應(yīng)用ISSR 技術(shù)鑒定杭白菊對(duì)葉斑病的抗性

郭慶海， 李丹霞， 王康才， 薛友榮， 周雪松， 陳志祥

(1.江蘇省濱?？h植保植檢所，江蘇 濱海224500;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京210095;3.江蘇省濱海縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 濱海224500;4.江蘇省射陽縣盛大藥材有限公司，江蘇 鹽城224300)

杭菊花是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兼用藥用植物，隨著人們生活水平提高，保健意識(shí)加強(qiáng)，其市場(chǎng)需求逐年增加，種植面積也隨之?dāng)U大，但在老產(chǎn)區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，由于連作，菊花病害尤其是菊花葉斑病等病害成為限制農(nóng)民增產(chǎn)增收的障礙［1］。病害的判斷診治主要靠常規(guī)手段，用分子手段進(jìn)行病害的鑒定分類則較少，張欣［2］應(yīng)用RAPD 技術(shù)區(qū)別芒果抗炭疽病品種，李海生［3］利用ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了植物遺傳多樣性的分析應(yīng)用，高山等以ITS1 和ITS4 為 引 物擴(kuò)增病原菌的ITS 片段，對(duì)葉斑病進(jìn)行分子鑒定［4］。張正光等進(jìn)行ITS 序列分析確定了根腐病的病原菌［5］。ISSR 簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間(Inter-simple sequence repeat，ISSR )是一種基于微衛(wèi)星(Simple sequence repeat，SSR)序列發(fā)展起來的、利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)的、十分有效的分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛應(yīng)用于植物遺傳關(guān)系及遺傳多樣性、品種鑒定、系統(tǒng)演化等方面研究。作為一種新型的分子標(biāo)記，ISSR 標(biāo)記結(jié)合了RAPD 和SSR 的優(yōu)點(diǎn)，具有模版需要量少，多態(tài)性豐富，無需試劑盒，結(jié)果記錄方便，試驗(yàn)成本低，操作簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性較高等優(yōu)點(diǎn)，但目前未見利用ISSR 技術(shù)鑒別菊花抗葉斑病品種的相關(guān)報(bào)道。為此，本試驗(yàn)采用ISSR 技術(shù)對(duì)20 個(gè)杭白菊材料(其中10 個(gè)材料為抗病材料)的抗病性育成品種的早期確定、抗病品種的鑒定及抗病機(jī)理等進(jìn)行研究，以期為菊花抗葉斑病品種篩選、品種鑒定提供一種有效的輔助手段。

1 材料與方法

1.1 材料

20 種材料采自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地，均為江蘇省濱?？h植保植檢所菊花課題組前期選育，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材系王康才教授鑒定。品種名、田間抗性見表1。試驗(yàn)材料包括杭白菊的2個(gè)品系新白品系(新白)和紅心品系(其他19 個(gè)品種)，其中新×香、紅心11×香菊和紅心11×菊花腦3個(gè)材料為雜交材料。

1.2 方法

采用改良的CTAB 法提取菊花基因組DNA［6］，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量和濃度，稀釋至50 ng/μl。ISSR-PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μl，其中包括200.0 μmol/L dNTP、0.5 μmol/L primer、10×PCR buffer、50 ng DNA template、1.5 U DNA polymerase、無菌水。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD 公司MJ Mini 48 孔梯度PCR 儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，45 ～55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，39 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴(kuò)增后每管加入6×溴酚藍(lán)1 μl，混勻后取10 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠中含有1% 的4S Green。電泳緩沖液為1×TAE，電壓5 V/cm。在上海培青科技有限公司生產(chǎn)的JS-380 型凝膠成像系統(tǒng)上觀測(cè)并照相。

表1 試驗(yàn)材料及其田間抗性Table 1 Accessions used in the study and their field resistance

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在凝膠的某個(gè)相同遷移位置上有DNA 條帶的記為1，無DNA 條帶的記為0，采用POPGENE32 軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)、平均有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles，Ne)、Nei’s 基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity，He)和 Shannon 信 息 多 樣 性 指 數(shù)(Shannon’s information index，I);用DPS 分析軟件的非加權(quán)配對(duì)類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA 提取、引物篩選及多態(tài)性分析

提取并純化材料DNA，瓊脂糖凝膠電泳確定DNA。

利用3 個(gè)表型差異大的材料對(duì)100 條ISSR 引物進(jìn)行篩選，確定23 條帶型清晰、多態(tài)性較好的引物對(duì)20 個(gè)試驗(yàn)材料進(jìn)行多態(tài)性分析。淘汰擴(kuò)增效果差、帶型模糊、對(duì)個(gè)別材料擴(kuò)增不出條帶的引物，最終篩選出10 條引物用于20 份材料的遺傳分析。共擴(kuò)增出168 條清晰可辨譜帶，其中多態(tài)性帶135條;平均多態(tài)位點(diǎn)百分率為80.36%，多態(tài)性較高。擴(kuò)增條帶集中在200 ～2 000 bp(表2)。如表2 所示在綜合比較各引物擴(kuò)增效果后發(fā)現(xiàn)165 號(hào)引物多態(tài)性條帶百分率達(dá)100.00%，故選取165 號(hào)引物作為最理想的引物。圖1 為ISSR 引物165 的擴(kuò)增結(jié)果。

表2 有效ISSR 引物序列及其多態(tài)性Table 2 Efficient ISSR primer sequences and their polymorphisms

圖1 ISSR 引物165 對(duì)供試材料的PCR 擴(kuò)增圖譜Fig.1 PCR amplified pattern of Dendranthema morifolium with ISSR 165

2.2 20 個(gè)菊花品種ISSR 遺產(chǎn)多樣性分析

平均有效等位基因數(shù)(Ne)和Nei’s 基因多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity，He)是衡量遺傳變異最常用的2 個(gè)遺傳指標(biāo)，具有明顯的遺傳學(xué)意義［6］。Shannon 信息指數(shù)方便與同類研究進(jìn)行比較［7］。利用軟件包POPGENE32 對(duì)各位點(diǎn)的Ne、He以及Shannon 信息指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果顯示，20 個(gè)品種平均有效等位基因數(shù)為1.549 1，平均Nei’s 基因多樣性 指 數(shù) 為0.312 9，平 均 Shannon 信 息 指 數(shù)為0.458 8。本研究擴(kuò)增的ISSR 片段多態(tài)性較高，說明在進(jìn)化過程中，菊花栽培品種在DNA 分子水平上形成并保持了較高的遺傳變異，還可能與菊花品種存在自交不親和性［8-9］及無性繁殖有關(guān)。

2.3 菊花對(duì)葉斑病抗性與其ISSR 聚類組的相關(guān)性分析

由圖2 可以看出，以遺傳距離為0.38 處劃分，20 個(gè)菊花品種聚類為3 個(gè)ISSR 組:第1 組包括大花2 號(hào)、大花4 號(hào)、優(yōu)單4 號(hào)、優(yōu)單6 號(hào)、紅心9 號(hào)、紅心13 號(hào)、紅心19 號(hào)、紅心1 號(hào)、紅心20 號(hào)、單瓣2號(hào)，這一組均是高感、中感品種;第2 組包括NJK1、NJK2、NJK3、似貢3 號(hào)、紅心11 號(hào)、新×香、紅心11×香、紅心11×腦、NJK4，具有抗葉斑病的品種都聚在這一類;第3 組只有一個(gè)品種，是新白。

圖2 20 個(gè)菊花品種ISSR 標(biāo)記的UPGMA 聚類圖Fig.2 Dendrogram of 20 Dendranthema morifolium cultivars based on ISSR markers by UPGMA

對(duì)20 種菊花材料運(yùn)用POPGENE 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果(表3)顯示，在20 種菊花材料中，H最大值為0.498 7，最小值為0.05;I最大值為0.693 1，最小值為0.119 3。這些結(jié)果顯示出試驗(yàn)材料存在著豐富的遺傳變異，推測(cè)與菊花長(zhǎng)期的自然雜交、自然選擇和人工選育造成的復(fù)雜的遺傳背景有關(guān)，這說明菊花具有極其豐富品種的分子基礎(chǔ)。在分成2 個(gè)類群的基礎(chǔ)上，比較抗性材料與感病材料可知:抗性材料的Ne、H及I值均高于感病材料，說明抗性材料之間比易感病材料之間基因差異顯著，抗性材料的遺傳多樣性比感病材料高。

表3 POPGENE 軟件分析結(jié)果Table 3 The results analyzed by POPGENE software

從ISSR 標(biāo)記聚類結(jié)果來看，聚類結(jié)果與杭菊花對(duì)葉斑病的田間抗性有明顯的相關(guān)性，基本能夠區(qū)分抗性品種和易感品種。

3 討論

從ISSR 標(biāo)記聚類結(jié)果來看，聚類結(jié)果與菊花對(duì)葉斑病的田間抗性有明顯的相關(guān)性。所有抗性材料除了新白全部聚為抗葉斑病品種，除此之外，3 個(gè)雜交品種也聚到這一大組中，這個(gè)結(jié)果也說明了雜交技術(shù)在培育抗病新品種中的優(yōu)勢(shì)［10］，而所有易感病材料聚為高感、中感品種。新白是另一個(gè)品系的品種，在這里單獨(dú)聚為一類。

對(duì)易感和具有抗性的2 組試驗(yàn)材料統(tǒng)計(jì)的結(jié)果顯示，抗性材料的平均有效等位基因數(shù)、平均Nei’s基因多樣性指數(shù)及Shannon 信息指數(shù)均高于感病材料，表明抗性材料的遺傳多樣性比感病材料高?？赡苁且?yàn)榭剐缘倪z傳多樣性豐富，包括的抗病基因相對(duì)感病組較多，所以具有抗病性，其具體抗病基因位點(diǎn)仍需要繼續(xù)研究。本研究因時(shí)間和條件限制僅應(yīng)用ISSR 技術(shù)對(duì)菊花抗葉斑病進(jìn)行鑒定，是否可以應(yīng)用ISSR 技術(shù)鑒定菊花甚至其他植物的其他病害仍需繼續(xù)研究。

ISSR 標(biāo)記聚類結(jié)果表明，利用ISSR 技術(shù)可以鑒定菊花是否抗葉斑病，該技術(shù)可以作為早期篩選抗葉斑病品種的輔助手段。

［1］ 陳長(zhǎng)軍，劉德輝，王康才.江蘇省藥用菊花病害普查［R］.沈陽:第六屆中國(guó)植物病害化學(xué)防治學(xué)術(shù)研討會(huì)，2008.

［2］ 張 欣.應(yīng)用RAPD 技術(shù)區(qū)別芒果抗炭疽病品種的研究［J］.中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，13(4):20-21.

［3］ 李海生.ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)及其在植物遺傳多樣性分析中的應(yīng)用［J］.生物學(xué)通報(bào)，2004，39(2):19-20.

［4］ 高 山，王孟飛，胡 平，等.基于ITS 序列對(duì)萬壽菊葉斑病病原菌的分子鑒定［J］.湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)，2013，52(9):2074-2076.

［5］ 張正光，郭成寶，王源超，等.非洲菊根腐病病原的鑒定與ITS序列分析［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2005，35(5):392-396.

［6］ 肖 軍，楊立國(guó)，楊 濤，等.兩種提取菊花總DNA 方法的比較［J］.遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005(1):40-41.

［7］ 繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波.85 個(gè)大菊品種遺傳關(guān)系的ISSR 分析［J］.園藝學(xué)報(bào)，2007，34(5):1243-1248.

［8］ 黃建安，李家賢，黃意歡，等.茶樹品種資源遺傳多樣性的AFLP 研究［J］.園藝學(xué)報(bào)，2006，33(2):317-322.

［9］ DREWLOW L W，ASCHER P D，WIDMER R E.Rapid method of determining pollen incompatibility inChrysanthemum morifoliumRamat.［J］.Euphytica，1975，24(1):29-32.

［10］ GRONALD W，ASCHER P D.Effects of high temperature treatments on seed yield and self incompatibility inChrysanthemum［J］.Euphytica，1975，24(2):317-322.