響，為過度放牧導(dǎo)致土壤退化提供理論支持，進而為草原科學(xué)放牧提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地區(qū)概況

研究區(qū)域位于吉林省長嶺縣東北師范大學(xué)松嫩草地生態(tài)研究站(35°23.1'－ 35°34.1'N、123°30'20.5″－123°30'45.0″E)，海拔 137.8 ～144.8 m，屬于溫帶半干旱季風(fēng)氣候，年均氣溫4.6～6.4 ℃，無霜期 136～163 d。年降水量350～500 mm，多集中在6－9月，占全年降水量80%以上。土壤類型為堿化與鹽化草甸土，群落類型以羊草和雜類草群落為主，羊草群落占絕對優(yōu)勢，其次還分布著蘆葦(Phragmites australis)群落、虎尾草(Chloris virgata)群落、全葉馬蘭(Kalimeris integrifolia)群落、拂子茅(Calamagrostis epigeios)群落、堿茅(Puccinellia tenuiflora)群落、堿蓬(Suaeda auca)群落，形成鑲嵌分布格局。

1.2 試驗設(shè)計與牧草土壤樣品采集

在羊草群落樣地設(shè)置不放牧、輕牧和重牧3種放牧方式，每個處理設(shè)3個重復(fù)。放牧?xí)r間為每年5月10日－9月10日，每天放牧2 h。每塊樣地面積為150 m2。根據(jù)本研究站的研究數(shù)據(jù)［6］，放牧強度設(shè)置為不放牧、輕牧(4只羊·hm－2)、重牧(6只羊·hm－2)。

2012年的8月，在試驗地內(nèi)采集樣品，土樣的采集在樣地植物蓋度和均勻度最高時進行。樣方大小為1 m2，3次重復(fù)。用刻度尺測量樣方內(nèi)植物高度，然后齊地面刈割，裝入密封袋，數(shù)取其個數(shù)并稱量鮮物質(zhì)量，然后于70℃烘干至質(zhì)量恒定，稱量干物質(zhì)量。

土壤樣品取樣方式為“五點混合法”，土鉆直徑2 cm，取樣深度20 cm。剔除新鮮土樣中石礫及植物殘茬等雜物，5點混勻后，約取600 g裝入無菌樣品袋中，置于冰盒內(nèi)盡快帶回實驗室。過2 mm篩，將土樣分兩份，一份烘干用于理化性質(zhì)試驗，一份放入－20℃冰箱保存，用于Biolog試驗。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

使用pH計和電導(dǎo)率儀測定土壤pH值和土壤電導(dǎo)率，土壤含水量采用烘干法，有機質(zhì)含量用重鉻酸鉀容量法，銨態(tài)氮采用KCl浸提－靛酚藍比色法，土壤全氮含量用凱氏定氮法，土壤全磷含量采用鉬銻抗比色法［7］。

1.4 Biolog微生物測定

測定土壤含水率后，稱取相當(dāng)于5 g烘干土壤的新鮮土壤，用85%無菌NaCl按10倍稀釋法制成10－4的土壤稀釋液，每次轉(zhuǎn)移用振蕩器混勻(5 min，180 r·min－1)。稀釋液顏色較深時，可用1 500 r·min－1離心3 min。將土壤稀釋液導(dǎo)入樣品槽，用8頭移液槍從樣品槽中吸取150μL接種液，注入ECO微平板的每個微孔，確保每個微孔移入量相等，并避免土壤稀釋液濺入其他孔中［8-9］。將微平板放入恒溫培養(yǎng)箱，在25℃下培養(yǎng)10 d［10］，每天用 Biolog讀數(shù)儀讀數(shù)兩次，做土壤微生物平均吸光值隨時間變化曲線等數(shù)據(jù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

微孔板的顏色變化用單孔顏色平均值(Average Well Color Development，AWCD)來表示，小于0.06的值按0處理［11］。AWCD=Σ(C590－C750)/31，式中，C590為單孔在590 nm的吸光度值減去對照孔吸光度值;C750為單孔在750 nm的吸光度值減去對照孔吸光度值。

土壤微生物群落的多樣性和均勻度用以下指數(shù)來評價:

式中，Pi=(C590－C750)/Σ(C590－C750)，S為 ECO板中顏色變化孔的數(shù)目。

用拐點處的吸光度值進行主成分分析。數(shù)據(jù)處理軟件為Microsoft Excel 2003，方差分析軟件為SPSS 16.0，主成分分析軟件為 Canoco for Windows 4.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放牧強度下羊草群落特征變化

放牧強度對羊草群落特征的影響較大，各項指標(biāo)都有顯著差異(P＜0.05)(表1)。隨著放牧強度的增加植被高度顯著降低(P＜0.05);植被蓋度和地上生物量在不放牧和重度放牧下差異不顯著(P＞0.05)但均顯著低于輕度放牧下的;密度在重度放牧?xí)r最低;適度放牧方式下植被蓋度、密度和地上生物量都達到最高。

2.2 不同放牧強度土壤理化性質(zhì)變化

7個理化指標(biāo)中僅有機質(zhì)和pH值有顯著差異(P＜0.05)(表2)。銨態(tài)氮和有機質(zhì)含量在不放牧?xí)r最高，輕牧次之，重牧?xí)r最低。pH值重牧?xí)r最高，輕牧?xí)r次之，不放牧?xí)r最低。全氮、含水量、電導(dǎo)率和有效磷無顯著差異(P＞0.05)。

表1 不同放牧強度下植被特征Table 1 Changes of vegetation characteristics under different grazing intensities

表2 不同放牧強度下土壤理化性質(zhì)Table 2 Physicochemical properties of soil under different grazing intensities

2.3 土壤微生物的平均吸光值

每隔12 h測ECO板孔平均顏色變化(AWCD)值，用培養(yǎng)10 d所得的20個AWCD值做圖，隨培養(yǎng)時間的延長 AWCD值升高(圖1)。24 h之內(nèi)AWCD值無明顯變化，碳源基本未被利用;24 h之后AWCD值開始升高;72 h左右AWCD值急劇升高，進入指數(shù)期，說明碳源開始被大幅度利用;180 h左右AWCD值變化趨于平穩(wěn)。3個土壤樣品中，36－144 h，輕牧和重牧AWCD值增長趨勢相近;156 h至培養(yǎng)結(jié)束，輕牧AWCD高于重牧;不放牧AWCD一直維持較低水平。

2.4 土壤微生物對碳源的利用

Biolog-ECO微平板的31種碳源可分為碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類和胺類六大類。根據(jù)不同碳源的平均吸光度值隨時間的變化做曲線，樣地中利用多聚物的微生物占絕對優(yōu)勢，其次為利用胺類、氨基酸類和碳水化合物的微生物。碳水化合物類為輕牧＞重牧＞不放牧;氨基酸類為重牧高于輕牧和不放牧，輕牧和不放牧趨勢相近;羧酸類為不放牧前期較高，后期重牧較高;多聚物類為重牧＞輕牧＞不放牧;酚酸類為不放牧最高，輕牧和重牧趨于0。胺類為重牧高于輕牧高于不放牧(圖2)。

圖1 土壤微生物平均吸光值變化曲線Fig.1 Curve of AWCD change of soil microorganism

圖2 土壤微生物對不同碳源利用的變化曲線Fig.2 Curve of AWCD change of soil microorganism with different carbon sources

2.5 土壤微生物碳源利用多樣性指數(shù)分析

Shannon豐富度指數(shù)、Shannon均勻度指數(shù)和Gini多樣性指數(shù)用來測度土壤微生物群落多樣性的高低，是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。不放牧?xí)r，群落多樣性較高，說明不放牧可提高群落多樣性，其次為重牧和輕牧(圖3)。

圖3 土壤微生物碳源利用多樣性指數(shù)Fig.3 Diversity index of carbon source metabolism of soil microorganism

2.6 土壤生化指標(biāo)與微生物功能多樣性主成分分析

Canoco for Windows 4.5軟件對土壤生化指標(biāo)和土壤微生物拐點180 h吸光度數(shù)據(jù)做主成分分析，length＜3，選擇 RDA 分析［12］。根據(jù)蒙特卡羅檢驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第1軸可以解釋74.2%的變量，第2軸可以解釋25.8%的變量。沿第1軸方向放牧強度依次為輕牧、重牧、不放牧。銨態(tài)氮、全氮和有機質(zhì)與不放牧正相關(guān)，與重牧負相關(guān);pH值、電導(dǎo)率和含水量與重牧正相關(guān)，與不放牧呈負相關(guān);有效磷和銨態(tài)氮與輕牧負相關(guān)(圖4)。不放牧下，利用碳源種類較少，主要為代謝L-蘇氨酸、肝糖和γ-羥丁酸等碳源的微生物;輕牧下，土壤中主要為代謝 α-D-乳糖、N-乙?；?D-葡萄胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸等碳水化合物類碳源的微生物;重牧?xí)r，土壤中代謝吐溫40和L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸等氨基酸類碳源的微生物較多。

圖4 土壤微生物功能多樣性RDA分析Fig.4 RDA on the functionol diversity of edaphon

3 討論

放牧?xí)淖兡敛萆L特征。由于牧畜的啃食，隨著放牧強度的增大，牧草高度有降低的趨勢;重度放牧強度下由于牧草基本沒有休養(yǎng)生息的機會，導(dǎo)致各項指標(biāo)均處于較低水平;適度放牧?xí)r植被蓋度、密度和地上生物量都達到頂峰，說明適度放牧有利于牧草的再生繁殖。劉穎等［6，13］的研究表明，適度放牧?xí)黾幽敛萆a(chǎn)力，促進牧草再生，再生草量和再生速率最大，與本研究結(jié)果一致。以上幾種植被特征指標(biāo)的共同作用致使植物光合作用面積改變，進而通過提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)物質(zhì)間接影響土壤微生物的數(shù)量［6］。草食動物通過采食、踐踏及排泄活動影響植物的生理活動，進而通過根系分泌物影響土壤理化性質(zhì)和土壤微生物群落代謝功能多樣性［14-15］。土壤含水量、pH值、鹽度和化學(xué)組成等理化性質(zhì)也會改變土壤微生物種類及數(shù)量［16］。土壤微生物也會通過其代謝活動改變土壤理化性質(zhì)。因此，放牧強度、土壤理化性質(zhì)、植物和土壤微生物之間相互影響關(guān)系緊密。

理化性質(zhì)分析表明，在短期放牧條件下，放牧強度對土壤pH值和有機質(zhì)含量有影響，其他指標(biāo)差異不顯著(P＞0.05)。重牧情況下，植物生產(chǎn)力降低對土壤的影響大于羊排泄物對土壤的影響，導(dǎo)致土壤pH值升高有機質(zhì)含量降低，土壤肥力下降。對AWCD值隨時間變化曲線分析表明，適度放牧樣地土壤微生物群落代謝功能最強，不放牧樣地土壤微生物群落代謝功能最弱。放牧有利于土壤微生物代謝活動，適度放牧可使羊草生長加快［17］，根際分泌物使微生物可利用碳源增多［18］，牲畜糞便也會增加碳源來源［19］。張海芳等［20］的研究表明，圍封時土壤微生物群落代謝活性最高，自由放牧次之，刈割最低。對碳源利用率分析表明，樣地中利用多聚物的微生物較多，可能樣地土壤中含有較多的多聚物，這有待進一步試驗分析。

對多樣性指數(shù)分析表明，不放牧樣地土壤微生物種類豐富度和均勻度較高，因為不放牧樣地植物高度和蓋度均最高，根系分泌物的增多有利于土壤微生物的聚集與增殖，不放牧樣地的土壤理化性質(zhì)也更適于土壤微生物的生存。重牧樣地土壤微生物多樣性指數(shù)較輕牧稍高，但差異不顯著，說明短期放牧對土壤微生物豐富度和均勻度影響不大。高雪峰等［21］的研究顯示，輕度和適度放牧有利于土壤中微生物數(shù)量和種類的增加，與本研究結(jié)果相似。

RDA分析表明，不放牧樣地土壤微生物與銨態(tài)氮、全氮和有機質(zhì)關(guān)系密切，適度放牧樣地土壤微生物僅與含水量和電導(dǎo)率有些許關(guān)系，重度放牧樣地磷含量、pH值對土壤微生物起作用。輕牧樣地土壤微生物利用碳源較豐富，主要有α-D-乳糖、N-乙?；?D-葡萄胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸等，大多數(shù)碳源為碳水化合物類;重度放牧樣地土壤微生物主要利用吐溫40、L-精氨酸、甘氨酰-L-谷氨酸和 D-纖維二糖;不放牧樣地土壤微生物利用碳源種類最少。分析其原因:不同放牧強度影響植被生長和繁殖，牲畜排泄物和羊草根系分泌物共同形成土壤碳源差別，從而導(dǎo)致土壤微生物種類和數(shù)量上的差異。

綜合以上結(jié)果表明，適度放牧有利于土壤肥力的保持，植被的生長和土壤微生物種類與數(shù)量的增加。

4 結(jié)論

1)放牧強度顯著影響羊草草地植被特征，適度放牧方式下植被蓋度、密度和地上生物量都達到最高。適度放牧有利于草原植物的生長繁殖和生物量的積累。

2)短期放牧條件下隨著放牧強度的增大，土壤pH值增大有機質(zhì)含量降低。放牧強度對其他土壤理化性質(zhì)的影響不顯著。

3)短期放牧條件下，放牧強度對羊草群落土壤微生物群落多樣性影響不大。但不同放牧強度下，土壤微生物利用碳源種類出現(xiàn)較大差別，說明放牧強度會顯著改變土壤碳源類別。

4)輕牧方式下，土壤微生物群落代謝功能最強;不放牧方式下，土壤微生物群落代謝功能最弱，代謝最慢。適度放牧可促進微生物的生長與繁殖，提高其代謝活性，更利于該地區(qū)生態(tài)環(huán)境的均衡發(fā)展。

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